文摘

使用原子力显微镜(AFM) PeakForce定量纳米机械映射(QNM)技术,我们曾表明,人类的动脉外膜内乳动脉(IMA),测试在脱水条件下,改变患者高度的动脉硬化。在这项研究中,我们探讨了纳米膜弹性模量的媒体IMA的水合、脱水条件的低和高动脉硬化患者,评估在活的有机体内由carotid-femoral脉搏波速度(采集)。在水化和脱水条件,内侧层明显硬高采集组。弹性模量的水分和脱水膜媒体与采集显著相关。在水分条件下,某些小富亮氨酸重复蛋白聚糖的表达活动(SLRPs),这是与动脉硬化有关,被发现是内侧弹性模量负相关。我们还比较了IMA动脉外膜上的数据与我们以前的工作。我们发现水化媒体和脱水动脉外膜都是适合反映动脉硬化的发展和SLRP表达式。这种综合研究的纳米机械属性结合ima的蛋白质组学分析表明结构属性和功能链接的可能性与小说AFM小生物样本的方法。IMA是一个合适的目标预测动脉硬化。

1。介绍

在临床实践中,动脉硬化是常见的评估与脉搏波速度(采集)。采集测量是由在活的有机体内通过记录的渡越时间,血液在血管系统的两个点,通常从股动脉的颈动脉。采集被认为是一个强大的预测一般人群的发病率和死亡率的风险(1,2]。然而,动脉与复杂结构和生物力学过程,随着年龄的增长发生在动脉变硬和疾病。这些改变不是捕获与采集简单平均脉管系统的属性在相对较大的距离。高空间分辨率技术,如原子力显微镜(AFM)可以对我们理解的桥梁,使局部的生物力学和维管组织的超微结构的测量在孤立的部分。

许多研究利用高空间分辨率的技术来探测动脉硬化在体外,例如,3,4]。然而,这些研究通常局限于动物模型由于显而易见的挑战人类主动脉组织进行测量。因此,临床采集和之间的直接联系在体外微/纳米机械性质长期以来仍然是一个挑战。最近,内乳动脉(IMA)已成为一个优秀的船为研究动脉硬化的发病机制,特别是在分子水平上(5- - - - - -9]。容易访问期间修复动脉冠状动脉旁路移植(CABG)操作。虽然没有参与这项carotid-femoral采集通路,我们最近发现使用AFM纳米机械属性和胶原原纤维的形态改变,IMA的动脉外膜与高采集有关(1]。此外,IMA被用在一个平行的研究来确定小富亮氨酸蛋白聚糖(SLRPs)与动脉硬化(9]。因此,IMA可以用来直接测量相关属性超微结构和分子水平的患者高采集,克服固执采集获得维管组织的途径。

虽然PeakForce QNM最近用于探测生物样品在生理条件下(10- - - - - -14),我们之前的研究是第一个应用PeakForce QNM血管组织(1]。本文基于研究[1),证明PeakForce QNM AFM [15,16)的动脉外膜患者IMA改变高采集,用纳米弹性模量和胶原原纤维形态。我们现在扩展方法和应用PeakForce QNM IMA的内侧层脱水和水分条件。我们所知,这是第一个研究应用PeakForce QNM软组织纳米机械特性充分水化条件。本文比较了纳米内侧层的弹性模量在脱水和水分条件下,对两种情况下,该AFM数据之间的关系,探讨了病人的元数据和蛋白质组学数据。此外,脱水的脱水内侧比较测量动脉外膜测量,以确定最佳方案时利用AFM IMA作为动脉硬化的目标。分层的生物力学上的文学性质的人类动脉是稀疏,因此这种差距是解决。

2。材料和方法

2.1。患者信息

IMA的修复动脉搭桥的操作。在这项研究中,所有的ima收集从17后废料CABG手术病人个性化医学的中心动脉疾病(欧登塞大学医院,欧登塞,丹麦),作为项目的一部分,由当地伦理委员会批准在丹麦南部地区(s - 2010044)。

在冠状动脉旁路移植患者评估carotid-femoral采集利用SphygmoCor系统标准化的条件下(如前所述)(9]。临床资料,包括年龄、性别、糖尿病和高血压,收集在手术之前。基于参考和正常价值carotid-femoral采集(17),17例患者分为两组:低采集(8.5±0.7 ms−1, 患者)和高采集(13.4±3.0 ms−1, 病人)。全部病人临床参数中给出1]。应该指出的是,组织样本和患者群体是相同的那些在我们之前的论文集中在IMA动脉外膜(1]。然而,测试位置(内侧层)和方法(脱水和水化)是不同的。

2.2。PeakForce QNM环境条件

AFM测试5日进行μm与PeakForce cryosections QNM方法使用多模8原子力显微镜(AFM)(毫微秒示波器八世多模AFM,力量Nano Inc .)、纳米表面,圣芭芭拉分校CA)。方法详细解释了其他地方(1]。所有的测量进行了力量rtespa - 150蚀刻硅探测器。这些探测器有名义半径8海里和悬臂的名义弹簧常数5海里−1和150 kHz的共振频率。弹簧常数和齿顶圆角半径的调查之前校准测量。此外,photostress涂层聚合物参考样本(PS1,威世精密集团、海尔布隆、德国)与已知弹性模量被用来校准机械测量(1]。

对于这些测试,扫描速率是固定在0.93赫兹,决议被设定为与固定扫描每行256像素大小(2×2μ米2)。65536年机械特性,测量(256×256独立力曲线)为每个图像得到收益的平均弹性模量。所有AFM原始文件处理与力量毫微秒示波器分析1.5版本。识别内部弹性薄片(IEL)和外部弹性薄片(鳗鱼)局部测量,光学显微镜与AFM集成设置是利用(图1)。三个随机局部地区探测每个组织切片的媒体。为每个病人两个部分进行了研究。因此,有六个测量纳米机械属性为每个病人。


图1
本地化的纳米机械的方法映射人类IMA中模的。(一)人类内乳动脉(IMA)是cryo-sectioned 5μ米厚的组织部分。用显微镜拍摄的光学图像结合的AFM脱水(b)和(c)水化组织部分。IEL和鳗鱼截然分开内膜层,中模,IMA的外膜。(d)原理图的AFM图像和IMA组织学。
2.3。在液体条件下PeakForce QNM

相同的AFM系统,测试在液体条件下是可能的在流体细胞(MTFEML力量)。一个力量ScanAsyst-Fluid探针故意钝尖(名义小费 )和极低的弹簧常数(名义上的春天 ,共振 )应用于图像的水分在蒸馏水组织部分。齿顶圆角半径和弹簧常数的探针校准使用上述过程中使用环境条件(1]。下面这个,聚二甲基硅氧烷(PDMS)样本作为参考样品模量测量校准。PDMS的弹性模量是决定独立通过nanoindentation(纳米硬度计压头与DCM G200二头,KLA-Tencor,苗必达、钙、美国)利用100μ米平冲头(Nidau Synton-MDP有限公司、瑞士)在校准之前。测试是由110 Hz使用一个振荡nanoindentation方法[1]。nanoindentation数据产生平均弹性模量为5.1±0.36 MPa。

液体测试期间,锋利的技巧可以拖动整个水化软组织和组织造成损害,从而导致机械错误映射。与扫描大小设置为2×2μm与扫描速度缓慢(小于0.501赫兹),机械制图在液体被发现更可靠。因此,在环境条件下比较,成像也保持在2×2μm。流体检测的扫描速率保持不变在0.501赫兹。进一步,由于高度敏感的表面水化组织样本,更高的扫描分辨率是应用于流体条件与环境条件的测量。因此,384样本/行选择和147456(384×384)独立的力曲线得到每幅图像产生的平均弹性模量。例子force-indentation曲线如图2在环境和流体条件下为我们的参考样品。

(一)
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(b)
(b)
图2
AFM force-indentation曲线获得的例子(a) PS1和(b) PDMS参考样本在环境和流体条件下,分别。

对于每一个病人,两个组织部分三个随机地点选择成像/组织切片。因此,总共有六个每个病人测量。然而,样本三个病人(ID: 552年低采集,620年和643年在高采集;见支持信息表S1在[1])在水化过程中无意中损坏,无法学习。因此,总共七个病人在低和高采集组检查液体状态。

2.4。集成定量蛋白质组学、纳米机械数据和病人的元数据

定量蛋白质组学数据的一些病人队列分析本研究可以从一个更大的队列研究发表的汉森et al。9]。完整的方法论的数据对于这些测试可以在他们的论文中找到。7的数据可用SLRP蛋白质被发现在高表达下调采集患者,即lumican, mimecan, prolargin, asporin, podocan, decorin,实验9]。集成纳米机械数据获取与蛋白质组学数据和病人在这个研究元数据,一个多变量变换叫做主成分分析(PCA)是使用。

2.5。统计方法

病人的特点提出了 ,和所有的条形图 。所有患者平均测量统计分析之前。组差异评估通过一个合适的2-sample独立测试评估后选择数据正常和方差齐性。水化的纳米机械性能和脱水媒体之间的差异的高低与Mann-Whitney采集组进行测试 测试。Kolmogorov-Smirnov(钴)测试用于评估的统计显著性分布的纳米机械水化性能和脱水媒体之间的低和高采集组。斯皮尔曼相关系数是用来测试水分的测量弹性模量之间的关系和脱水媒体和采集以及SLRPs表达活动。蛋白质组学数据分析与纳米机械连接和定量变量(即元数据变量。、年龄、体重指数、胆固醇和糖化血红蛋白)的所有患者通过无监督数据转换PCA。所有统计分析进行了测试使用OriginPro版本9 (OriginLab,北安普顿,MA)。

3所示。结果与讨论

在这项研究中,水分的纳米机械性能和脱水媒体进行评估以确定效用的AFM测试水分的组织。评估IMA内侧层在不同的条件也比动脉外膜数据与相关分析和评估,评估最好的方法确定动脉硬化的IMA样本。组织学评估可以发现在1]。

3.1。纳米机械脱水媒体的属性

在环境条件,高采集患者有更严厉的内侧超微结构比低采集组(低 ;高 ,Mann-Whitney 测试中, )(图3(一个))。弹性模量的范围从1325.5到2770.7 MPa和低和高2520.3到4030.0 MPa采集组,分别。模量分布这两个组之间也有明显不同(Kolmogorov-Smirnov测试, )(图3 (b))。

(一)
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(b)
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图3
纳米机械脱水性能的媒体在环境条件的两组。(一)条形图显示显著差异在弹性模量的患者 ( 患者在低采集组; 病人在高采集集团)。(b)两组测量弹性模量的分布;模量分布之间的显著差异被发现两组整体脱水媒体(Kolmogorov-Smirnov测试, )。
3.2。纳米机械水化媒体的属性

水化样品,类似的趋势观察的环境条件;即。,the elastic modulus was higher in the high PWV group. However, the trends were more pronounced in these conditions. In the high PWV group, the medial layer was approximately three times stiffer than that in the low PWV group (low PWV ;高采集 ,Mann-Whitney 测试中, )(图4(一))。测量弹性模量的病人范围从180.1到292.7 kPa和低和高286.6到1114.7 kPa采集组,分别。模量分布之间的显著差异被发现在两组(Kolmogorov-Smirnov测试, )(图4 (b))。

(一)
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图4
纳米机械性能的流体条件下的水化媒体所有可用的病人。(一)水化媒体在每个病人的弹性模量( 病人每组Mann-Whitney测试, )。(b)内侧层的模量分布在低和高采集组( 测量每组Kolmogorov-Smirnov测试, )。

大188%的平均弹性模量被发现在高采集组比低采集组。相比之下,增加52%时观察到的组织是脱水。绝对的价值观截然不同的两个条件的弹性模量高出3倍左右当组织脱水(表进行测试1)。这些数据突出水的重要内容管理软生物组织的机械性能。

表1
意思是,中位数,标准偏差(SD),标准误差(SE)、偏态和峰态弹性模量数据给出了水分和脱水IMA媒体。

进一步评估的数据检查的分布偏态和峰态如表所示1。低采集组均有负偏态水化条件而高采集集团正偏态。的峰态参数是负数,大约相当于脱水媒体在低和高采集组。然而,对于水化媒体,低的峰态参数是积极采集组和高采集组接近零。因此,在水分条件下,弹性模量分布的尾巴更明显。

图5显示了内侧例子AFM图像层脱水和水分条件。IMA是一个过渡动脉,在很多患者,不列为一个弹性动脉,因此没有任何弹性薄片礼物(1]。因此,AFM图像显示一个情绪淡漠结构几乎没有任何纤维结构的证据。这是更加明显在脱水图像(数字地形变化不太明显5 (d)和5 (e))。

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(c)
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(f)
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图5
示例图像显示了水化媒体(a)地形、(b) DMT模图,(c)直方图显示的弹性模量分布和脱水媒体,(d)地形、(e) DMT模数地图,(f)直方图显示的弹性模量分布和脱水媒体映射的地形。所有图片是患者627人。

尽管没有其他的研究在文献中已报道人类IMA内侧层的弹性模量,我们可以把我们的价值观与其他相关的已发表的研究。Sicard et al。18为人类肺动脉]报道值用AFM测量使用尖锥体的小费是67.66±122.26 kPa的范围4.24 - -804.00 kPa。艾克塔等。4]调频AFM方法用于描述层内侧的年轻和老羊主动脉和报道几何平均数为42.9±2.26 kPa年轻绵羊和113.9±2.57 kPa老羊。格兰特和Twigg [1910)使用AFMμm提示描述猪肺动脉和猪主动脉外膜层。肺动脉,他们报道一系列2.3 -1130 kPa的均值88.9 kPa,和猪主动脉一系列0.7 -391 kPa的均值15.8 kPa。我们的平均值高于每个这些研究,但在一个可接受的范围内。进一步的工作需要确定不同的是由于测试方法或动脉的类型。格兰特和Twigg [19)强调,有相当大的动脉内异质性也解释了大范围的值。

3.3。比较的脱水内侧层与脱水外膜层

我们以前发表的数据展示的效用IMA动脉外膜层作为一个潜在的目标加强研究[1]。在这里,我们现在比较脱水的机械数据媒体与外膜的数据为同一患者(1),当数据以及趋势平均为两层(媒体和动脉外膜)。这些数据如表所示2。总的来说,每个条件的弹性模量显著增加在高采集采集组(低采集:相对于低 病人;高采集: 病人)。虽然没有统计学差异测量弹性模量之间的脱水媒体,在每组(Mann-Whitney动脉外膜 测试中, ),脱水媒体略硬比脱水动脉外膜在高采集组。高采集组超微结构的刚度增加了媒体和动脉外膜脱水的49.5%和34.1%,分别。合并后的图层组,弹性模量高采集组增加了41.7%。

表2
动脉外膜弹性模量的媒体,媒体+动脉外膜脱水时IMA测试。的Mann-Whitney 测试是用来测试统计区别每一层的低和高采集组。
3.4。相关分析

评估纳米机械之间的关系属性(采集)和SLRP表达活动,斯皮尔曼等级次序的相关性是用来计算的相关系数之间的关系(表测试他们的意义3)。

表3
斯皮尔曼等级次序相关评估相关性的不同层的弹性模量(E),采集和SLRP表达式。

总而言之,如表所示3、水分的纳米机械性能和脱水媒体明显与病人的采集值呈正相关,这是类似于脱水动脉外膜(1]。结合脱水媒体和动脉外膜的弹性模量也积极采集相关数据。这些研究结果表明,所有四个方法可以用来反映临床动脉硬化,即。、脱水动脉外膜,脱水媒体,媒体或水分。

SLRP表达之间的相关性和不同层的纳米机械性能在所有可用的患者( 患者为条件)(表3),SLRPs 7投4中表现出显著的负相关,测量含水介质的弹性模量。这对应于我们之前的研究(9),5 7 SLRPs (lumican、mimecan prolargin,阿司匹林,和decorin)在高采集患者表达下调。

SLRPs作为一个家庭复杂和多样的大分子在动脉粥样硬化(动脉壁起着关键作用20.和动脉ECM重塑21]。定量蛋白质组学从我们之前的研究中收集的数据(9从整个IMA组织现在已经与纳米机械测量媒体(脱水和水分)和动脉外膜(脱水),以及媒体和动脉外膜结合(脱水)。相关分析表明,纳米机械属性的水化媒体更相关的表达活动比脱水SLRPs媒体。这进一步强调了测试的重要性的组织条件模拟生理环境尽可能多。

SLRPs至关重要的结构完整性和功能调节动脉壁的合成、组装、和动脉ECM重塑组件如胶原蛋白、弹性蛋白、smc。SLRPs在动脉硬化的作用,以及调节胶原原纤维组装和体系结构,详细讨论其他地方(9),和他们关系外膜胶原原纤维形态和nanomechanics最近建立了(1]。与控制胶原fibrillogenesis和胶原蛋白组织,研究揭示了SLRPs的重要性在调节smc增殖和迁移,这是媒体的主要肌肉动脉。积累lumican smc表示,位于纤维内膜增厚和媒体,协会与内膜的增厚和有能力维护患者动脉粥样硬化(外膜的机械性能22]。高度表达人类smc mimecan发现显示加速细胞增殖,迁移,和死亡,从而调节动脉粥样硬化(23和动脉粥样硬化斑块24]。Biglycan促进SMC增殖和迁移相关的动脉硬化的病变动脉修复和血管损伤的发病机制25]。调节decorin发现在人类动脉粥样硬化病变钙化的地区,它加速了SMC钙化(26]。这些重要的角色在内侧层SLRPs有助于阐明为什么SLRP表达式与内侧层纳米机械特性高度相关。

3.5。主成分分析(PCA)

测量的变量在这项研究进行了综述和综合利用主成分分析法(PCA)与SLRP数据。这个转换的得分图如图6(一)这清楚地显示了一个高低采集病人的区别。这个变量的贡献最分离装运情节(图所示6 (b)),不出意外,可以看出,采集的主要贡献者之一是分离的患者。有趣的是在协议与评估数据在这项研究中,它是与脱水层的弹性模量密切相关。此外,主成分分析对数据没有采集变量显示类似的分离高低采集病人和展品水化和脱水层的弹性模量的三个关键变量分离(数字6 (c)和6 (d))。含水介质的弹性模量与年龄密切相关。此外,纳米机械脱水媒体和动脉外膜的性质是密切相关的。大多数SLRPs密切分组在PCA分析mimecan和实验的差异,这是类似于动脉外膜的主成分分析数据。

(一)
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(b)
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(c)
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(d)
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图6
PCA病人蛋白质组学,量化元数据,和纳米机械变量。(一)分数一分之二的情节组件。每个点代表一个病人。病人有色集团(红-高采集、绿-低采集)。(b)加载块(一个)显示的变量的贡献最结构化观察(a);采集和弹性模量的水分媒体(E-Hy),脱水媒体(我),动脉外膜(E-Ad),并结合脱水媒体和动脉外膜(我+广告)是四个最贡献变量的两组之间的分离。(c)评分的患者数据的两个主要组件没有采集变量。类似的可以观察到两组之间的分离。(d)加载块(c)表明,E-Hy我E-Ad,我+广告的四个最贡献的变量分离。我和E-Ad是高度相关的。 Of the SLRPs, mimecan presents the most contribution to the separation between groups observed.

4所示。结论

本研究探索纳米stiffening-related超微结构的变化中模的人类患者ima在环境和流体条件下高采集。我们表明,PeakForce QNM可用于力学性能表征的水化生物组织。这项研究清楚地表明AFM方法可以作为一种工具来评估动脉硬化,具有良好的协议和预期的趋势在活的有机体内测量。内侧超微结构的力学性能在水化和脱水条件相关的carotid-femoral采集。的AFM-derived纳米机械性质也与SLRP表达式,这是与动脉硬化有关。根据相关测试,我们建议内侧和外膜层都适合AFM分析描述纳米动脉硬化。总的来说,这项研究表明AFM动脉硬化研究方法的效用。

数据可用性

Excel数据用于支持本研究的发现是包含在文件的补充信息。

的利益冲突

没有利益冲突声明。

确认

Z。C是由利物浦大学/国立清华大学双博士学位计划。RA是感激英国皇家工程院/利华休姆信托赞助高级研究奖学金(LTSRF1617/13/76)和英国心脏基金会(PG / 16/107/32681)。作者(佐和佩克)真诚地感谢科技部的财政支持,台湾(most105 - 2221 - e - 007 - 012 - my4和most107 - 2218 - e - 007 - 049),和高熵材料中心(most107 - 3017 f - 007 - 003)。作者要感谢Ahmed Kazaili和Zhuola(利物浦大学工程学院)帮助收集AFM force-indentation曲线。

补充材料

原始数据的补充材料只是一个Excel电子表格按照《华尔街日报》的“数据可用性”的政策。(补充材料)