文摘
动基体是一家专业的线粒体的trypanosomatids港口在自然界发现的最复杂的和不寻常的线粒体DNA。动基体DNA (kDNA)是由成千上万的环状分子拓扑连结形成一个网络。存在两种类型的DNA圈动基体:minicircles (0.5 -10 kb), maxicircles (20 - 40 kb)。动基体的知识架构是至关重要的理解kDNA圈的复制和隔离,因为这些过程所涉及的分子正是整个动基体定位在功能域。动基体的精细结构揭示了早期电子显微镜(EM)的研究。然而,了解kDNA只是证明后的拓扑组织协议的发展从核DNA分离kDNA,紧随其后的是观察。trypanosomatids薄片、电镜分析孤立kDNA网络传播到EM网格,深腐蚀研究,细胞化学的和采用的技术方法的例子有助于阐明动基体的结构和复制。最近,原子力显微镜已加入这组kDNA网络技术和提高我们的知识和发现新的细节kDNA trypanosomatids拓扑。
1。介绍
动体目动基体是一个诊断结构的顺序,包括锥虫科家族。这个家庭有鞭毛的原生动物的几个属的物种(包括短膜虫属,Angomonas,Strigomonas,锥虫属,利什曼虫和其他人)。一些trypanosomatids引起热带利什曼病等人类疾病,恰加斯病,和非洲昏睡病(1]。Kinetoplastids还包括biflagellate游离的原生动物亚目Bodonina [2,3]。由于医疗trypanosomatids的重要性,他们都进行了广泛的调查,我们的大多数知识动基体来自这个群体。
存在的第一个证据动基体后是在一个世纪之前的发现嗜碱颗粒附近锥体虫的鞭毛的基础。然而,只有在透射电子显微镜(TEM)的出现有可能理解动基体的结构和性质(4,5]。trypanosomatids是一家专业的动基体地区港口的线粒体在自然界发现的最复杂的和不寻常的线粒体DNA(图1)。这个结构位于鞭毛基体附近,和kinetoplast-flagellum相对于原子核的位置是一个重要的特性分类的不同生命周期阶段原生动物(6]。动基体的DNA,或者只是kDNA,约占总数的30%细胞DNA,由成千上万的环状分子,拓扑连结形成一个网络。两种类型的DNA环动基体中腔:minicircles通常范围从0.5到10 kb(取决于物种)和maxicircles不同大小从20到40 kb (7,8]。Maxicircles出现在一些相同的副本/网络和类似于高等真核生物的线粒体DNA;他们呼吸链的编码核糖体rna和蛋白质。Minicircles存在在很多副本/网络异构的核苷酸序列,和编码指南RNA, RNA编辑过程中使用。这个过程包括添加或删除uridylated残留maxicircle成绩单的形式功能rna (9]。
kDNA的复制是一个复杂的机制,涉及蛋白质和高潮的曲目minicircles的隔离和maxicircles子细胞。准确的隔离防止损失基本minicircles,没有maxicircles的版本无法发生,细胞将失去生存能力10]。kDNA合成涉及释放单个minicircles从网络拓扑异构酶II酶,其次是复制的免费个人圈子。Minicircle复制起始的守恒的起源序列受普遍Minicircle sequence-binding蛋白质(UMSBP)。Abu-Elneel等人证明了这些蛋白质位于两个相邻站点附近的脸kDNA磁盘接近细胞鞭毛(11,12]。这之后,复制minicircles搬到旁边的两个对映网站kDNA磁盘,大多数但并非所有的引物都删除,冈崎片段之间的差距是修好。Minicircles包含至少一个缺口然后重新连接到网络的拓扑异构酶II映网站,最后填缝密封发生,之前网络切断和隔离12]。相比之下,maxicircles期间保持连接到网络的复制机制涉及滚动循环中间体(13]。动基体的架构是至关重要的复制和隔离kDNA圈子,因为分子参与这些过程正是定位在功能域整个动基体(图2)。kinetoflagellar区和映网站领域参与的早期和晚期步骤kDNA复制,分别。此外,三方附件复杂(TAC),它连接kDNA基体,调节动基体隔离后kDNA复制(14,15]。关于kDNA复制的更多细节,我们感兴趣的读者参考优秀的团体发表的评论的夏皮罗和英格伦,詹森和英格伦,刘et al ., Klingbeil和英格伦(7,8,16,17]。
最近透射电子显微镜和原子力显微镜(AFM)是强大的工具,揭示动基体结构、拓扑kDNA组织,复制和隔离kDNA trypanosomatids。在本文中,我们报告各种显微技术,有助于解开kDNA的有趣的结构,考虑使用TEM的初步研究,直到使用原子力显微镜的最新进展。
2。在薄片的可视化动基体
薄片的观察resin-embedded样本使trypanosomatids的细胞成分的调查,包括动基体。利用TEM、迈耶和同事(4)作为证明动基体(最初称为动核)与基体分离,鞭毛的出现。迈耶和他的同事描述了动基体vacuole-like空间包含一个电子致密物质,目前已知kDNA。此外,这种“泡”直接延续的大型运河系统中观察到的细胞质中锥体虫,在一些展览准备被描述为典型的层状结构在组织细胞线粒体4,18]。迈耶和同事描述当时已经证实了波林(19]。使用串行thick-sectioning技术结合电子显微镜(EM),波林在trypanosomatids演示了一个独特的和高度分歧的线粒体,动基体是这个结构的一部分。
横向部分的观察动基体在不同trypanosomatids透露,这种结构的双膜包围线粒体的嵴偶尔可以看到投射到腔。内腔,kDNA被组织为一个密集的质量DNA,这始终是位于垂直于纵轴的鞭毛。此外,kDNA链是一致的与网络的轴线平行。EM Ogbadoyi和同事获得的图像(14)是用于描述的细丝连接动基体的基体鞭毛。这些组件包括一个复杂的结构,被命名为三方依恋。动基体和基体之间的物理联系已经证明了Souto-Padron et al。20.),将在下一节中讨论。这两个结构之间的物理连接的存在解释了早期的光学显微镜观察显示它们之间的密切关系。
动基体在不同大小和物种间kDNA安排。例如,在锥虫属brucei,整个动基体表现为略凹磁盘约0.6μ0.1米直径μ米厚。在epimastigotes鲁兹锥体磁盘的直径1μm和0.1的厚度μm。kDNA安排trypanosomatid物种的差异EM(下清晰可见5]。在大多数原生动物,kDNA紧密成盘状结构(数据3(一个)和4(一))。然而,在物种,港内共生细菌,动基体提出了一种梯形或拱形结构完全注满松散kDNA链(数字3 (b)和3 (c))[21]。trypomastigote的动基体t . cruzi球状,存在两种类型的拓扑结构:一个包含定义良好的多层膜,另组成的不规则排列不识别层(数据吗4 (b)和4 (c))[22]。
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3所示。动基体的三维视角揭示了深蚀刻
kDNA细丝可以观察获得的三维视图的复制品速冻、冷冻断裂,深深铭刻trypanosomatids。在这个方法中,样品暴露在快速冷冻固定,防止kDNA纤维的收缩和再分配。深腐蚀技术被应用到t . cruzi在1980年代早期,使kDNA组织原位观察。的深腐蚀图像Souto-Padron et al。20.)透露,kDNA细丝在动基体内的致密包包装t . cruziepimastigote和细丝直径大约11 nm连接kDNA基体(图5(一个))。在那之前,没有以前的超微结构的研究证明了这两个结构之间的结构联系,尽管知道动基体和鞭毛一直在隔离(23]。深腐蚀分析也提供了一个三维视图的动基体endosymbiont-bearing trypanosomatidAngomonas deanei卡瓦尔康蒂等人提出的。24]。这项技术显示,原生动物的典型kDNA网络由DNA细丝less-condensed的方式安排的t . cruzikDNA并占领整个动基体矩阵(图5 (b))。这个物种还提出了丝状结构连接kDNA基体,这可能对应于TAC的细丝。此外,深腐蚀图像的答:deanei显示整个kDNA球状结构网络的存在可能对应的蛋白质参与kDNA压实(图5 (b)箭头)。
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尽管薄片的观察和深腐蚀副本动基体的研究,取得了重要贡献的高度复杂的组织kDNA网络之后才可以更好地理解其隔离和观察,最初在TEM下,并使用AFM最近。
4所示。调查动基体DNA的拓扑:早期观察电磁网格
更好的理解的拓扑组织kDNA是可能的,由于开发协议分离kDNA使用密度梯度离心法从核DNA技术。几项研究发表在1960年代和1970年代特征kDNA分子分离利什曼虫enriettii(25),t . cruzi(26,27),锥虫属大型(28),利什曼虫tarentolae(29日,30.),短膜虫属物种(31日),短膜虫属下方(32),和其他trypanosomatids。这些研究促进了知识,我们今天kDNA非凡的分子构型。孤立的电磁分析kDNA传播与金属微观网格和跟踪显示的主要结构部件kDNA是圆形轮廓长度不同的物种间的分子。例如,在t . cruzi,圈是0.45μ米长,对应1440个碱基对,分子量为0.94×106道尔顿(27]。圆的轮廓长度l . tarentolae,t .兆,c .下方是0.29,0.74,和0.8吗μ米,分别28,29日,32]。辛普森和Da Silva (29日]提出的直径minicircle对应的宽度动基体中观察到resin-embedded细胞的薄片。因此,动基体超微结构的大小将取决于minicircle由单一minicircle层在大多数trypanosomatids研究。
虽然长的线性DNA反复观察孤立kDNA EM显微图的t . cruzi和利什曼虫,第二个结构元素的存在的确凿证据kDNA网络只是通过Steinert和Assel33]。电子显微镜分析kDNA隔绝短膜虫属luciliae和限制性内切核酸酶消化分析识别了大于minicircles kDNA分子,而这些分子长链被称为“maxicircles”[33,34]。根据结果与特定的内切酶治疗kDNA网络后,Kleisen和同事(34]证明了maxicircles是一个常数和完整的网络的有效组成部分c . luciliae和3 - 5%的质量kDNA结构。此外,作者建议maxicircles相当于其他生物体的线粒体DNA。
孤立kDNA网络是一个平面结构包含成千上万的minicircles和数十名maxicircles联锁(图在一个不同寻常的安排6)。minicircles花结的形式组织,有DNA循环辐射的中心。花结是连接到另一个包的灯丝。maxicircles,另一方面,形成独立的索烃在kDNA网络链接到另一个的索烃中minicircles [35]。
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因为kDNA网络直径与整个单元的一种有效机制kDNA凝结必须存在,这样网络符合线粒体内腔。小,高度基本kinetoplast-associated蛋白质(kap)包装和组织候选人kDNA [36,37]。
最近,kDNA的拓扑组织是由我们组重新使用AFM。利用AFM研究的挑战和优势kDNA将在下一节中讨论。
5。原子力显微镜作为一种工具来研究DNA动基体组织:优势和挑战
AFM的出现在1986年开放了一个激动人心的角度研究生物标本(38]。AFM有几个特点,使它对生物学家的吸引力:它涵盖了范围广泛的决议(从海里μ米);它可以用于成像在大气压力;和样品制备的AFM图像通常是非常快和简单,不需要染色,阴影,标签,或其他程序可以创建工件材料。此外,AFM在新兴市场的一个重要优点是它能够测量高度,因此获得地形图等细胞和纳米样品的蛋白质和核酸。早期的相关出版物使用AFM观察DNA的结构包括成像单-和双链DNA / RNA分子(39- - - - - -41),线性和环状DNA (42,43),放松和超螺旋质粒(44,45),kDNA trypanosomatid的网络c .下方(46]。kDNA样本的准备AFM分析最初是一个重大的挑战,因为成千上万的联锁DNA分子必须完全分散在一个表面上被观察到。此外,由于AFM使用探针扫描表面,大kDNA网络必须牢牢地附着在基板上,这样样品不会拖的小费。先验知识与固定线性DNA和质粒样品处理kDNA AFM是有用的。然而,所述方法为AFM观察干燥的小DNA分子与kDNA网络没有成功,我们将在下面进行讨论。
第一个研究核酸准备AFM分析关注的是获得可靠的和可再生的协议这些分子吸附在衬底没有改变他们的结构。满意的结果DNA-cytochrome C共聚物时沉积在碳涂层的过程类似于云母用于传播DNA在显微镜网格44,47]。云母的化学修改增加DNA的绑定到基板也被使用,以及cation-assisted程序。这些cation-assisted过程包括预处理云母表面与二价阳离子或直接使用二价阳离子(如镁)的DNA溶液沉淀之前样品到云母。后者技术广泛使用的是由于它的简单性和再现性。在这两种情况下,人们相信阳离子之间充当桥梁带负电荷的云母和带负电荷的DNA (48,49]。镁的添加kDNA解决方案,其次是吸附样品的云母和清洗步骤去除多余的缓冲盐,是成功地获得高分辨率的AFM图像trypanosomatids,据卡瓦尔康蒂et al。50]。
除了固定的材料表面,干燥样品也准备AFM生物标本的关键一步。干燥过程可以大大改变DNA的物理性质,如分子的高度和直径。的高度和直径kDNA样品提交和氮气流或真空干燥室大比样品使用临界点干燥技术。例如,kDNA分子的直径大约是40岁,33岁和16 nm以下样品干燥真空氮气流,分别和临界点干燥(CPD)。此外,前两个协议促进了kDNA链的聚结和破损kDNA分子位于网络的边缘(数字7(一)和7 (b)),因为干燥的力量压缩kDNA的链49]。为了克服这个问题,CPD,广泛用于高含水生物材料准备扫描电镜,是我们准备AFM kDNA网络的首选方法。在这种技术中,样品在溶剂如乙醇和脱水后溶剂被液态二氧化碳的压力室CPD设备。当温度和压力超过所谓的临界点的二氧化碳(31°C和74条),小心地减少压力和示例删除一次大气压力。因此,样品没有穿过干气阶段边界,可具扭曲生物标本。kDNA网络的高分辨率图像获得使用CPD技术,这使得它可以检查详细的DNA链(图7 (c))。
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原子力显微镜用于观察等trypanosomatids kDNA拓扑c .下方(50),答:deanei,Strigomonas culicis(21),而t . cruzi(22]。所有的物种表现出类似大小的kDNA(表1)和出现完整和大规模网络与高浓度的DNA纤维分布在整个结构。集群的DNA分子形成圆花饰沿着网络被发现在所有的trypanosomatids研究(图8)。每个玫瑰结的中心似乎是连接到其他玫瑰通过包结的细丝,组织的复杂结构kDNA网络(图8箭头)。AFM分析提供的新信息与电子显微镜研究有关kDNA高度的测量在不同站点网络。高程测量允许我们计算数量的重叠的圆圈kDNA网络中各点,尤其是在网站rosette-like结构形成。例如,在c .下方,单个kDNA分子的高度是0.5海里。然而,当整个网络进行了分析,kDNA多样的高度从0.5到10.5 nm。最高的点对应的网站几个kDNA分子相交,形成每个玫瑰的节点。这个高度变化表明,花结组成20分子kDNA收敛和跨越。有趣的是指出,中间的网络,高度变化从0.5到3.5 nm在外围,它变化从0.5到10.5纳米。这些数据表明,在网络的边缘有一个花结更多的DNA分子叠加比中部地区(50]。当kDNA网络中得到了相似的结果答:deanei和美国culicis分析了(21]。
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观察的数据表1,我们注意kDNA隔绝不同trypanosomatids展出一个非常类似的组织和尺寸(图模式8)。然而,这些网络占领动基体不同的形状和尺寸。这些数据表明,kDNA密集排列的纤维的三维结构中动基体是一个事件驱动的空间条件引起的,而不是截然不同的二元的结构组织kDNA trypanosomatids之间的分子。此外,kDNA许多蛋白质之间的相互作用也必须有助于保持其组织超微结构。
最近,AFM是用来调查kDNA的安排在不同的生命周期阶段t . cruzi恰加斯病引起的原生动物。在它的生命周期,这种寄生虫经历重大变化的动基体形貌和kDNA拓扑传递的epimastigote复制的阶段的昆虫向量metacyclic trypomastigote形式,在这一过程称为感染人类,metacyclogenesis。epimastigote的比较分析和trypomastigote kDNA拓扑的有趣的差异。而在epimastigote kDNA纤维均匀分布在网络,trypomastigote大量网站含有更高浓度的kDNA观察纤维(图9箭头)。DNA的浓度高的地区,提出了更高的高度,表明分子聚集在这些网站。这个结果表明kDNA分化期间经历compactation epimastigote trypomastigote和可以解释网络中观察到的较小规模trypomastigote(表1)。的生物学意义分化期间kDNA拓扑的变化t . cruzi不是完全理解,但可能是由于广义基因表达机制镇压的动基体DNA (22]。重要的是要强调metacyclogenesis适应性分化,使t . cruzi在不同环境中生存。在分化过程中,寄生虫呈现不同的形式,结果导致形态的基因表达的变化,超微结构、代谢和生理的修改。
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原子力显微镜已成功应用不仅评估kDNA结构,而且调查kDNA拓扑的变化由药物引起的。据报道,kDNA化疗构成一个有效的目标,因为它是强烈影响dna结合蛋白药物,插层剂,与拓扑异构酶抑制剂,会干扰以其独特的结构和复制。我们小组分析了吖啶黄的影响,置入一个药物,和berenil小沟粘合剂,在t . cruzikDNA网络使用AFM [51,52]。我们的研究结果揭示了这些药物如何影响kDNA组织,导致寄生虫死亡。使用AFM分析化合物的效果影响kDNA网络的优势容易准备的材料,没有污渍,阴影,标签,或其他程序,可以引入构件示例,掩盖药物的效果。吖啶黄的作用的研究t . cruzi是一个成功的例子使用AFM提高了解这种药物会影响kDNA。当用于低浓度、吖啶黄引起的释放kDNA圈的外围kDNA网络。然而,当用于更高的浓度,网络凸起的药品推广脱离,导致kDNA碎片和diskynetoplasty早期EM中描述的现象分析(51]。使用AFM允许一个详细的监测发布的圈子从网络的初始阶段吖啶黄行动直到网络的总拆除由药物引起的。
综上所述,本文提供的数据表明,AFM分析是一个很好的工具kDNA网络由药物引起的破坏,以及评估kDNA网络的拓扑结构,补充电子显微镜的研究。此外,新应用程序可以执行AFM获得成像在液体或使用AFM研究蛋白质之间的相互作用与特定地区minicircles maxicircles。
6。结论
原子力显微镜已成功应用于研究核酸的结构,DNA蛋白质相互作用,破坏DNA结构由药物或辐射引起的。近年来,AFM一直用于研究kDNA拓扑和药物trypanosomatids的动基体的影响。EM技术和AFM的结合可以提高我们的知识关于动基体和揭示新的kDNA耐人寻味的细节结构。
缩写
| AFM: | 原子力显微镜 |
| 新兴市场: | 电子显微镜 |
| kDNA: | 动基体DNA |
| TAC: | 三方附件复杂 |
| 透射电镜: | 透射电子显微镜。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。
确认
这次调查获得金融支持慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq) Financiadora de Estudos e Projetos (Finep)和Fundacao卡洛斯恰加斯球场德帕罗尽管带动做里约热内卢(FAPERJ)。作者感谢Daniela里昂Goncalves,发挥着重要作用。在过去几年中获得AFM图像。手稿的文学质量检查由美国手稿编辑。