为扁平细胞轴对称接触问题:基质效应的贡献和细胞厚度粘弹性性质的测定采用AFM缩进

文摘

Nanoindentation技术已经被证明是一个有效的方法来研究生物细胞的粘弹性性质。实验数据得到nanoindentation经常被赫兹接触模型。然而,为了验证赫兹接触模型,一些研究认为细胞有无限厚度,不一定代表实际情况。在这项研究中,一个严格的线性弹性接触模型基于解释的压痕测试开发的扁平细胞。细胞,通常连着培养皿,最初是作为一个弹性层有限厚度完全固定在刚性衬底。线性弹性理论用于解决这个问题然后解决方案扩展到粘弹性接触情况被认为是一种良好的生物细胞力学性能指标。测试目前的模型,AFM-based蠕变试验了人类肝癌细胞smmc - 7721细胞)及其fullerenol-treated同行。结果表明,本模型不仅可以描述很好的蠕变行为smmc - 7721细胞,而且还抑制过高的机械性能由于基质效应。

1。介绍

活细胞的粘弹性性质的测量可以提供重要信息的生物力学影响药物治疗,疾病和衰老。迄今为止,各种测试技术被用来测量生物细胞的粘弹性力学性质,例如,微量吸液管愿望(1),原子力显微镜(2),光学镊子(3,4),和磁性镊子5]。与其他技术相比,AFM有许多优点,如与样品直接交互,灵活地选择探测类型,方便成像单元的表面形貌。然而,AFM-based量化生物力学属性的需要一个合适的流变模型可以描述细胞的事实情况缩进。虽然赫兹接触模型经常被用来解释实验数据获得的AFM缩进,它的一个主要的假设,也就是说,将缩进细胞视为半无限空间,可能与电影形态的细胞在远离本国环境(6,7]。从这个意义上说,细胞属性的估计会受到硬基质的影响。如果不占,基质效应会导致高估的测量参数8- - - - - -10),例如,弹性模量、粘度和扩散。在这方面,有必要开发一个有效的手段来形容在细胞缩进膜厚度的影响。

缩进的薄层一般由球形硬度计压头一直研究在文献中使用繁琐的数值计算或分析建模(11- - - - - -14]。从这个意义上讲,Dimitriadis et al。15)采用了一个成像方法提供一个方便的校正赫兹模型和弹性薄膜受球形压痕。在此基础上修改,AFM测量球面提示成为常用的实验方法量化细胞传播的力学性能(6,16]。球形压头,测量力学性能只代表一个样本的平均响应,而信息的功能比规模小的硬度计压头会丢失(8]。此外,尽管Dimitriadis模型已被修改描述锥形尖端缩进(8,9],存在不一致和不均匀性之间的乘法校正因素提供的这些研究。在这方面,必须开发一个普遍校正赫兹接触模型占薄层的缩进,无论大小或硬度计压头的概要文件类型。

在这项工作中,我们使用线性弹性理论来开发一个新的修正Sneddon的解决方案(17锥形压痕在薄层),可用于改善评价nanoindentation的扁平细胞的粘弹性性质。同时,执行一个AFM-based蠕变试验对人类肝细胞癌(smmc - 7721细胞),是全球最常见的癌症类型之一,及其fullerenol-treated同行。目前的有效性模型证明了拟合实验数据。提取的粘弹性参数的修正模型比较的值取决于传统却的解决方案来验证本模型可以处理衬底的效果。此外,确定正常smmc - 7721细胞的粘弹性性质不同于fullerenol-treated同行,这表明生物力学参数取决于我们修正模型也可以作为生物标志物来评估fullerenol或其他抗癌药物对细胞的影响,从而可以代表了潜在的癌症恶化的一个至关重要的部分。此外,值得注意的是,测量粘弹性模量的绝对值细胞被证明是一个强大的工具来量化细胞内支架(即突变的影响。,肌动蛋白皮质)[18]。压痕深度的semianalytical依赖时间,这在实际应用更方便。我们所知,目前的研究代表了第一次尝试将线性弹性理论应用于细胞扁平的量化其粘弹性性能。

2。理论模型

2.1。制定弹性薄膜由一个刚性圆锥尖缩进

考虑刚性圆锥的轴对称接触问题在一个弹性层如图1。层完全是连着的刚性衬底界面硬度计压头之间的接触和这部电影被认为是无摩擦。圆柱坐标 使用如图1原点,恰逢圆锥的母线之间的重叠点和上表面未变形的层。在这些假设下,位移边界条件由 和压力边界条件组成的 在哪里和分别是正常和切向应力分量,然后呢Ψ(r)表示轴对称硬度计压头的形状。自变形层受到法向力是轴对称,径向位移和垂直位移是独立的箍协调吗φ他们满足场方程的线性弹性理论(19)均匀,各向同性材料,给出 在哪里 位移矢量,ν表示泊松比代表了梯度算子。

轴对称接触问题的解决在图1可以得到解决的Papkovich-Neuber位移矢量的分量的表达解决方案 和压力向量 在哪里 谐波函数被称为Boussinesq-Papkovich势函数(20.),表示剪切模量。自溶液混合边界条件下的应力和位移开发了许多研究[21,22),它的详细推导过程不是重复在这项研究。在此,我们直接制定压痕力的依赖和压痕深度δ在接触半径作为 分别在哪里 和和(τ)的解决方案是第二类弗雷德霍姆积分方程如下: 分别为, 如果无量纲参数 介绍了(6)和(6 b)可以写成 分别。第二种的两个弗雷德霍姆积分方程可以得到解决,通过数值方法对于一个给定的值一个/h和ν。由于生物细胞总是视为不可压缩,泊松比ν= 0.5,因此这三个无量纲参数只是依赖一个/h。应用数字技术(后7一个)和(7 b),χ和ψ解决和拟合多项式最小二乘法,作为制定 分别绘制在图的拟合结果2。消除在(10)和(10 b)可能导致

2.2。粘弹性的情况

可以模拟材料的粘弹性行为标准固体(23),如图所示3。它由一个弹性的弹簧,描述了一种瞬时弹性变形,放置在串联与并联的组合弹簧和阻尼器,描述了一个延迟弹性变形。压力应用于弹簧元件正比于它的压力 ;也就是说, ,而压力对阻尼器元素其应变率成正比;也就是说, 。系数和分别表示弹性模量和粘度。图中所示的宪法3,相应的本构关系 在哪里和表示两个弹簧常数。如果压力亥维赛单位阶跃函数吗 ,相应的输出应变称为蠕变柔量 ,作为 在哪里 ,称为特征滞后时间对应于这段时间样品变形 (或63.2%)总数的蠕变变形。它可以看到从(14), 和 。因此,标准固体模型的瞬时弹性模量=和平衡模量 。它应该指出标准固体模型是一个相对通用模型,它涵盖了两种极端情况。例如,当 ,图3降解的弹簧与减震器(开尔文模型)而为 ,标准固体模型减少了弹簧与减震器系列(麦克斯韦模型)。

粘弹性的情况下,李和Radok [24和停25线性粘弹性布西涅斯克问题)提供了一个通用解决方案(一个无限半空格缩进到任意形状的刚性,轴对称,和无摩擦打孔)只要接触半径是不减少的共同方法增加。根据他们的理论,用弹性模量却与modulus-displacement卷积在时域的解决方案会导致接触半径之间的关系和应用力(26,27] 星号表示卷积;也就是说, 双方进行拉普拉斯变换(16)的收益率 如果F(t)被认为是亥维赛阶跃函数 进行拉普拉斯逆变换(18)的结果 另一方面,含缩进和接触半径也有相关的(10 b);也就是说, 因此,压痕深度的依赖时间可以得到解决(19),用到(20.),这是准备配件δ- - - - - -t实验得到的曲线。

3所示。材料和方法

验证当前模型,AFM-based蠕变测试一直在进行smmc - 7721细胞。

3.1。细胞的准备

smmc - 7721细胞后被重新被冷冻在冰箱和孵化在罗斯威尔公园纪念研究所——(RPMI - 1640媒体有10%的胎牛血清(的边后卫)和抗生素(penicillin-streptomycin解决方案)。协议对smmc - 7721细胞的文化和fullerenol治疗已经详细描述了在其他地方(28]。

3.2。原子力显微镜

在这项研究中使用的AFM的模块是JPK NanoWizards 3生物科学(德国柏林),并安装在一个倒置光学显微镜(奥林巴斯IX71;日本东京),同时允许AFM和光学显微镜成像。悬臂的标准选择的合规悬臂样本的范围内应该遵从性。非常柔软和脆弱的细胞,最柔软的悬臂弹簧常数从0.01到0.06 N / m (JPK应用注意)。缩进之前,弹簧常数AFM悬臂的校准。氮化硅悬臂梁,其弹簧常数为0.059 N / m校准后,被用于cell-tip缩进在这工作。探测器是一个平方金字塔尖的半开的角 (半张角面对),其半径和高10 nm和4μm,分别可以看到数据4 (c)和4 (d)。

图4(一)示意图显示金字塔尖的位移沿距离δ半空间内材料创建一个tip-material接触面积,这是由接触深度 。自从AFM悬臂顶端是一个金字塔,投影面积tip-sample接触表面的不是圆形的,也就是说,不是轴对称。然而,数值分析(29日,30.)表明,图4(一)可以近似圆锥压头之间的接触和衬底材料如图4 (b)可以忽略的误差为0.012,只要圆锥给相同的投影area-to-depth比率一个/h的金字塔。在这方面,半开的角度β圆锥= 27.75°的为了留住area-to-depth金字塔图所示的比例是相同的4(一)。

3.3。加载方法

材料的粘弹性性质的确定通常是意识到的蠕变响应规定的负载。压痕力的加载方法见图5是实现单个细胞的蠕变试验。图5(一个)描述了实际加载历史,可以近似亥维赛阶跃函数如图5 (b),只要加载时期(阶段(I))小于十分之一的居住期(阶段(2))11]。在目前AFM-based蠕变试验、蠕变试验进行了恒力延迟模式,力达到最大值(2神经网络)和驻留在0.25秒内峰值为5秒。

4所示。结果和讨论

4.1。细胞地形分析

优先考虑蠕变试验,AFM的接触模式用于地形成像的细胞。AFM的偏转控制(图的图像6(一)(图)和治疗细胞6 (b))获得的实时成像模式下AFM接触。大多数的控制细胞形状的多边形(图6(一)),被fullerenol治疗后,smmc - 7721细胞表现出明显的变化从多边形到航天飞机,如图6 (b)。此外,AFM偏转成像还可以使我们能够研究单个细胞的高度分布。3 d细胞地形数据的视图6 (c)和6 (d))表明,控制和治疗细胞传播在衬底之上,进一步证实了直方图(数字6 (e)和6 (f))的像素值的狭窄范围表明,细胞相当平坦。统计分析细胞的高度和表面粗糙度的控制和治疗细胞图所示7。fullerenol治疗后显著增加的平均身高可以观察到尽管没有明显的表面粗糙度的变化之间的两种类型的细胞。

4.2。蠕变试验曲线分析

虽然弹性模量是经常用来描述生物细胞的力学性能,它没有提供一个完整的描述。它可以看到从蓝色的大胆的曲线在图8下的细胞表现出时间变形不变的缩进;即细胞蠕变。因此,它是更合适的治疗细胞粘弹性。细胞的力学响应的作用力范围几秒钟的时间尺度,这是非常缓慢而加载时间。因此,细胞的机械反应分为两个部分:一个瞬时弹性响应和延迟弹性响应由于蠕变变形。在这项研究中,标准固体粘弹性理论模型是用来描述细胞的力学响应,它的特点是三个参数:瞬时弹性模量 ,平衡系数E_∞和粘度η引入了(13)和图3。自smmc - 7721细胞传播像电影分析部分4.1,目前接触模型开发的部分2是合理的拟合过程中,缩进点的局部厚度估计的AFM偏转成像函数所部分4.1。比较的目的,却把解决方案也用于拟合的细胞被视为半无限空间。我们发现适合这两个模型的蠕变数据很好不管细胞类型,可以看到在图8,确定系数接近1 (≥0.93)。

4.3。细胞粘弹性性质

控制和治疗细胞的粘弹性参数测定根据却把解决方案和目前的模型,及其平均值呈现在图9。在目前的模型,细胞厚度的价值是由AFM偏移成像。可以看出三个参数由目前的模型低于由却把解决方案,无论细胞类型,这表明目前的模式却可以缓解过高的生物力学性质的解决方案。

从图9,它还可以看到细胞治疗的平均弹性模量和粘度控制细胞相比表现出递减趋势,无论哪个模型采用。具体地说,控制细胞有显著提高 瞬时弹性模量和粘度比的瞬时弹性模量和粘度对细胞,而控制细胞的平衡系数略高,其治疗。先前的研究已经报道,弹性和粘度都是由肌动蛋白的水平和组织状态严重影响皮层(31日]。由于肌动蛋白皮质转化为肌动蛋白聚合和不规则地分布在细胞被fullerenol(治疗后32],我们推断这个变换的肌动蛋白皮质诱导smmc - 7721细胞的粘弹性参数的变化。

在我们的研究中,我们把细胞作为一个均质材料,因此目前全球量化相当于细胞的粘弹性性质。我们承认同质的假设是一个限制在我们目前的工作中,和非齐次模型将更多的细节。例如,Feneberg et al。33)测量剪切弹性细胞围绕利用磁性镊子技术,这是很重要的提供洞察细胞信封或细胞质的结构。

4.4。验证和比较

为了进一步验证能力的模型在减轻基质效应,提出了一种测试在不同高度的区域的细胞阐述如下。如图10 (),我们选择任意相交的表面和情节的变化细胞高度沿切割路径。沿着路径和压痕蠕变测试执行深时曲线拟合的模型。瞬时弹性模量的变化(模量)和平衡沿切割路径绘制在图10 (c)和10 (d),分别。在核心区域( μ米),确定弹性模表现出一致性,表明材料均匀性。在原子核周围地区( μm和 μ米),存在肌动蛋白丝网络在细胞机械稳定性起着关键作用,因此我们观察这个地区增加弹性模量。在细胞的边缘( μm和 μ米)的弹性模量降低,因为肌动蛋白丝的密度下降。在所有地区,却把解决方案导致更高的弹性模量相比,目前的模型。在细胞核中地区当地的厚度高,比例 很低,从而得到低价值的校正因子(12),导致几乎等于弹性模量预测的两种模型。基质效应成为重要的边缘地区,乘法因素主导的地方(12)。

5。结论

在本文中,我们首先介绍了目前基于薄膜的接触力学模型,这个模型解释背后的扁平细胞受到AFM缩进。缓解当前模型的主要假设的半无限空间经典却把解决现实形态的细胞。之后,该模型扩展到粘弹性宪法,以反映细胞的粘弹性性质。AFM-based蠕变试验进行了验证目前的模型。smmc - 7721细胞的地形成像证实细胞表现出形态夷为平地,证明了本模型的应用。拟合结果表明,本模型不仅可以描述很好的蠕变行为smmc - 7721细胞,而且还避免了过高的弹性和粘度特性的薄膜衬底效应所致。于此,我们占高估的抑制当前模型的校正因子。此外,目前的模型可以确定smmc - 7721细胞的变化及其fullerenol-treated对应的提取的粘弹性参数,揭示了其指导意义在理解fullerenol-induced影响癌细胞的粘弹性性质和潜在的抗癌药物的fullerenol应用程序。

信息披露

一个抽象的版本的手稿是ICBCBBE 2018: 20国际会议上生物信息学、计算生物学和生物医学工程。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突在本研究。

确认

作者感谢实验室的技术支持精密工程和表面华威大学的国际研究中心纳米处理和制造业,长春科技大学。这个项目已经被欧盟的部分资助下地平线2020研究和创新计划没有玛丽Skłodowska-Curie授予协议。644971年,FP7 MCA-IRSES之下(612641),和中欧研究项目(S2016G4501)。

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