文摘

的制备和观察球形体W303描述细胞与环境扫描电子显微镜(整体)。球形体转换成功证实了定性的评价之间的形态改变正常W303细胞原生质球W303细胞,定量,通过确定球形体转换百分比基于OD800年吸光度数据。从光学显微镜观察正如预期的那样,正常细胞有一个椭圆形而原生质球细胞像一个球形。这也证实了在四个不同的媒介,也就是说,酵母peptone-dextrose (YPD),无菌水,sorbitol-EDTA-sodium柠檬酸缓冲(SCE)和sorbitol-Tris-Hcl-CaCl2(CaS)。也观察到,南加州爱迪生公司和中科院媒介有较高数量的球形体细胞相比YPD和无菌水介质。的OD800年吸光度数据还显示,整个W303细胞被完全转化为球形体细胞大约15分钟后。正常的观察和原生质球W303细胞然后下进行环境扫描电子显微镜(整体)。正常细胞显示细胞表面光滑而损失后的球形体细胞表面有bleb-like当去除细胞壁的完整性。

1。介绍

多年来,传统的扫描电子显微镜(SEM)作出了很多贡献的成像材料的详细描述他们的结构和表面1- - - - - -4]。然而,需要高真空操作环境和复杂的生物样品和样品制备步骤使应用程序标本不利(5- - - - - -7]。环境扫描电子显微镜(整体)克服了许多缺点在SEM和引入了一个新发现的优势在生物研究(8- - - - - -11]。这个工具的能力在湿和气态大气层由导电绝缘的样本,从而克服涂层样品之前需要描述和保存原始样本特性进一步测试和操作(12- - - - - -14]。此外,控制水蒸气压力的能力在显微镜下操作保持样品水分的时候,这就增加了存活的机会(15,16]。

最早的实验生物标本是由柯林斯et al。17]。他们解释了使用整体微生物的应用及优势。整体发现其潜力在组织工程和生物材料研究中,因为它支持细胞的观察及其地形水化大气压(18]。此外,减少样品制备步骤是有用的为研究哺乳动物细胞和生物材料相互作用[5,19- - - - - -23]。柯克等人已经拍摄出哺乳动物细胞使用整体表现出非常精致的细节特征,如丝状伪足和膜褶边24]。他们还表明,细胞存活的初始阶段样品制备,但经历了一些损害在脱水阶段。他们建议细胞细胞壁较强可能会反映在他们的生活状态。

整体的主要标准之一是生物细胞的现实生活观察和监视。这可能是一个优势通过集成工具,如nanomanipulators或膜片箝分析细胞和他们的特点而进行实验。从我们以前的工作,nanomanipulator成功整合内部整体(图1)各种单细胞操纵和表征25,26]。


图1
Nanorobotic机械手的整体。

整体的一个潜在应用是研究细胞的离子通道电流测量膜片钳系统相结合。传统的平面膜片钳系统需要洗澡方案执行测量。然而,这可能导致出现测量错误,因为浴溶液化学性质之间的差异和细胞内细胞质27]。去克服,而不是使用浴方案,电极可以注入到细胞和细胞质可以作为介质的电流在当前记录。球形体是一个早期的步骤在离子通道的测量实验28]。因此,为了执行整体内膜片钳实验中,重要的是要证实的能力整体观察细胞原生质球成功进一步操作之前执行。

纳米操作是一种有效的战略描述单个纳米尺度物体的基本性质和构造纳米设备迅速和有效。我们构造了一个混合nanorobotic操纵系统集成与透射电子显微镜(TEM) nanorobotic操纵者操纵(TEM)和扫描电子显微镜(SEM) nanorobotic操纵者操纵(SEM) [29日]。这个系统允许有效的样品制备在SEM与广泛的工作区域和多自由度(自由度)的操作。它有高分辨率的测量和评估样本在TEM能力。这些电子显微镜的样品室设置在高真空(高压)条件下降低电子束的扰动观测。例如,观察样品含有biocells,另外需要干燥处理流程。因此,含有的直接观察样品在这些电子显微镜通常非常困难。

在目前的研究中,我们使用了nanorobotic机械手在一个整体(30.]。它已经由3单元和7自由度(自由度)在总(图1)。含有样品的整体不允许直接观察纳米高分辨率由专门建造第二电子探测器。水的蒸发由两个样品的温度控制(0-40°C)和样品室压力(10−2600 Pa)。样品的温度由冷却阶段控制单元(单元3)。机械手的详细规格和整体不可以从我们之前获得文献[31日]。下面的实验已经通过这个系统。W303细胞的观察和比较,原生质球W303被成功使用整体不执行。球形体W303细胞通过酶消化细胞形态学的比较证实了定性的细胞和原生质球细胞之间和定量,通过OD800年吸光度数据。打开成功的球形体的观察细胞的可能性在单一离子通道电流测量新方法。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

野生型酵母细胞(W303菌株)被用于光学显微镜下观察和测量和整体系统。YPD的W303细胞培养板(葡萄糖、蛋白胨酵母提取物1%,2%,2%和2%琼脂)37°C孵化器48小时。一个殖民地当时从培养板,然后浸入管包含10毫升YPD媒体。地铁然后孵化一夜之间在30°C 200 rpm。的OD600值用分光光度计测量样本和样本OD600值在0.2和0.3之间用于球形体。

2.2。制备W303原生质球

原生质球准备用毕赤酵母原生质球包。总之,对数增长W303野生型酵母细胞(OD600年值在0.2和0.3之间1毫升的文化在6000 rpm)被离心收获5分钟30°C,然后用1毫升无菌水清洗。细胞颗粒状在6000转离心5分钟30°C。

细胞颗粒被resuspending洗1毫升的SED缓冲区包含1 M山梨糖醇,25毫米EDTA pH值8.0,1米二硫苏糖醇然后在6000转离心5分钟30°C。细胞然后用1毫升1 M山梨糖醇洗净,在6000转离心5分钟30°C。然后,他们被旋转resuspended 1毫升的SCE介质。一个3μZymolyase, L的细胞壁水解酶是添加到细胞中。细胞培养在30°C约1小时。原生质球是用1毫升的山梨糖醇,离心收集的6000 rpm 5分钟30°C。他们然后resuspended 1毫升的CaS。

一个示意图说明球形体转换呈现在图2。在第一阶段,变成了prospheroplasts W303细胞。一端prospheroplasts被挤压,部分细胞壁发生消化(数字2(一)-2(d)),保持它的形状,尽管明显失去支持。在第二个阶段,prospheroplasts迅速转化成球形体,球形成为占主导地位的人物2(e)和2(f))。


图2
两个阶段的示意图说明球形体的形成。(一)——(d)、细胞变成prospheroplast。球形体的外观可以看出当prospheroplast变化成一个球形((e), (f))。
2.3。W303原生质球由光学显微镜观察

原生质球细胞中观察到四个不同的媒介:YPD,无菌水,南加州爱迪生公司和中科院ix - 71使用奥林巴斯光学显微镜在室温(20 - 25°C)×100年油浸物镜。最初的1毫升细胞原生质球在CaS中被整除为四个微型离心机管。第一个能整除的是里面的球形体CaS的媒介。其他三个整除在6000转离心5分钟在30°C和CaS上层清液完全被抛弃了。里面的球形体丸三种管子然后resuspended 250μL YPD媒体,250年μL无菌水,250μL (SCE介质,分别。

2.4。通过整体W303球形体的观察

整体系统可以进行直接观察的样本含有纳米高分辨率,专门建立了二次电子探测器。水的蒸发控制通过调整样品的温度(~ ~ 0 - 40°C)和样品室的压力(10 - 2600 Pa)。样品的温度单位是由冷却控制的阶段,也就是说,叫,如图1。整体系统有能力控制从高真空室的压力(~ 10−4Pa)高湿度(10 - 2600 Pa)。机械手的详细规格和整体不可以从我们之前获得文献[26]。nanomanipulator有钨探针,用于传输使用附着力的单个细胞。这个力是微探针与细胞之间产生。事实上,nanomanipulator系统可以控制单个细胞的位置。

3所示。结果与讨论

3.1。光学显微镜下细胞形态

数据3和4W303细胞的形态学显示比较之前和之后的球形体在四个不同的媒介:YPD,无菌水,南加州爱迪生公司和中科院。从W303细胞的形态学观察,在所有四个媒介有一个椭圆形。





图3
W303细胞的形态在四个不同的媒介:(一)YPD, (b)无菌水,南加州爱迪生公司(c)和(d)中科院。比例尺是5μm。




图4
球形体的形态W303细胞在四个不同的媒介:(一)YPD, (b)无菌水,南加州爱迪生公司(c)和(d)中科院。箭头标记被添加到显示细胞原生质球的位置在前两个媒介,也就是说,YPD和无菌水。比例尺是5μm。

YPD媒介提供最好的生活中细胞,其次是无菌水,南加州爱迪生公司和中科院媒介(数字3(一)-3(d))。数量的减少W303细胞SCE和中科院媒体相比YPD(葡萄糖、蛋白胨酵母提取物1%,2%,2%和2%琼脂)是由于酵母提取物的缺失。酵母提取物通常包含所有必需的氨基酸的增长。图4显示了球形体的形态细胞内四个四个媒介。很明显,显示的球形体细胞球形内所有的媒介。然而,条件和可见性的细胞内YPD和无菌水介质很穷而南加州爱迪生公司和中科院介质(数字4(一)-4(d))。原生质球酵母细胞的球形也报道了(32]。

3.2。球形体转换百分比基于OD800年吸光度数据

原生质球细胞的百分比转换可以确定从以下方程:

图5显示了OD值800年50分钟吸光度数据及其对应的球形体转换比例。从图,结果表明,细胞迅速改变成球形体细胞;85%的细胞转化为球形体在2分钟后消化的酶。整个W303细胞完全适应球形体条件15分钟。从这个数据,结果表明,原生质球实验是成功实现。


图5
的OD800年吸光度数据及其对应的球形体转换比例为50分钟的治疗使用酶消化;Zymolyase, W303细胞。
3.3。W303细胞原生质球的表面特征W303细胞在整体中

图6显示细胞的表面拓扑结构在整体中。观测进行30 kV和100年μ答:环境参数设置600 Pa和0°C。整个细胞内保持YPD介质,用蒸馏水稀释。从观察,W303细胞非常光滑的表面可以看到(前视图(图6(一)),侧面视图(图6 (b)视图(图),并关闭了一边6 (c)))。这也证实了在以前的文献[25,26]。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图6
表面拓扑W303细胞在一个整体的不同观点:(a)顶视图,侧视图(b)和(c)收盘上涨侧视图。

图7代表了表面拓扑结构下的球形体细胞一个整体。第一次球形体的观察细胞进行,无需复杂的样品制备和样品涂层。这将确保球形体细胞的生存能力,使进一步进行描述和分析。正如预期的那样,拓扑的球形体细胞表面不光滑的细胞具有细胞壁。细胞壁的意义作为一个细胞牛头刨床高度承认从这些观察。除了非光滑表面拓扑,原生质球细胞经历了一些减少大小顶视图中可以看到球形体细胞(图的形象7(一))。从侧面视图图像(数字7 (b)和7 (c)),注意到有几个气泡表面结构。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图7
球形体的表面拓扑W303细胞在一个整体从不同的观点:(一)顶视图,侧视图(b)和(c)收盘上涨侧视图。

4所示。结论

的优点综合ESEM-nanomanipulation系统依靠其能力进行原位当地生物样品的直接观察和操纵和控制环境条件的能力。球形体的观察事先为电子显微镜观察涂层已经强调了这项工作。我们所知,这工作是第一个尝试电子显微镜下观察细胞原生质球不需要样品涂层。球形体是验证定性、定量光学显微镜下观察细胞的形态变化的观察和球形体转换百分比基于OD800年吸光度数据。球形体细胞呈球形,而正常细胞的椭圆形。电子显微镜观察了bleb-like球形体的表面比光滑表面的正常细胞。这项工作可能会延长执行单一离子通道电流测量的球形体W303细胞内ESEM-nanomanipulation系统。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究是由马来西亚的高等教育(批准号。4 l640 4 f351)和马来西亚各种大学(批准号。03 e11、03 g47 02 g46, 03 h82,和03 h80);作者感谢他们资助这个项目和无尽的支持。此外,他们要感谢名古屋大学领导人Toshifumi Inada教授提供的W303年酵母细胞污渍。