文摘
背景。技术进步不断提供先进的工具,提高诊断能力的进步。胃肠道间质瘤属于一个家庭的间质肿瘤病人进行分流仍然是基于传统的标准如有丝分裂数、肿瘤大小和肿瘤的位置。限制人类的眼睛和随机性的选择区域有丝分裂图计算迫使我们寻求更客观的解决方案,比如数字图像分析。目前,增殖活动的标签在许多癌症正在成为一个日常任务。本研究的目的是比较传统的预测方法基于与数字图像分析的细胞有丝分裂率随周期变动的蛋白质。方法。57例入学的资格。此外,先前的数字分析整个组织切片进行免疫组织化学分析被执行死刑。数字标签覆盖热点和not-hotspots一视同仁。结果。我们注意到一个明显的增殖活动的多样性,因此,研究结果指出ki - 67的6.5%,计入热点地区,作为low-high-grade依据最优截止。ROC分析(AUC = 0.913;95%置信区间:0.828—-0.997, )和比值比(或= 40.0,95% CI: 6.7—-237.3, )指出,ki - 67 16%的截止非常高档(5 - 6组)例。肿瘤数字地图的帮助下,我们发现可能的错误造成的错误的选择的领域进行分析。我们证实,ki - 67分数符合细胞内新陈代谢的水平,可以作为额外的生物标志物。结论。肿瘤数字掩盖了很有前途的解决方案可重复的和客观的标签。软件调整核形状、轮廓、大小等对省略其他ki - 67阳性细胞尤其是小淋巴细胞。我们的结果指出ki - 67作为一名优秀的生物标志物在要点,但同时,我们指出显著差异在使用数字方法可能导致明确的结果。
1。背景
科技进步不断提供先进的工具,提高诊断能力,虽然许多间叶细胞肿瘤包括subcategorisation胃肠道间质瘤(总结)仍然是基于有丝分裂计数(MC)。根据目前当天艳阳高照分类和欧洲医学肿瘤学会(ESMO)指南,而事实上概括当天艳阳高照的原则,MC是肿瘤相关的关键十字划分一个低收入或高危复发组(1,2]。任意分界点在5有丝分裂/ 50高通滤波器(根据2014年更新ESMO, 5毫米2在临界情况下)可能是有风险的,有可能导致低估。传统的显微镜分析自然技术限制。毫无疑问它不允许我们区分领域以更大的有丝分裂活动呈现为分析区域是随机的。这些限制人类的眼睛和限制的视野显微镜镜头能有更多的可重复的和高效的工具,如数字图像分析。随着时间的推移,与ki - 67增殖活动的标签已成为一个重要的生物标志物。目前,这是生动地显现在乳腺癌,神经内分泌肿瘤(网),或脑部肿瘤,它变成了一个黄金标准测试非常有影响力的肿瘤分级和逐渐取代MC (3- - - - - -7]。可能是说,MC的时间已经逐渐取代了更有效的生物标志物。ki - 67实现预测鼓励许多研究人员研究在其他恶性肿瘤诊断中的应用。一个巨大的恶性肿瘤已检查,值得注意的是,他们中的大多数证实其预后价值(8- - - - - -14]。ki - 67后获得了一个新形象Cuylen等人的研究。他们描述的独特作用,蛋白质在细胞cycle-namely surfactant-like函数使染色体分离和定量增强在细胞周期(15]。不仅给计算的基础强免疫组织化学反应还弱的人。另一方面,报道差异在免疫组织化学ki - 67对应正确的肿瘤分类和计数方法创建新的问题(16- - - - - -18]。基本上,它意味着实现分数部分依赖于抗体克隆或制造商,和假设的阈值,结果可能导致不同的分类。看来,我们需要一个数码的支持;没有空间随机和不可重复的评估。下一个同样重要的问题是肿瘤异质性的变量景观存在的热点地区和许多ki - 67计数方法使研究者之间的断裂。显然,这可能会导致从实现截止预测值的变化和可能出现的缺乏标准化,客观、测量和控制的方法(18- - - - - -23]。专注于非均质性的新方法特别是在热点的背景下存在的意义反映了最活跃的细胞克隆肿瘤(24,25]。就业的客观分析方法可能有助于避免主观的病理学家的判断。
2。客观的
本研究的目的是肿瘤数字地图估计ki - 67和其他细胞随周期变动的蛋白质预测生物标记要点。整体滑动扫描和数字分析与详细的数学计算计划显示瘤内增殖活动的异质性。
3所示。方法
这项研究是一个自然的延续先前发表的研究意义和GLUT-1的实用性,CD9和CD63要点。入选标准以前详细描述(26]。没有选择偏见。这一次,我们汇集了57个受试者资格申请入学。按照我们之前的结果,当天艳阳高照,也2012 ESMO指南应用1,2]。所有病例重新分析和recategorised低收入和高档要点。有丝分裂是tabularised计数0 - 5和以上5有丝分裂数据每50个高通滤波器。同时,免疫组织化学分析与ki - 67, p21, p27和细胞周期蛋白D1进行,然后进行扫描和数字分析。
3.1。免疫组织化学
经典的免疫组织化学检测使用抗体Ki67, p21, p27和周期蛋白D1的进行。所有化验完全执行验证的意图在体外使用。使用的细节展示在表的抗体1。
所有反应进行基准XT (Ventana医疗系统;罗氏集团美国图森市)。全自动deparaffinisation和补液后的样本,由CC1抗原暴露过程(Ventana医疗系统;美国图森罗氏集团),孵化主要抗体(抗原主要检索和抗体的时间和温度孵化是严格按照制造商的建议),并进一步进行常规步骤。我们使用了Ventana ultraView普遍用检测工具。
3.2。整个部分的数字图像分析化验
滨松的NanoZoomer S210(滨松®,静冈县滨松市,词头,日本)扫描仪用于滑动扫描。随之而来的使用Visiopharm专用的数字图像分析核+应用程序(Visiopharm®、Hoersholm、丹麦)。整个组织切片是扫描提供很好的洞察瘤内异质性和允许我们检测的热点。我们进行了两两分开计算热点和not-hotspot疫源地。整个幻灯片分析数字调整,从低到高,放大允许指向最活跃的领域(热点)。数字模板声明根据原子核反应强度训练周期和设置,同时对原子核的形状和大小。要点的典型intertumoral细胞形状和大小的异质性以及主轴vs类上皮细胞类型强制自然修正先前的设置在某些情况下。强大的核反应被编码为“强”,弱核反应是编码“疲弱,”和缺乏反应是编码为“消极。“数字感兴趣的对象(必须)表示1500年5μm×1500μ50米区域对应于一般分析高通滤波器领域覆盖ca。- 11毫米2。重要的是,选择DOI热点覆盖所有字段和单独not-hotspots领域的比较分析。所有区域附近的粘膜溃疡和肉芽组织,还富含基质ki - 67阳性淋巴细胞被严格排除,以避免错误引起的结果。弱和强核反应被编码为正数。描述瘤内增殖活动的异质性,所有计算都做如下:hotspot-positive比率(HSPR %)描述了一切积极细胞的比例计入DOI热点分析所有肿瘤细胞;同样,not-hotspot-positive比率(nHSPR %)对应于一切积极细胞的比例计入not-hotspots DOI的所有分析细胞。
3.3。统计方法
定量数据报告为最小值,最大值,值,降低(Q1),上层(Q3)四分位数(在非正态的分布的情况下)或均值和标准差。分类数据被表示为数量和比例分布。卡方检验或确切概率法应用于比较比例而Mann-Whitney测试或克鲁斯卡尔-沃利斯检验被用于比较连续变量的分布。连续变量之间的相关性被斯皮尔曼等级相关系数的评估。接受者操作特征(ROC)曲线分析测试能力的分析变量来区分低(≤3)、高(> 3)ESMO。ROC曲线下的面积(AUC)和95%置信区间(95% CI)估计,并确定最优截止值。优势比(或)和95%可信区间计算。recurrence-free生存(RFS)在两组生存率较相比。小动物——一张长有值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有统计分析使用R(3.1.2版;R统计计算的基础,维也纳,奥地利)和Statistica (StatSoft Inc ., 2014年版本12)。
4所示。结果
患者的平均年龄为62.2岁(从31到89;圣dev。13.8)。分析细胞的平均数量是12567每单数ROI (1500μm×1500μ区域),即每1毫米5585个细胞2。所有病人的一般特征和肿瘤中描述表2。此外,除了当前的计算,以前学习CD63和GLUT-1也被包括。
ki - 67中值达到6.5%强烈分离高,低档肿瘤( )根据当天艳阳高照的分类和按比例得分结果。如表所示2,HSPR %值遵循传统的MC ( )和所有其他的计算ki - 67 ( )。有趣的是,分析细胞的数量不同分析肿瘤使标签只限制的区域可能是错误的( )。在寻找一个有前途的ki - 67截止,我们观察到16%的HSPR %允许多样化非常高档的要点(5 - 6组)(AUC = 0.913;95%置信区间:0.828—-0.997, )。贴切地,ki - 67 HSPR % > 16%显示统计学意义的机会组4 +(5 - 6组)(或= 40.0,95% CI: 6.7—-237.3, )。
同时,tercile分裂患者分为三组进行分析。中位数3.5%和10%提取如下:低风险要点( ),中度-高危肿瘤( ),非常高风险肿瘤( ),现实我们观察到的问题准确分离低和温和的依据(图1)。
我们比较recurrence-free生存时期(RFS)与生存率较中值的6.5% ( ),和种间接,我们计算tercile分析阈值中位数为3.5%和10%。10%切断分离3 - 4和5 - 6组与RFS密切相关( ),呈现在图2。
下一个任务是面对强大的核反应范式。估计的影响弱和强核反应的斯皮尔曼秩分析应用。图3说明了数字地图覆盖滑动扫描。结果显示强烈正相关HSPR %与达成的所有项目数字分析。最高的值(0.94和0.93)均获得总(弱和强)阳性细胞和有选择地只弱核反应,分别。
细胞周期蛋白D1的比较分析,p21和p27 ki - 67进行推出生物标志物。意料之中的是,细胞周期蛋白D1的表达水平,p21,和p27是肿瘤恶性肿瘤的进展,尽管ki - 67 HSPR %达到最重要的意义(AUC 0.913, )(表3)。相同的结果是通过分裂MC分成两组:0到5有丝分裂及以上5有丝分裂(ki - 67 )。
5。讨论
在本文,我们的注意力一直集中在Ki67标签作为一个独立的生物标志物。有许多尝试ki - 67标签,和结论总是保持一致。看来ki - 67的诊断相关性可能比传统的MC和接近成为常规生物标志物在间质肿瘤。Cuylen et al .的结果帮助我们调整的意义有争议的核强和弱免疫组织化学反应在过去(15]。确实是一个很强的核反应对应于后期阶段细胞周期,可以描述有丝分裂图的附近。我们的结果没有证实强烈反应的关键作用;相反,我们注意到更强的总积极反应的影响。数字分析为我们提供了一个很好的解决方案精确提取弱/强反应,然后准确计数,最后精确的数学计算。它帮助我们揭穿神话强烈反应的优势。直接指示的锐截止值间质肿瘤可能低估或高估的风险。相对较小的队列允许我们实现大幅截止在6.5%提取高危肿瘤根据当天艳阳高照的原则。可以理解,最后得分由间质炎症或其他Ki67-positive细胞可能是伪造,所以也许一个框架结构纤细的灰色地带将被证明是更好的使用。显然,一个完整的截止值的实现需要更多数值组和工作组的共识。 PubMed-available data concerning GIST and Ki-67 are seriously diversified especially in methodology used. The results published by Liang et al. stated a 5% cut-off as biomarker of a worse outcome. That discrepancy with our data could result from a microarray technique with no hotspot extraction and counting with the naked eye [27]。Belev等人,年前等人还提出5%截止但是作者分析了只有100和1000个细胞28,29日]。此外,Basilio-de-Oliveira和Pannain指着一个阈值在每毫米134.8 ki - 67阳性细胞2作为一个很好的预测结果(30.]。赵等人应用两个阈值为5%和8%,我们也得出类似的结论;然而,他们只分析热点。本研究的自然限制的使用微阵列技术(31日]。基本上,可用的数据关于ki - 67年出版的分数是相似或略不同于我们的。这需要一个简短的解释。我们发现论文的计算是基于完全不同的方法,如微数组技术节约成本,只覆盖热点或随机选择区域仅计算强烈反应或分析一个小细胞数量。很多不同方法的实现必然会导致不同的结果。首先,我们设计计算符合当天艳阳高照规则5定义区域覆盖10 - 11毫米2;其次,分析了平均超过60000细胞在所有情况下;最后,我们做了一个多元化之间的强烈反应,弱反应,热点和not-hotspot疫源地。总之,我们整个幻灯片应用数字分析和热点领域得分差异背后的原因。看来微阵列可能严重导致interstudy差异。反问是最好的回答中并1.5 - 2毫米直径的核心组织真正对应于真正的复杂性包括异质性肿瘤?
下一个问题是字段的选择进行分析特别是热点地区的的意义和随机选择的区域。没有标签的全球共识原则。换句话说,自动计数的热点领域似乎是最好的可重复解决方案。的新鲜纸Thakur et al .,他们采用的是类似于我们的方法,这意味着整个滑动扫描与热点提取一种公正的方法(18]。ki - 67克隆用于免疫组织化学的问题已经想到在过去的十年中,MIB-1克隆被视为最高的ki - 67抗原的敏感性。接下来,论文涉及最新的ki - 67克隆报道可比MIB-1克隆之间的一致性和30-9克隆(16,17]。
我们观察到HSPR %和nHSPR MC和恶性程度有着密切的联系,但同时,量化显著差异( )HSPR %和nHSPR %之间(表2描述了组)之间的巨大差异。它有绝对意义的制定精确的截止值。使用数字解决方案,这就是为什么我们强调整体滑动扫描,只选择热字段标签。将相关的病人进行基于ki - 67截止值。根据当天艳阳高照的分类、ki - 67可以成为一个有前途的生物标志物。经验告诉我们保持距离预测基于MC的情况下当了一个小组织切片;因此,我们曾试图关注其他生物标记26,31日- - - - - -34]。在最近的一篇论文,刘等人报道1022名患者,截止值在6%非常接近我们的数据,尽管一些方法论的差异存在我们之间35]。最新出版的论文杉等人应用方法类似于我们达成8%的分数整体滑动扫描和ki - 67标签。作者得出的结论是,整体滑动分析提出了ki - 67分数在高档肿瘤8%,假设我们的研究热点可能达到10%以上(36]。
然而,临床肿瘤光仅关注ki - 67作为一个至关重要的生物标志物;没有其他人存在,效率较低。Phosphohistone H3 (pHH3)被广泛测试在许多癌症作为有丝分裂图的敏感标记检测和可被视为传统MC得分接近未来的接班人。有趣的是,其意义也很突出,在许多类型的恶性肿瘤细胞有丝分裂指数不定期评估。在许多论文,pHH3比例提出了作为一个高度预后的生物标志物(37- - - - - -42]。光,依据,分类基本上是基于MC的肿瘤,也已经被研究。如果假设染色质缩合积极pHH3包含IHC反应对应于最近阶段的有丝分裂,最后pHH3传统MC / MC分数必须通过高。作者参与,问题报告的必要性将肿瘤根据当天艳阳高照的规则,因为提高pHH3-positive细胞的数量比原来的MC (43- - - - - -45]。这就是为什么免疫组织化学和数字支持优于传统的手工计算的有丝分裂。
虽然我们没有发现与肿瘤的相关性测量和肿瘤位置,我们指出进展与细胞内增殖活动metabolism-dependent蛋白质,即CD63 GLUT-1。为什么男人和女人之间实现ki - 67分数更高( )仍不清楚。假设绝对缺乏选择性偏差,我们认为它可能源于队列的大小。
比较分析显示,绝对ki - 67年患病率比其他细胞周期蛋白作为临床上有用的生物标志物。有越来越多的数字化解决方案,但是一个关于就业问题的ki - 67得分仍然悬而未决。我们的经验不留下任何doubts-digital屏蔽一个大的肿瘤区域而不是小区域显微镜摄影让我们提取最活跃的领域。必要的时间进行分析包括扫描时间和图像分析接近10分钟使这种得分方式准确和节省时间的同时提供一个可重复的和类似的解决方案。
6。结论
肿瘤数字掩盖了可重复的和客观的标签是一种很有前途的解决方案。软件调整核形状、轮廓、大小等对省略其他ki - 67阳性细胞尤其是小淋巴细胞。此外,专用软件允许精确的数学计算结果更精确。
我们的结果指出ki - 67作为一名优秀的生物标志物在要点,但共同利用ki - 67后应该继续建立的无指导的细胞计数,最后进行更大规模的研究后为了达成共识的截止值。最近,发表论文呈现类似的结果虽然是基于不同的数字证明了利用数字标签的应用程序。
缩写
| 要点: | 胃肠道肿瘤 |
| 主持人: | 有丝分裂计数 |
| ESMO: | 欧洲医学肿瘤学会 |
| HSPR %: | Hotspot-positive比例比 |
| nHSPR %: | Not-hotspot-positive百分比比例。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
本研究使用人体组织是按照道德标准《赫尔辛基宣言》的最新修订2004年。此外,这项研究是通过教师的道德委员会的医学和健康科学、波兰凯尔采Jan Kochanowski大学(10/2016号决定)。
同意
病人的在所有的情况下取得书面同意。同意发表,不适用。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
研究设计是由PL, SG, JM。收集研究的队列是由IW MG-O。组织病理学检查是由PL。统计分析是由妇幼保健和PL的数据分析,DK,妇幼保健,SG, JM。AH-L收集了引用和PL和AH-L准备手稿。这项研究是由PL和SG。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
作者感谢太太Ewa Maurycy JKU病理部门的员工对她优秀的援助与滑动扫描。这项研究是基于615年1月Kochanowski大学基金没有515。Stanislaw Gluszek医学博士,教授,格兰特的收件人。