文摘
这项工作的目的是利用扫描电子显微镜(SEM)研究氨苄青霉素治疗的效果大肠杆菌生物膜上形成两种不同性质的表面材料,有机硅(硅)和玻璃(GLA)。显微数字化(EM)最初是用来评估生物膜的形成,造成效率两个表面上。这种技术显示,获得了较高的细菌殖民化的疏水硅比亲水的杯子。它也表明,更高的生物膜失活是获得抗生素治疗后的杯子(7-log减少和降低1-log SIL)。由于其高分辨率和放大,SEM启用详细分析抗生素影响生物膜细胞,补充杀害他们获得的信息效率。SEM显微图显示ampicillin-treated细胞有一个细长的形式相比,未经处理的细胞。此外,它表明,不同材料诱导不同级别的伸长细胞暴露于抗生素。生物膜上形成杯子显示比上形成伸长SIL高出37%。重要的是,细胞伸长是氨苄青霉素以来相关可行性对GLA-formed生物膜有较高的杀菌效果。这些发现增加的可能性,使用扫描电镜对理解抗菌治疗的疗效观察生物膜的形态。
1。介绍
细菌和其他微生物往往附着在固体表面生长和产生胞外聚合物(EPS)的物质,形成生物膜(1,2]。生物膜对公共卫生构成一个严重的问题特别是由于他们可能造成感染患者留置医疗设备(imd) [3,4)和阻力的增加biofilm-associated微生物抗菌药物(5]。
在IMD细菌殖民化和随后的生物膜的形成是动态的和复杂的过程强烈粘附表面性质的影响。某些材料在imd的设计更容易比其他细菌粘附/生物膜的形成。表面特征确定特定材料的粘附特性包括表面自由能、电荷,疏水性和粗糙度6]。细菌细胞,细胞表面疏水性,通常吸引许多生物材料的疏水表面目前用于imd,如硅胶(7]。虽然硅胶相对更容易细菌附着,生物膜的形成,非特异性粘附的蛋白质,比其他许多聚合物和生物分子,通常用于尿导管、隐形眼镜,隆胸手术,气管内管,和语音假肢8,9]。
生物膜根除从生物医学设备是困难主要是由于他们的抵抗抗菌药物。一旦感染,imd通常移除和替换,导致显著增加卫生保健费用和再感染的机会10]。相当大的研究努力目前指向生产抗感染和antiadhesive设备或植入物通过(a)改性的材料表面特征(等离子体和刷子),(b)抗感染药物绑定到材料表面(银、季铵化合物、合成抗生素和生物表面活性剂),或(c)释放可溶性有毒代理人(洗必泰、抗生素)到IMD环境(11,12]。
一些医疗设备,是用不同的材料做不同部分由过渡海豹。这些过渡区为细菌粘附和生物膜发展尤其具有吸引力。这种类型的mixed-surface设备在牙科(13],整形[14),和心血管植入物(15]。例如,食品药品管理局批准使用腹部(16)和冠状动脉支架(17]部分聚合物和金属材料。
当前的知识关于生物膜由于显微成像技术的进步。标准光学显微镜、荧光显微镜数字化(EM)和共焦激光扫描显微镜(样品形貌)是最常用的生物膜的技术分析。然而,扫描电子显微镜(SEM)已被证明是一个合适的工具不仅详细观察基础形态,但也遵循非生物表面细菌粘附和生物膜的形成。的确,电子显微镜已经从小用于检查和描述医疗器械的生物膜(18,19),目前它已经发展的有用antibiofilm材料为生物医学应用(20.- - - - - -22]。扫描电镜分辨率放大和必要使观察生物膜的微生物组成的整体形状,以及他们的空间组织23,24]。这种类型的扫描电镜所提供的空间分析是一个有趣的方法来评估混合表面生物膜的增长(有两种材料之间的连接),与传统的方法提供了一种量化。虽然SEM不是兼容使用荧光染料,如Syto9和propidium碘,通常用于区分可行的和不能存活的细胞在新兴市场,它使的详细观察单个细胞在生物膜及其形态25,26),反对他们缺乏所需的放大倍数和分辨率。
生物膜控制医疗设置是一个困难的挑战,尤其是在imd殖民表面不容易访问(27,28]。成功在这场战争中对生物膜需要深入了解生物膜细胞之间的相互作用,表面上看,抗生素,和主机27]。这项工作表明,利用扫描电镜对高分辨率成像的殖民表面可以提供宝贵的信息对抗生素治疗性能的表面性质的影响。了解这些影响可能提供线索的微调表面性质在生物医学材料以增加抗菌治疗的效率。
2。材料和方法
2.1。菌株和文化条件
大肠杆菌JM109 (DE3) Promega(美国)是本研究中使用,因为这种应变表现出良好的生物膜形成能力在湍流(29日,30.和层流31日)流条件和不同的生物膜平台(30.- - - - - -32]。准备一个细菌悬液接种500μL甘油的股票(保存在−80°C)总量的0.2 L的接种中先前所描述的Teodosio et al。29日]。这个由葡萄糖5.5 g / L, 2.5 g / L蛋白胨和1.25 g / L酵母提取物在磷酸缓冲(1.88 g / L KH2阿宝4和2.60 g / L Na2HPO4),pH值7.0。这种文化是生长在一个1 L shake-flask孵化隔夜37°C的风潮。随后,细胞被离心收获(320210分钟)和悬浮在Mueller-Hinton肉汤(默克公司、德国)删除所有隔夜生长介质的痕迹。细胞被离心再一次收获,悬浮在Mueller-Hinton肉汤为了获得一个包含大约1×10的培养液7细胞/毫升。
2.2。表面制备和表征
广场1厘米的优惠券2由玻璃(GLA, Vidraria Lousada, Lda,葡萄牙)和有机硅(硅,七巧板&七巧板,Lda,葡萄牙)准备。他们用的溶液洗净5% (v / v)商用洗涤剂(Sonasol Pril,德国汉高Iberica S.A.) 30分钟,然后冲洗在超纯水删除任何剩余的洗涤剂33,34]。后用电吹风的表面1 h,他们沉浸在96% (v / v)乙醇为30分钟的杯子和10年代的硅(35]。然后,杯子优惠券在121°C(热压处理过的15分钟33),而银券在70°C(热压处理过的20分钟34]。
表面的水接触角()被液滴方法自动确定接触角仪(15 +亚奥理事会,Dataphysics,德国)。每个材料的测量在三个独立的实验进行了至少25决定在每个表面。
2.3。生物膜的形成
每个的无菌12-well聚苯乙烯(PS),平底的微量滴定板包含优惠券(橙色科学,美国)充满了2毫升的先前准备的细胞悬液(细胞在Mueller-Hinton肉汤/毫升)。促进生物膜的形成,板块在37°C的环境没有摇晃24 h。24小时点被选中,是因为先前的研究表明大肠杆菌硅胶制成的生物膜上形成尿导管完全开发的24小时(36]。
2.4。生物膜的易感性
在这项研究中使用的抗生素是氨苄青霉素(AppliChem、德国),这是一个β内酰胺抗生素函数通过阻断特定细胞壁中的交联步骤生产。这种交联失败产生微弱的细菌细胞壁,不能维持细胞质,诱导细胞溶菌作用[37]。
生物膜暴露在5生物膜麦克风的氨苄青霉素(250为7.5 h和g / mL)优惠券每个材料的分析每1.5 h。不依从细胞被沉浸在无菌生理盐水清洗的表面(8.5 g / L氯化钠)。为了resuspend和同质化的无柄细胞,清洗表面涡在10毫升的盐溶液在1分钟(38]。总水平细胞清除的优惠券是评估通过直接染色的未经处理的生物膜4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) [39之前和之后)涡流量化剩下的细胞。这个效率是95%,杯子为94%,银网上优惠券(见补充材料https://doi.org/10.1155/2017/2960194)。细胞生存能力评估、悬浮细胞被沾住/死®(L / D) BacLight™细菌生存工具包(Syto9 /碘化propidium,英杰公司生活技术,Alfagene,葡萄牙)(40]。10分钟后观察细菌进行孵化与荧光染料在黑暗中使用徕卡DM LB2荧光显微镜数字化连接到一个徕卡DFC300外汇相机(瑞士徕卡微系统有限公司)。可行的和(可行加上不能存活的)细胞总数估计在每个膜从项至少20字段的视图和生存能力获得的结果表示为一式三份样本的均值在三个独立的实验中测量日志可行的细胞/厘米2。
2.5。扫描电镜
细胞的形态大肠杆菌生物膜在玻璃和硅优惠券6 h的抗生素治疗前后被SEM评估。观察之前,生物膜样本固定使用3% wt。戊二醛在甲次砷酸盐缓冲液pH值7.2 (41]10分钟和暴露于乙醇脱水系列50,60岁,70年,80年,90年和2×100% (v / v)乙醇,其次是一系列化学脱水100%乙醇+ hexamethyldisilazane(美国Ted斗篷hmd)在50岁,60岁,70年,80年,90年,HMDS 2×100% (v / v) (42),在每个浓度为5分钟。裸露的表面也遭受同样的脱水治疗。所有的优惠券都干1天,sputter-coated palladium-gold薄膜(43]。裸露的表面和生物膜样品被认为与SEM / EDS系统(范广达400 feg整体/ EDAX创世纪X4M,范公司,美国)在高真空模式15千伏。在生物膜样品的情况下,二十图像从三个独立的优惠券的抗生素治疗之前和之后进行分析。范显微镜软件(xT显微镜控制、公司、美国)是用来确定细胞长度通过测量100随机选择的细胞在每一个条件。
2.6。统计分析
敏感性分析是比较使用单向方差分析(方差分析)基于置信度99%(据报告差异显著值< 0.01)。配对以及分析也在适当的时候进行。
3所示。结果
表面的水接触角测定与杯子和获得的价值(°)是小于一个获得硅(°)。
显微数字化是用来量化两个杯子上的生物膜形成和抗生素敏感性和硅表面。硅表面增强了生物膜的形成(16%)相比,玻璃(7×107与6×107细胞/厘米2,24小时后)生物膜的发展。图1介绍了磁化率曲线大肠杆菌生物膜上形成两个材料浓度相当于5×生物膜麦克风的氨苄青霉素。可行的细胞的数量保持不变的材料在实验前3 h,但从这一刻开始,生物膜上形成的可行性杯子明显减少,减少7-log 7.5 h后得到治疗。生物膜上形成硅更耐氨苄青霉素比形成在杯子上,减少只有1登录的可行的细菌(图1)。
SEM是选择方法分析裸表面和形态变化对固着细胞暴露于氨苄西林(图2)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
裸露的表面的显微图显示,杯子是一个非常光滑的表面(图2(一个)),而硅是一个相当数量的微尺度的粗糙表面突起,突起(图2 (d))。这些突起的大小是非常变量(20与特性μ米),尽管他们中的大多数超过大小的大肠杆菌细胞坚持硅胶表面(图2 (e))。
关于生物膜的形成,硅材料显示更高的粘细胞(图2 (e)),确认结果通过EM(没有显示)。另一方面,大肠杆菌细胞似乎坚持SIL嵌入EPS(图2 (e)),在反对细胞观察在杯子的表面(图2 (b))排列的形式聚合或简单的个性化细胞没有虚伪的材料在他们的附近。6 h(抗生素暴露后,生物膜细胞坚持两个杯子和SIL优惠券(数字有所下降2 (c)和2 (f)、职责)。此外,SEM显微图显示ampicillin-treated细胞更细长的材料相比,未经处理的细胞,在生物膜上开发玻璃(图2 (c)),细胞治疗的时间比在硅(图2 (f))。有趣的是,在这两种测试材料,固着细胞的细胞壁不表现出严重损害后6 h(氨苄青霉素治疗(数字2 (c)和2 (f))。
测定细胞的长度从SEM显微图导致生物膜的大小分布直方图显示细胞暴露(图3 (b)),而不是暴露于氨苄西林(图3(一个))。而nonexposed细胞坚持两种材料有相似的长度(约1.8μ米,图3(一个)),治疗细胞出现在杯子优惠券更细长(37%)比在硅表面(图3 (b))。此外,抗生素治疗后(图3 (b)),细胞坚持SIL测量在1.3和6.7之间μ米(平均超过46% SIL-untreated细胞),而细胞长度在3.6和9.1之间μm是确定杯子(GLA-untreated细胞平均超过73%)。还发现了更窄的粒度分布的未经处理的细胞,无论材料测试。
(一)
(b)
4所示。讨论
本研究的主要目的是调查不同的表面材料的影响大肠杆菌生物膜的形成和抗生素治疗。接触角的测量表明,杯子是一种亲水表面(),而硅是一种疏水性表面()[44]。
EM和SEM的结果表明,更高的生物膜形成疏水硅胶表面。许多作者(45- - - - - -48)表明,硅是非常容易殖民大肠杆菌,尽管它是广泛应用于生物医学设备。我们的研究结果表明,根据疏水性积极影响细菌粘附,见先前的研究[35,49,50]。除了疏水性,硅表面的不规则性是另一个物理性质,可能导致增加细胞粘附。据报道,在聚合物表面促进细菌粘附和生物膜的形成,与光滑表面,不赞成细菌沉积(51]。这可能是因为粗糙表面具有更大的表面积和粗糙表面的凹陷为殖民提供更有利的网站(52,53]。
对于生物膜的易感性,EM分析表明,生物膜上开发银不太容易比杯子上形成氨苄青霉素。这可能是由于他们的高细胞密度(单位面积上的细胞的数量)和/或EPS相比,生物膜的形成在杯子上。已经显示的空间安排更多的细胞可以创建浓度梯度(抗生素,营养和氧气)在生物膜结构(54),有助于减少抗生素敏感性[55,56]。此外,它被描述的相对有效性一些抗菌药物与细胞密度下降(57- - - - - -60]。众所周知,每股收益也极其重要的保护生物膜细胞从抗生素59,61年],因为在这个工作EPS SIL优惠券只观察到,他们可能导致增加生物膜弹性。因此,可以得出结论,表面性质的杀人效率影响抗菌剂对生物膜,观察到在先前的研究[62年- - - - - -65年]。Gristina et al。62年]表明,细菌殖民化的程度和抗生素耐药性相关的生物材料,可以改变biomaterial-induced表型变化。之后,韦伯et al。63年)发现细菌生长的surface-adherent模式决定了生物膜的抗生素耐药性。有报道称,一些材料负责选择变体粘附细菌与抗生素耐药性增加(64年]。
SEM和补充的目的本研究中使用EM的结果,提供一个更详细的分析抗生素对生物膜的影响。由于其高分辨率和放大,SEM表明生物膜细胞暴露于氨苄青霉素有一个细长的形态。能够很好的证明,抗生素可以影响细菌的方式除了预期的杀菌作用,如诱导形态变化(48,66年- - - - - -69年]。常见的革兰氏阴性细菌的反应的影响β内酰胺抗生素是单个细胞的异常伸长(67年]。这种类型的形态学变化是选择性结合的结果β-lactams细胞表面蛋白组件负责细胞壁鼻中隔形成和分离的两个分裂的生物(66年]。此外,SEM照片表明,不同材料诱导antibiotic-treated细胞不同程度的延伸。我们所知,这个观察从未被描述在文献中。细胞伸长的程度提供了线索细胞容易自氨苄青霉素抗生素治疗更有效的在生物膜形成的杯子,这是最细长的表面材料大肠杆菌细胞。尽管SEM观测不允许独自一个预测分析抗生素的有效性,他们是一个非凡的支持理解复杂的生态系统是细菌生物被膜。
5。结论
通过殖民表面的高分辨率成像,可以得出结论,SEM是一个有价值的工具详细研究抗菌药物对细胞形态的影响在不同的生物膜细菌种群。该方法可能是特别有用的生物医学设备包含混合表面,在成像海豹或过渡区可以提供有价值的线索关于生物膜增长和药敏。理解这种影响可能提供线索为生物医学材料的表面属性的修改策略增加抗菌疗法的疗效。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
这项工作是财政支持项目POCI - 01 - 0145 -菲德尔- 006939(过程工程实验室、环境、生物技术和能源(LEPABE))和由菲德尔基金通过COMPETE2020下Operacional Competitividade e Internacionalizacao (POCI)和由国家基金通过Fundacao para Ciencia e Tecnologia (FCT)。她曾戈麦斯承认博士学位授予的收据FCT (SFRH / BD / 80400/2011)。
补充材料
细胞清除的范围从杯子和硅优惠券由于涡流的95%和94%,安排。