文摘
原子力显微镜(AFM)是一种广泛使用的成像技术在材料科学。成为一个标准的表面成像工具后,AFM已被证明是有用的在解决几个生物细胞细胞器的特征等问题,量化的dna蛋白质相互作用,细胞粘附力,和机电活细胞的性质。AFM技术自发明以来,经历了许多成功的改进包括射流力显微镜(FluidFM),它结合了传统与微通道AFM悬臂为当地液体分配。这种技术允许克服挑战与单细胞分析。事实上,FluidFM允许隔离和注射的单个细胞,控制力补丁夹紧跳动的心脏细胞,micro-objects串行权重,单细胞提取分子分析。这项工作的目的是检查AFM的最近的研究实现在分子和细胞生物学。
1。介绍
原子力显微镜(AFM)是一种广泛使用的工具材料科学。谈到作为一个进化的扫描隧道显微镜(STM)1),这是局限于导电材料。从这个意义上讲,AFM允许获得atomic-resolved绝缘体的图片(2]。
样品扫描的金字塔尖,是设置在一个灵活的悬臂弹簧固定一个x- - - - - -y- - - - - -z压电。悬臂梁的挠度监测与激光束反射的变化提示和样品表面之间的互动力量。因此,通过绘制的地形图像示例悬臂梁的挠度和它的位置在样本,而技巧是在表面扫描。
成为一个标准的表面成像工具后,AFM被越来越多地用于生物研究活细胞研究的许多特性,如机电(3)和细胞粘附特性(4]。此外,由于其兼容性与水环境,AFM被认为是最早的工具来监控实时微生物(5]。此外,AFM提供了可能性没有广泛的细胞在生理条件下研究生物样品准备。
自1986年开发Binnig et al。(2],AFM技术已经认识许多改进;射流力显微镜(FluidFM)是其中之一。由Zambelli集团(瑞士苏黎世联邦理工学院),FluidFM原子力显微镜相结合是一个传统与微通道AFM悬臂为当地通过射流液体分配电路(6]。使用这种技术,一些单细胞生物挑战解决。事实上,FluidFM允许单个细胞的分离7),量化的细菌粘附力(8),控制力补丁夹紧跳动的心肌细胞的9),连续加权microobjects [10[],单细胞提取分子分析11]。
本文目的是给最近的研究使用AFM技术的概述在分子和细胞生物学领域,提供了一个更新的FluidFM技术在生物科学用法。
2。AFM原则
正如上面提到的,原子力显微镜是一个扩展的STM技术。这两种方法之间的区别是基于探针和基质之间的相互作用类型。实际上,当探测器与底物相互作用通过隧道电流在STM, AFM探针与样品通过交互部队。这些力量大致可以分为吸引力或排斥力。
一套基本的AFM设置包括一个锋利的金字塔尖上灵活的悬臂,安装在电气压电(图1)。在方法阶段,样品表面与提示通过交互范德瓦耳斯部队。引力引起的悬臂偏转对样品表面。然而,当悬臂使接触表面,越来越斥力反感的悬臂表面。这种反应被称为泡利斥力。悬臂偏转修改的方向反射的激光束悬臂的背后在细使一个非常准确的测量偏差。这种检测方法称为光束探测(12]。
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AFM按照静态或动态运营模式(图1)。在以前的模式,称为直流模式,测量悬臂偏转是保持不变的。事实上,它的高度位置保持固定或由反馈控制器控制。然而,在动态模式下,也称为间断接触模式,或交替接触模式(交流模式),调查是在一个用户定义的振幅和振动频率接近共振,tip-sample交互影响谐振频率时,振荡的振幅和相位。这种模式提供了获得更多温和的地形信息,因为可能性较大的端面(即分离。无触点政权)。
3所示。AFM在生物学应用
3.1。dna蛋白质相互作用
自发明以来,AFM强烈导致dna蛋白质相互作用的研究。这些交互的基本作用等生物过程的调节DNA转录、复制和修复。扰动在dna蛋白质相互作用可以在原点的严重的疾病,比如癌症(13]。因此,调查了解许多细胞过程是至关重要的。从这个意义上说,几个方法和技术开发研究等交互。其中一些目标识别DNA-interacting蛋白质(即。染色质免疫沉淀反应分析方法(14和电泳迁移率改变分析15]),而其他人则是用来调查(即dna蛋白质复杂。、荧光、电子和原子力显微镜)。
AFM经常用于研究dna蛋白质复合物。当调查在成像模式下,DNA和蛋白质需要云母等自动附加到一个平面上。然而,这种表面带负电荷在水介质和中断绑定同样带电分子。因此,DNA附件要求的二价阳离子的成像介质或云母表面的预处理。
这些解决方案需要找到足够的dna蛋白质复合物之间的依附力平衡和云母的表面。的确,一个强大的固定分子底物可以抑制其功能,而附件允许它的弱点而牺牲AFM成像。
几项研究已经调查dna蛋白质复合物。太阳等人利用AFM研究单链DNA结合蛋白的作用(单边带)之间的交互放射心电图DNA解旋酶与DNA叉(16]。根据DNA-SSB-RecG复杂的形态学信息,用AFM,作者观察到单边带增强放射心电图加载效率到DNA叉。此外,单边带的交互与放射心电图导致后者的改造(16]。
最近,陈等人。有探索肿瘤抑制蛋白p53与DNA之间的相互作用在金属离子解决方案使用AFM [17]。结果突出的积极影响镁离子在p53-DNA绑定。实际上,作者建议,镁离子明显刺激p53 DNA的绑定。此外,在高浓度时,镁离子可以促进p53聚合形成的自组装的DNA和p53蛋白质网络(17]。
其他AFM技术提供的可能性是测量DNA及其相互作用蛋白质之间的互动力量。实验协议往往结合DNA通过聚合物垫片AFM技巧,而蛋白质表面固定化。通过力-距离测量多个approach-retract周期导致一系列。因此,解开事件可以被一个典型拉伸的聚合物前间隔键断裂。使用这个程序,巴特尔等。调查了革兰氏阴性的转录监管机构ExpG土壤细菌吗Sinorhizobium meliloti。他们探索ExpG的绑定机制三个启动子片段(expA1、expG-expD1 expE1) exp基因簇。AFM力光谱学实验证实了特定绑定的ExpG启动子区域,有相互作用力在50到165 pN的范围18]。
更深入的概述的AFM在分子生物学领域的成就,两个详细的评论是值得注意的19,20.]。
3.2。活细胞结构和功能的研究
AFM礼物很多优势相比其他成像技术。它允许特定结构的观测,如细胞骨架(图2)[21),并在submembranous结构动态变化的研究。此外,样品制备不需要任何标签或涂层。此外,实验可以在水环境中模拟生理条件(21]。
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许多AFM应用程序在哺乳动物细胞研究已经应用于癌症细胞的研究。因此,这些研究之一(Zouaoui et al。22])的力学性能相比极具攻击性的转移(曲泽)和nontumoral (WPMY-1)前列腺细胞系。从这个意义上说,单个细胞的粘弹性是通过AFM测量。结果表明下降的刚度和更少的粘性行为曲泽细胞,赋予他们更高的变形能力相比,WPMY-1控制细胞(22]。
最近,Cascione等人的抑制效果评估Rho-associated卷曲螺旋含有蛋白激酶(岩石)生活乳腺癌上皮细胞(23]。他们利用AFM评估细胞弹性的变化和形态学改变。结果表明,岩石抑制剂(y - 27632)的使用增加了细胞刚度和中断metastasization过程通过预防细胞迁移(23]。
AFM不仅是用于探索tumoral细胞还调查许多其他细胞类型。例如,Lanzicher et al。(24]研究了心肌细胞的生物力学行为携带核纤层蛋白A / C D192G突变,是心力衰竭的发展起源的一些DCM患者(25]。心肌细胞表达D192G AFM-derived机械性能的突变体显示增加细胞刚度与控制(24]。此外,其他研究用AFM理解其他细胞骨架蛋白的结构作用。在这种情况下,高层等人研究了vinculin参与心脏细胞的结构和功能的维护26]。AFM测量,cardiomyocyte-specific vinculin基因敲除小鼠,表明vinculin函数引起的损失减少膜皮层刚度的心脏细胞(26]。
最近,Smolyakov et al。27)探讨心肌细胞表面的生物物理特性通过小说multiparametric AFM的优化模式。作者调查了地形和心脏侧膜的力学性能。这种新奇的允许subsarcolemmal结构的表征,如线粒体和sarcomeric装置,确定两个z轴和尺度27]。
此外,AFM技术结合微电极阵列(MEA)检测心肌细胞的机电活动以及描述药物药物的影响(3]。要做到这一点,分离、培养新生大鼠心肌细胞。然后,一毫升细胞悬液的填充到细胞室是一个组装的是芯片和玻璃环固定在它的上面。在6天的文化,是芯片与心肌细胞是在AFM。此后,心脏细胞的微电极定位下探头尖端。当悬臂与心肌细胞接触参数设置后,细胞外记录的字段潜力和悬臂偏转检测(图同时开始3)。值得注意的是,悬臂偏转为数据反映了心肌细胞跳动的力量(3]。
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许多其他成就的AFM意识到在不同的领域,如结构生物学、药理学和微生物学。我们感兴趣的读者参考这些有价值的评论文章5,28,29日]。
4所示。FluidFM技术
在1980年代发明以来,AFM已知的巨大改进,如射流的发展力显微镜(FluidFM)。后者是由Zambelli集团(瑞士苏黎世联邦理工学院)与微通道相结合,由传统的AFM悬臂紧密连接到一个外部热源(图4)[6]。这种技术可以克服传统AFM提出的一些局限性。的确,通过射流压力的应用电路允许完成多样的实验细胞粘附力的量化等生物分子,细胞注入,补丁夹紧,取样分析[紧随其后8,9,11,30.- - - - - -34]。
微通道悬臂的精密加工是基于热融合两个硅片制造体内腔内衬二氧化硅的硅。然后,悬臂微通道进入硅片和结束在一个开放的水库6]。最后,光圈的顶点悬臂端实现使用聚焦离子束铣[6]。因此,建议授予获得流体的多功能性AFM力控制的准确性。后者允许温和的操纵和孤立的单个细胞(7,35],细胞基质的量化,但是,和相互作用[8,34),而压力控制允许量化操作的液体和可逆固定化细胞孔边缘。
4.1。控制沉积和注入的生物分子
带来的主要成就FluidFM技术是生物活性物质的准确交付打细胞。在这方面,迈斯特等人控制力的荧光染料表现为神经母细胞瘤细胞损伤。细胞内注射使用两种不同的方法进行。第一个是注入10 fL FITC染色的静水压力探针使用非常锋利。这种注射后,作者观察到的荧光信号的外观没有重大修改细胞体积。此外,使用相同的微通道悬臂,三个不同的神经元已经连续注射FITC染色,表明探针可用于多个操作没有堵塞(6]。第二种方法是利用一个温柔的接触过程污点生活神经母细胞瘤细胞。这样做,一个微通道悬臂充满membrane-permeant染料被放在细胞和留在温柔的接触,直到染料扩散进入细胞质。
在相同的研究中,迈斯特等人显示的能力FluidFM系统准确地提供分子到选定的亚细胞结构。为此,该地区感兴趣的第一次扫描。然后,根据获得的地形信息,作者能够描述结构很难访问到光学显微镜下注射系统。在这项研究中,一个varicosity-like结构,局部的两个连接神经母细胞瘤,成功注射membrane-permeant染料被称为吖啶橙(6]。
之后,Guillaume-Gentil等人已经证明FluidFM-based喷射系统的多功能性,同时填充悬臂微通道与染料或生物活性分子(7,33]。首先,作者注入海拉细胞细胞核nonpermeable染料,dextran-tetramethylrhodamine。获得的荧光图像表明,染料仍保留注入核(33]。此外,使用同样的方法,质粒DNA编码绿色荧光蛋白(GFP)是细胞核注入。两个小时后,一个瞬态检测到GFP的表达33]。第二,相同的团队集中在优化一个控制力协议旨在选择性分离单个细胞汇合的层(7]。射流力显微镜是用来隔离选择通过本地化的胰蛋白酶化细胞。细胞被发现通过允许其温和的愿望转移在所需的位置7]。
此外,FluidFM也用来提供微生物。从这个意义上说,施蒂费尔等人研究了感染的病毒粒子VACV模式通过其荧光的形式加载到微通道悬臂(36]。因此,少量的病毒粒子(从1到12)沉积控制的方式一个一个上单海拉细胞(36]。
4.2。空间操纵活细胞
正如之前提到的,由于射流电路集成在FluidFM系统,机械手可以准确地操纵microobjects。这些对象可以可逆地固定在悬臂孔径负压的应用程序。然后,被困对象可以重新定位在所需的基质和发布的应用正压。通过这一原则,Dorig等人已经流离失所的哺乳动物细胞(神经元),酵母(酿酒酵母)和细菌(大肠杆菌)。例如,酿酒酵母是被移动悬臂在接触模式下AFM力反馈;后来,在射流负压应用电路。因此,酵母固定化微孔道孔径。最后,这些细胞被背井离乡,到所需的新职位发布的一个简短的正压。作为注入实验,描述了串行操作是可能使用相同的悬臂(32]。
之后,基于IR特定的荧光,单一使用FluidFM bacteriochlorophyll-expressing细菌被成功分离技术(35]。最近,Guillaume-Gentil等人拾起并定位技术扩展到哺乳动物细胞(7]。
4.3。附着力量化
细胞粘附是生理过程涉及高度监管的相互作用、细胞的相互作用或其底物。在哺乳动物细胞中,粘附等涉及许多细胞功能分化、组织开发和炎症。
FluidFM提出了好几种可能粘附在单分子水平研究。Potthoff等人开发了FluidFM-based单细胞力光谱学(舱)代替传统的细胞捕获悬臂由真空化学固定(34]。使用这个系统,作者研究了酵母和哺乳动物细胞的粘附执行序列和动态长期附着力测量(34]。白念珠菌是第一个实验模型用于这项研究。基于force-distance曲线,分离过程中获得的白念珠菌从疏水表面十二烷基磷酸,最大附着力和粘附的工作已经达到43 nN和8.10−15分别J。的FluidFM-based方法允许大约200酵母细胞的连续测量相同的探针(34]。此外,作者扩展该系统的适用性海拉细胞,有附着力不镀膜玻璃衬底的约470±130 nN在37°C (34]。之后同样的团队调查的附着力大肠杆菌和酿脓链球菌使用FluidFM。的附着力大肠杆菌从polydopamine几乎是4 - 8神经网络(8]。
最近,科恩等人使用FluidFM-based方法比较两同型的(乳腺癌MCF7细胞线之间)和异形的粘附力(MCF10A乳腺癌细胞之间和nontumorigenic HS5细胞)。细胞粘附力测定使用短期(接触时间:1-50年代)和长期(联系时间:30 - 60分钟)粘附协议。在短时间接触,结果报告了类似的同型的粘附力和异形的条件,虽然他们在较长时期接触不同37]。
总的来说,所有引用的研究已经证明了添加值的FluidFM调查微生物粘附,细胞基质,,和交互。实际上,与传统的AFM相比,这就需要利用化学治疗在悬臂固定细胞,FluidFM使用一个基于真空固定细胞的物理过程。因此,我们避免偏见的引入在附着力测量由于潜在的修改相关的细胞生理学化学治疗。此外,在不可逆的化学固定细胞相比,空气稀薄的固定是一个可逆过程,允许多个操作相同的细胞。
4.4。细胞电生理学
离子通道是细胞膜转运蛋白负责通过细胞膜的离子通道根据他们的电化学梯度的方向。这些蛋白质的功能障碍,也称为channelopathies,与一些人类疾病的发生如心律失常和神经退行性疾病(38- - - - - -40]。因此,离子通道成为最重要的分子靶点好几类的药物。
在这种背景下,众多电生理学技术开发研究离子通道的生物物理和药理性质。膜片箝技术被认为是黄金标准技术在这一领域。它依赖于夹紧部分细胞膜的电压通过一个玻璃微量吸液管上的细胞。小应用负压卖好电阻称为gigaseal。然后,附加在吸管吸膜破裂提供电气进入细胞质,这个配置被称为全细胞配置。
最近,Ossola等人结合了膜片钳技术通过FluidFM AFM技术(pc-FluidFM)(图5)[9]。这种组合使研究离子通道的功能,同时控制了细胞上的作用力。事实上,使用两种不同的细胞模型(HEK293和成年小鼠心肌细胞),作者记录了我快Na电流通过心脏钠离子通道介导的Nav1.5(图5)。pc-FluidFM利用AFM力的控制获得gigaseals甚至记录离子电流从心脏细胞收缩。此外,相比传统膜片钳,作者展示了pc-FluidFM的能力来执行串行补丁夹紧试验使用相同的调查。
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另一方面,这些作者使用pc-FluidFM作为注射工具。事实上,在获得全细胞配置,解决方案中包含的微流控电路可以扩散到研究细胞的细胞质中。使用这一原则,作者进行了连续注射路西法黄色染料在新鲜分离心肌细胞没有任何形态变化的最后注入实验(9]。
的一个主要的限制pc-FluidFM技术获得的低电阻在密封形成(通常在100 MΩ与1 gΩ,或者更多,为最优gigaseal配置)。低阻密封作为一个可能的解释,作者指出的横切面和小高度深度FluidFM技巧阻碍建设gigaohmic抗性。因此,增加噪声和漏电流。结合最新的高电阻和电容FluidFM调查导致跨膜电压的部分夹强烈影响离子通道的生物物理参数的测量。
4.5。单细胞的提取和分析
单细胞可变性是多细胞生物的基本特征。在任何特定的组织中,我们可以找到一个异质的细胞具有不同的基因表达谱。单细胞分析方法的发展,如流式细胞仪、质量spectrometry-based方法,和单细胞RNA序列,揭示了细胞异质性是参与多种生理过程41]。
几个MS-based单细胞代谢研究方法已经开发出来。这些方法都是基于单个细胞的电离,其次是提取胞内的内容。例如,简颂et al。朗格汉斯小岛的单细胞异质性特征使用microscopy-guided单细胞matrix-assisted激光desoption /电离飞行时间质谱(MALDI) [42]。作者分析了超过3000个细胞,证明这个系统研究代谢能力的异质性在单细胞水平。然而,这些方法通常需要的提取分析细胞的生理环境。在结果中,孤立的细胞从他们的邻居可能会影响他们的生理功能43,44]。为了克服这个限制,FluidFM技术在单细胞分析领域提供了新的可能性。从这个意义上讲,Guillaume-Gentil等人已经使用了这种技术,分析单分子从不同的细胞中提取隔间(11]。在这一目标,FluidFM探测光放在目标细胞。然后,迫使光谱开始进入所需的隔室。一旦插入探针,应用负压通过悬臂微通道提取细胞的内容。这个过程是意识到培养海拉细胞表达绿色荧光蛋白GFP强度,明显降低在细胞核和细胞质。此外,为了进一步证明细胞的选择性萃取室,细胞核与两个不同的荧光标记,标记mRuby-NLS FITC-dextran。两个标记,提取过程诱导减少核荧光相比,细胞质(11]。这些结果证明的能力FluidFM选择性地提取隔室内容没有任何细胞损伤。的确,后提取卷4.0 pL从细胞核,细胞质和0.6 pL大多数细胞仍然是可行的。大卷的提取诱导细胞死亡(11]。
在提取过程中,使用三种不同的方法提取进行了分析:电子显微镜和生化和转录分析。作为一个例子,我们在这里描述的结果细胞质中提取的研究。作者分析了在0.6和0.7之间pL GFP的提取物,beta-actin, beta-2-microglobulin成绩单。百分之九十的样本分析显示,至少有一个这些基因的表达。
另一方面,相同的分析程序应用于核内容。这个隔间与细胞质相比更有挑战性。事实上,基因转录中没有检测到提取的卷0.2到0.5之间(pL),而他们的检测是可能的体积为0.7 . pL。此外,核和细胞质成绩单显示更高的对比检测在细胞质中。
在最近的一项研究中,Guillaume-Gentil等人已经从单一的活细胞分析代谢物提取通过FluidFM芯片技术耦合的质谱(31日]。首先,作者几乎没有提取picoliter(0.8到2.7 pL)从海拉细胞的细胞质中内容。一旦收集所需的大量提取,悬臂探针放置到所选的微阵列与力控制质谱(图6)。下面这些提取物的释放,MALDI-TOF分析实现。这种分析揭示了20个不同的代谢物包括核苷酸,激活糖,氨基酸,谷胱甘肽。作为这项工作的结论,这项研究已经证明了这种方法的能力来分析胞质代谢产物从单个细胞在生理环境31日]。
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5。结论
从他们的发明,AFM和FluidFM回应在几个研究领域(即许多生物学问题。、结构生物学、微生物学、分子生物学和生物物理学)。事实上,FluidFM目前用来描述细胞结构、操作和单个细胞注射染料和生物活性分子,从特定的细胞中提取和分析代谢物的行李架,同时记录电气和收缩的细胞活动。从今以后,如果未来发展FluidFM作为组合不同的操作模式,同时它可能有助于调查的结构和分子以及生物活性分子的功能效应之前和之后他们的交付,特别是在多细胞。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢博士Tomaso Zambelli(瑞士苏黎世联邦理工学院),他的评论在这个手稿。