文摘

横纹肌肉瘤(RMS)是最常见的儿科的子集的软组织肉瘤患者的长期临床需求未得到满足。例如,孩子在诊断和肺泡横纹肌肉瘤转移将只有8%的无病生存5年经验nonlocalized不可切除的复发性疾病。因此,开发新型治疗策略是急需改善的结果。Plexin-Semaphorin通路为肉瘤研究很大程度上是未知的。然而,新兴的兴趣Plexin-Semaphorin信号轴在儿科肉瘤导致我合作小组研究的临床试验阶段,现在(NCT03320330)完成。在这项研究中,我们专门研究了跨膜受体的蛋白表达Plexin-B2及其同源SEMA4C配体在临床RMS肿瘤和细胞模型。通过RNA干扰,我们评估的角色Plexin-B2在选定的肺泡细胞生长和细胞迁移能力和胚RMS细胞模型系统。表达我们的结果肯定人性的Plexin-B2样本,同时剖析不同的蛋白质亚基的表达Plexin-B2以及评估首选Semaphorin Plexin-B2的配体。Plexin-B2击倒对细胞生长有积极或消极的影响,不同的细胞模型系统。迁移后化验Plexin-B2击倒透露选择性细胞系特定迁移抑制,这是独立于Plexin-B2表达水平。 Overall, these findings are suggestive of context-specific and possibly patient-specific (stochastic) role of Plexin-B2 and SEMA4 ligands in RMS.

1。介绍

横纹肌肉瘤(RMS)是儿童最常见的软组织肉瘤,占∼5 - 10%的儿童恶性肿瘤(1,2]。主要组织学检查两种亚型的RMS,肺泡(武器)和胚(erm)。手臂亚型是临床上咄咄逼人,转移性在本质上与不利预后[3,4]。尽管技术进步在治疗策略(即手术、放疗和化疗),多个几十年的生存率一直不变(5,6)与长期无病存活率转移武器和erm的8%和43%,分别为(2,5,7]。因此,急需开发新型治疗策略,以提高治愈率。

Plexins是跨膜蛋白受体结合的家庭Semaphorin分子调节细胞功能,如细胞迁移,细胞粘附和入侵8,9]。具体来说,Plexin-B2参与细胞运动性,血管形成,中枢神经系统发展(10- - - - - -12)通过绑定Semaphorin 4 c (SEMA4C)。最近发现报道,Plexin-B2-SEMA4C轴发挥了至关重要的作用在招聘t细胞生发中心和调节抗体反应(13]。超表达Plexin-B2和SEMA4C一直与癌症的预后不良的骨头,乳房,和大脑8,9,14- - - - - -16]。此外,在癌症恶化的背景下,Plexin-B2-SEMA4C信号级联可以增强细胞入侵和迁移通过触发下游效应等途径,ErbB2, RhoA-dependent激酶(17];Le et al ., 2015)。为了更好地理解这种疾病转移,我们开发Plexin-Semaphorin研究信号通路在RMS和阐明这个膜蛋白复合物的作用在疾病进展的背景下。

在这里,我们调查的角色在RMS Plexin-B2-SEMA4s(武器和erm)疾病进展;具体地说,我们研究了压制Plexin-B2对细胞生长和迁移的影响。在我们的研究中,我们肯定的表达Plexin-B2及其同源配体SEMA4C SEMA4D和SEMA4F人类样本。此外,我们仔细了解Plexin-B2和功能意义的亚型Semaphorin配体结合Plexin-B2使用小型干扰rna的Plexin-B2横纹肌肉瘤细胞系的遗传证据的概念。我们的研究结果表明,细胞生长明显减少武器和erm癌症细胞系。有趣的是,沉默Plexin-B2增强细胞生长的细胞培养的主要武器。然而,细胞迁移能力降低细胞系测试只有一个武器,尽管细胞系表达Plexin-B2。这些结果表明潜在的病人可变性在RMS Plexin-Semaphorin信号转导的作用可能不是可预测从Plexin-B2作为生物标志物。

2。细胞培养方法和材料

人类RMS细胞系,Rh3、Rh5 Rh18, Rh30,和Rh41获得儿童癌症库(http://www.cccells.org)和培养在RPMI 1640(热费希尔科学(热),沃尔瑟姆,妈,猫。# 11875 - 093)含10%胎牛血清(热费希尔科学的边后卫,猫。青霉素、链霉素# 26140 - 079)和1%(热,猫。# 15140 - 122)。写明ATCC, RD是来自弗吉尼亚州马纳萨斯(猫。ccl # - 136)和生长在杜尔贝科的修改鹰的媒体(DMEM)(热,猫。# 11995 - 065)补充了青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。主要HSMM细胞系来源于Lonza Inc .)是新泽西州莫里斯(猫。# cc - 2580)和培养在细胞增长媒体应用程序中,圣地亚哥,CA(猫。# 151 - 500)。 SJ-GBM cell line was obtained from Dr. Susan Baker (St. Jude’s Hospital) and was grown in a base medium of Iscove’s modified Dulbecco’s medium (IMDM, Thermo, Cat. #12440061) with 10% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 4 mM L-glutamine (Thermo, Cat. #25030081) and 1x insulin, transferrin, and selenous acid (ITS, Corning Life Sciences, Bedford, MA, Cat. #41400045). PDX explant primary cell culture CF-1 was grown in RPMI 1640 containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin. All cell cultures were maintained at 37°C and 5% CO2. STR analyses of the cell lines are shown in Supplementary Table1。

2.1。siRNA-Mediated Plexin-B2的沉默

为了沉默Plexin-B2, RD, Rh18 Rh30 Rh41, CF-1细胞被播种在2.5×10⁵密度在转染前24小时。细胞转染25皮摩尔(pmol)和50 pmol Plexin-B2 siRNAs或控制siRNAs使用Lipofectamine 3000(热,猫。# L3000001)后,制造商的指示。siRNAs买来Dharmacon(通用电气医疗集团)和序列如下:siPLEXINB2 siRNA1 (GCAACAAGCUGCUGUACGC) siplexin-B2 siRNA3 (UGAACACCCUCGUGGCACU)和ON-TARGETplus新核siControls (d - 001810 - 01)。为了确定击倒效率、蛋白质溶解产物收获了免疫印迹分析和探讨了以下主要抗体:Plexin-B2(研发系统,猫。# AF5329;Abcam,猫。# ab193355;圣克鲁斯生物技术、猫。# sc - 373969), SEMA4C(圣克鲁斯生物技术、猫。 #138445), SEMA4D (Abcam, Cat. #ab134128), and SEMA4F (Santa Cruz Biotechnology, Cat. #125264).

2.2。细胞增殖测定Plexin-B2沉默之后

细胞增殖测定Plexin-B2沉默后执行。RMS细胞serum-starved和播种5000 /细胞密度为96 -孔板(热,猫。# 1360)一式三份。细胞生存能力测量后24、48和72小时使用CellTiter-Glo发光试剂(Promega,猫。# G7570) BioTek板读者(海岸线,佤邦)。

2.3。细胞迁移试验后Plexin-B2沉默

为了确定Plexin-B2沉默对细胞迁移的影响,transwell迁移进行了分析使用transwell®渗透支持(合演,猫。与8 # 3422)μm聚碳酸酯膜。RMS细胞,有或没有Plexin-B2击倒,serum-starved,采用无血清resuspended媒体和播种密度的参议院5×10⁴。室底部无血清培养系统由媒体(负控制),与媒体组成的10%的边后卫(积极的控制)。48小时后,细胞迁移是通过比色测定结晶紫量化。短暂,孵化后,介质从插入吸气,随后撤销不迁徙的细胞内插入使用棉签。迁移细胞固定在4%多聚甲醛和PBS洗。被染色的细胞以0.1%甲醇结晶紫在10%。插入洗,脱水,受到10%醋酸洗提结晶紫染料。染料的强度是成正比的细胞迁移到插入外的一面。筛选了染料的吸光度测量的波长595 nm使用BioTek板读者。

2.4。细胞迁移试验使用实时细胞分析(RTCA)

分析建立在实时细胞分析仪(xCELLigence RTCA DP,安捷伦,圣克拉拉,CA)系统使用CIM-plate 16(安捷伦,猫。# 5665817001)。每个测试条件进行了一式三份。RMS细胞serum-starved(16小时)之前执行分析。井的下议院板满心化学引诱物SEMA4C (R&D的猫。# 6125 - s4), SEMA4D (R&D的猫。# 7470 - s4), SEMA4C + SEMA4D采用无血清(200 ng / ml媒体(SFM)), 10%的边后卫(积极的控制),SFM(负控制)。参议院随后附上50 ul的SFM添加到每个。板允许平衡在孵化器37°C和5%的二氧化碳1小时前基线细胞指数(CI)读数为每个。RMS细胞(5×10⁴细胞/ 100 ul)镀到每个板的参议院。细胞被允许在室温下解决开始测定前30分钟。读数是每15分钟的持续时间分析(48小时)。

数值数据表示为均值±标准差由RTCA自动计算的软件包。CI值都是规范化的SFM(负控制)。

2.5。组织学和免疫组织化学(包含IHC)

Formalin-fixed石蜡包埋(FFPE)人类和小鼠RMS肿瘤组织微阵列(TMA, 4μ米厚)获得,准备合作Biopathology中心(全国儿童医院,哥伦布,哦)。控制FFPE组织阵列(4μ从5米厚)组成的多个器官流产胎儿从我们这里获得生物学实验室(马里兰州罗克维尔市)。使用常规执行免疫组织化学染色技术。组织部分在Clearite deparaffinized和水化。蓝玉heat-retrieved在抗原暴露的解决方案(向量实验室、猫。# h - 3300) 20分钟。接下来,组织孵化在3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活动紧随其后的是2小时阻止一步使用超块试剂(热,猫。# 37580)与抗生物素蛋白补充(向量实验室、猫。# sp - 2001)。清洗步骤之后,探讨了组织与主要抗体+生物素一夜之间解决方案在4°C。主要的抗体使用Plexin-B2(研发系统、猫。 #AF5329; Abcam, Cat. #ab193355; Santa Cruz Biotechnology, Cat. #sc-373969), SEMA4C (Santa Cruz Biotechnology, Cat. #138445), SEMA4D (Abcam, Cat. #ab134128), and SEMA4F (Santa Cruz Biotechnology, Cat. #125264). The tissues were incubated in biotinylated secondary antibodies (Abcam, Cat. #ab207995, Cat. #ab6788) for 30 minutes at room temperature followed by 1-hour incubation of the tissues in VECTASTAIN ABC reagent (Vector Laboratories, Cat. #PK-7200) at room temperature. IHC development was performed using ImmPACT diaminobenzidine substrate kit (Vector Laboratories, Cat. #SK-4105) followed by counterstaining using hematoxylin (Vector Laboratories, Cat. #H-3404-100). All images were taken using brightfield microscope. Full digital whole slide scans (40x) are available on request.

2.6。TMA包含IHC得分

一个病理学家独立评估比例(0,1 - 10%,11 - 50%,51 - 80%,81 - 100%)和强度(0,没有染色:1 +,弱染色:2 +,适度染色:3 +,强染色)细胞核,细胞质和细胞膜染色肿瘤细胞没有知识的临床状态。

2.7。蛋白分离和免疫印迹分析

在所有的实验中,完整的细胞蛋白质溶解产物是用冰冷的收获里帕缓冲区(热,猫。# 89900)补充停止蛋白酶/磷酸酶抑制剂鸡尾酒(热,猫。# 78441)。蛋白质浓度测定用皮尔斯™BCA蛋白质分析工具包(热,猫。# 23227)。蛋白质样品(20 - 30μg)解决在4 - 20% sds - page凝胶(Bio-Rad,猫。# 456 - 2023)和转移到PVDF膜使用迷你Trans-Blot系统(Bio-Rad,猫。# 1658030)。膜被封锁的2小时5%的脱脂奶粉重组Tris-buffered盐水渐变在室温下20 + 0.1%,紧随其后的是隔夜孵化在初级抗体在4°C。主要抗体用于这项研究Plexin-B2(研发系统,猫。# AF5329;Abcam,猫。# ab193355;圣克鲁斯生物技术、猫。# sc - 373969), SEMA4C(圣克鲁斯生物技术、猫。 #138445), SEMA4D (Abcam, Cat. #ab134128), SEMA4F (Santa Cruz Biotechnology, Cat. #125264), GAPDH (Cell Signaling Technology, Cat. #2118), and ß-actin (Cell Signaling Technology, Cat. #4790). After 3 × 10 min washes, the membranes were subjected to 1 hr incubation at room temperature in secondary antibodies: anti-mouse (Vector Laboratories, Burlington, CA Cat. #PI-2000) and anti-rabbit (Vector Laboratories, Cat. #PI-1000). Immunoblots were developed and visualized using ECL substrate (Bio-Rad, Cat. #1705061) and an IVIS Lumina II imaging system (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA, USA).

2.8。统计分析

平均光密度变化的意义(OD)与治疗评估线性模型的OD的治疗,细胞类型和治疗的细胞类型与图基交互调整为多个比较正确。所有数据分析了对数单位。统计测试是双边的experiment-wise 5%的显著性水平。结果总结了样本量,意思是,平均数标准误差,95%置信区间的差异意味着,价值。SAS 9.4版本Windows(北卡罗来纳州卡里SAS研究所)中使用。

3所示。结果

3.1。Plexin-B2及其配体在多数的RMS组织和与生存

研究蛋白质的表达Plexin-B2 SEMA4C, SEMA4D, SEMA4F,我们执行包含IHC formalin-fixed石蜡包埋老鼠和人类RMS组织微阵列(TMA)。染色显示在这两种亚型的RMS (erm和武器),蛋白质的表达Plexin-B2及其配体SEMA4D和SEMA4F升高(见图代表图像1)。值得注意的是,的目标是SEMA4D pepinemab (VX15/2503),最近在儿科研究第一阶段临床试验(NCT03320330) ((18]、[19])。包含IHC Plexin-B2分数,SEMA4C、SEMA4D SEMA4计算基于染色存在的比例和肿瘤细胞的染色强度在人类患者的肿瘤组织和小鼠模型。量化污渍的武器,武器和未分化pleiomorphic肉瘤(UPS)总结了表1。总的来说,Plexin-B2存在于100% RMS细胞在人类肿瘤样本在手臂和低强度在中间在erm高强度。在小鼠模型组织,Plexin-B2表达式出现在75%的武器和86%的erm组织从弱到强染色强度。配体SEMA4C弱表达在人类erm的只有67%。SEMA4D和SEMA4F表达式出现在人类肿瘤细胞的100%,尽管在低强度。

我们下一个检查Plexin-B2表达式RMS患者的临床意义。kaplan meier曲线表明,高Plexin-B2与贫穷RMS患者的总体生存Plexin-B2低,相比有统计学意义0.033(补充图S1)。总的来说,数据表明,高蛋白质和基因表达的Plexin-B2在RMS病人不宜生存的结果。

3.2。Plexin-B2 RMS中高度表达的细胞株

接下来,确认Plexin-B2的蛋白表达,我们进行免疫印迹分析使用可用的RMS的细胞培养模型。充分描述同种型表达式,我们探索蛋白质的溶解产物erm (RD和Rh18)和武器(Rh3, Rh5、Rh30 Rh41)适当Plexin-B2使用多个抗体的检测前体和成熟(α和β)Plexin-B2如原理图中所示的形式2(一个)。从SJ-GBM溶解产物(积极)和软件(消极的)被用作控制对西方的屁股。有趣的是,所有的RMS细胞系存在强劲Plexin-B2亚基的表达无论亚型所描述的人物2 (b),2 (c),2 (d)检测到的三个独立Plexin-B2抗体。CF-1,尤其是PDX外植体原发肿瘤细胞培养,显示最高Plexin-B2表达和RD (erm)显示最低Plexin-B2表达相比,所有的RMS细胞系。这些结果合格的细胞株进行进一步研究检测Plexin-B2横纹肌肉瘤。

3.3。SEMA4C、SEMA4D SEMA4F异常表达在RMS细胞系

评估Plexin-B2配体的表达模式,我们对RMS SEMA4C蛋白质溶解产物,SEMA4D, SEMA4F抗体检测膜结合改装车。包含IHC量化相比,SEMA4C表达式是健壮的测试RMS细胞系(erm和武器);SEMA4D表达式模式之间异常的亚型(数字3(一个)和3 (b))。值得注意的是,erm细胞系,RD, Rh18 SEMA4D表达式显示高于武器细胞系(Rh3, Rh5、Rh30 Rh41)和CF-1最低SEMA4D细胞系中表达测试。SEM4F显示不同的表达模式与低水平的SEMA4F erm和高水平的SEM4F武器细胞系。SEMA4D erm之间和SEMA4F显示相反的表达趋势和手臂细胞系(数字3 (b)和3 (c))。这些研究结果表明,配体分子Plexin-B2显示不同的自分泌表达模式在erm和手臂。具体来说,SEMA4D表达成正比Plexin-B2表达式erm的细胞类型。相比之下,SEMA4F表达式直接正比于Plexin-B2表达式的武器。

3.4。有效的可拆卸的Plexin-B2 RMS细胞系

为了确定的功能Plexin-B2在RMS的细胞生长和迁移,我们优化击倒Plexin-B2使用两套siRNAs针对Plexin-B2和一组新siRNA siControls(炒)。Plexin-B2 siRNA-mediated击倒的是在两个erm细胞系(Rh18和RD)和三个武器细胞系或细胞培养(CF-1, Rh30, Rh41)。免疫印迹分析证实了有效地击倒Plexin-B2与两组测试所有的细胞系siRNAs (siplexinB2_01和siplexinB2_03)免疫印迹图描绘的代表4,补充图S2和补充图S3。值得注意的是,我们发现SEMA4C Plexin-B2击倒后表达增加。相比之下,SEMA4D和SEMA4F表达式Plexin-B2击倒后保持不变。在接下来的实验中,我们选择si_03 siRNAs作为Plexin-B2击倒一个有效的工具。

3.5。可拆卸的细胞株Rh30 Plexin-B2减少细胞增殖的Rh41, RD, Rh18 CF-1但不是

评估Plexin-B2击倒在细胞增殖的影响,我们选择三个武器细胞培养(CF-1、Rh30 Rh41)和两个erm细胞系(Rh18和RD)和测量细胞生存能力在24、48和72小时。我们的研究结果显示,细胞增殖明显降低在48小时和72小时时间点武器细胞系,Rh30和Rh41(图5)。细胞生长Plexin-B2沉默后显著降低RD和Rh18细胞株在所有时间点。Plexin-B2击倒CF-1显著(矛盾)增加细胞增长。整体而言,这些结果表明多因子的和随机在RMS Plexin-B2击倒对细胞生长的影响。

3.6。Plexin-B2击倒和异位SEMA4C / SEMA4D都没有任何影响在RMS细胞系细胞迁移

确定Plexin-B2调节细胞迁移的RMS细胞系ligand-independent或serum-responsive方式,我们沉默Plexin-B2使用siRNAs Rh30, Rh41, RD, CF-1(如图4和补充图S2),然后使用transwell化验评估细胞迁移。迁移细胞与结晶紫染色,筛选了染料强度量化在595海里。的击倒Plexin-B2引起显著减少细胞迁移只Rh30(但不是Rh41、CF-1或RD)在10%胎牛血清的背景下鱼饵(图6(一)6 (d))和补充图S4)。接下来,我们调查是否同源Plexin-B2刺激迁移的配体Plexin-B2表达细胞系。使用一个实时conduction-based移民监测仪器(图7),没有迁移的变化观察异位SEMA4C或SEMA4D时被用作鱼饵。总的来说,这些结果显示多因子的和随机在RMS Plexin-B2击倒对细胞生长的影响,看似独立的SEMA4C或SEMA4D表达式。

4所示。讨论

在这项研究中,我们探索Plexin-B2-SEMA4信号轴的作用在细胞生长的环境中,细胞迁移和入侵RMS。我们表明,Plexin-B2高度在手臂和erm亚型蛋白表达水平。回顾性分析临床IRSG-IV样品、高Plexin-B2表达与病人相关的新的诊断样本中生存在RMS。此外,SEMA4C强劲表现在所有测试RMS细胞系,SEMA4D突出表现在erm细胞系。相比之下,SEMA4F高度表达的武器比erm细胞系所揭示的免疫印迹分析。击倒Plexin-B2导致受损的细胞生长的不灭的RMS细胞系。然而,沉默Plexin-B2减少serum-stimulated细胞迁移能力只有一个武器细胞系和没有影响任何erm细胞系;此外,Plexin-B2同源配体SEMA4C和SEMA4D没有影响迁移的Plexin-B2表达细胞系/细胞培养测试。一个潜在的警告我们的细胞生存能力分析是CellTiter-Glo衡量细胞新陈代谢,因此间接衡量细胞生存能力和生存能力和扩散参数通常但不总是一致的。

最近的研究报道,Plexin-B-SEMA4信号轴是过表达和参与疾病进展通过细胞增殖和细胞移植骨,乳房,和脑癌8,9,15- - - - - -17,20.]。相关研究表明,SEMA4-Plexin-B信号轴改变细胞形态和提高细胞迁移和细胞入侵通过激活下游信号通路如ρgtpase, RTK-Met, AKT [8,15,17]。我们的结果表明,Plexin-B2可以调节细胞迁移在选定的肺泡横纹肌肉瘤细胞模型。然而,未来的实验需要的评估中的配体依赖性和下游信号通路在RMS。

总之,我们已经表明,Plexin-B2 RMS的预后因素,这意味着Plexin-B-SEMA4信号轴横纹肌肉瘤的可能是一个潜在的治疗目标;然而,矛盾Plexin-B2击倒增加肿瘤细胞生长的影响,只有有选择地在特定细胞系减少肿瘤细胞迁移筹集大量关注治疗方法Plexin-B-SEMA4抑制直到这个复杂的生物学和临床生物标志物的基础因素的响应可以开发。

数据可用性

没有扩展数据集,及所有数据被视为数据和表的手稿。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者要感谢罗兰·h·弗里德博士从神经学部门,弗里德曼脑研究所,伊坎在西奈山医学院,纽约,纽约,美国提供的意见和建议在理解不同亚基的Plexin-B2和推荐的抗体。作者感谢苏珊贝克博士提供SJ-GBM细胞系。作者感谢Nick Escobar艾娃Massarat,欧文Wogmon,安德鲁·伍兹和Kiyo Nagamori技术帮助在这个研究。这项工作被美国肉瘤基金会支持,和关键阶段,这项工作是由Nevonen Io的家族在内存中。

补充材料

补充表S1: STR细胞分析在这项研究中使用的细胞系。补充图S1: Plexin-B2预后因子。kaplan meier存活曲线表明,高表达患者Plexin-B2短生存。已知协变量生存的数据调整阶段,年龄、性别、组织学、临床集团网站,和易位状态; 。补充图S2:高效击倒Rh30 Plexin-B2的Rh41, RD细胞系使用两套siRNAs Plexin-B2。确认Plexin-B2击倒在Rh30 (A、B), Rh41 (C, D)和RD (E, F)细胞系使用抗体从研发,检测到一个前体和alpha-chain单元(分别为240 kDa和170 kDa)和Abcam检测170 kDa,跨膜的胞内alpha-subunit beta-chain 80 kDa的亚基。GAPDH作为加载控制。注意Rh30和Rh41肺泡横纹肌肉瘤细胞系(武器),和理查德·道金斯是一个胚胎细胞系(erm)。补充图S3:有效地击倒Plexin-B2 Rh41, RD, Rh30细胞系使用两套siRNAs 25对Plexin-B2皮摩尔浓度。在这一轮,只有siRNA_03显示一个高效廉价的由Plexin-B2证实使用研发抗体免疫印迹。SEMA4C水平调节在Plexin-B2击倒RH41 Rh30细胞系。然而,其他配体的Plexin-B2、SEMA4D SEMA4F水平Plexin-B2缺阵时并没有改变。GAPDH作为加载控制。注意Rh30和Rh41肺泡横纹肌肉瘤细胞系(武器),和理查德·道金斯是一个胚胎细胞系(erm)。 Supplementary Figure S4: effect of Plexin-B2 siRNA knockdown on cell migration. Migration assays reveal that in Rh30 and Rh41 (aRMS) cell lines, the migration and invasive properties are compromised upon Plexin-B2 knockdown in the context of serum bait. In contrast, migration property is increased in RD (eRMS) cell line. CF-1, a primary cell line, shows minimal effect on migration after Plexin-B2 knockdown. (The data on graphs show means ± SEM. , ,和 )。(补充材料)