文摘
多小圆细胞肿瘤(DSRCTs),尤因肉瘤(ES)、肺泡和胚胎性横纹肌肉瘤(武器和erm)恶性肉瘤通常发生在年轻的时候,有不良预后转移设置。新的治疗方案是必要的。Src家族激酶抑制剂达沙替尼单药治疗已经在第二阶段的一项研究调查了先进的肉瘤患者包括ES和RMS但是失败作为一个代理在这些亚型。因为先前的研究证明高FAK和Src活动在RMS和ES组织和细胞系,达沙替尼治疗被证明移植激活FAK,我们假设FAK-Src联合治疗可能是一个有趣的治疗方案对这些肿瘤的类型。我们考察了FAK-Src复杂目标的影响通过处理(p) FAK和在肿瘤(p) Src表达式部分DSRCT (n= 13),ES (n= 68),武器(n= 21),汇率机制(n= 39),通过确定单一和联合治疗的抗肿瘤作用与FAK抑制剂defactinib multikinase (Abl / SFK)抑制剂达沙替尼在体外在每个子类型的细胞系。在活的有机体内效果评估DSRCT和erm模型。实腹式预应力型钢混凝土表达式(h值> 50)并发pFAK和被观察到在DSRCT (67%)、ES(6%)、武器(35%),和erm(19%)样品。Defactinib治疗减少pFAK亚型表达和细胞生存能力降低。达沙替尼治疗实腹式预应力型钢混凝土在每个亚型表达和细胞生存能力下降。联合治疗导致一个完整的实腹式预应力型钢混凝土在每个细胞株和减少pFAK和显示增强细胞活力降低,药物的协同作用,DNA损伤诱导、细胞凋亡诱导DSRCT高的趋势,汇率机制和武器,但不是在ES细胞。这些承诺在体外结果不幸不转化为有前途的在活的有机体内结果我们没有观察到显著影响肿瘤体积在活的有机体内,结合不达沙替尼单药治疗相比表现出优越的效果。
1。介绍
肉瘤是罕见的肿瘤的结缔组织与超过70个亚型。多小圆细胞肿瘤(DSRCTs)是非常罕见的(0.2 - -0.5 /每年几百万人)的发生率和高度恶性软组织肉瘤(STS)主要出现在青少年和年轻成人(阿雅)男性1,2]。尤因肉瘤(ES)是第二个最常见的原发性骨肿瘤在儿童(3]。横纹肌肉瘤(RMS)是最常见的STS在儿科患者,但也可能发生在青少年和年轻成人患者。肺泡和胚胎性横纹肌肉瘤(武器和erm)是儿童最常见的子类型。目前治疗每一个肉瘤亚型包括联合化疗,在可能的情况下手术,放疗和指示。由于相似性DSRCTs ES, DSRCT基于ES化疗方案治疗。DSRCT患者经常出现广泛传播疾病诊断,尽管强化治疗,目前5年总生存期(OS)率仍有15% (4]。5年操作系统本地化ES和转移ES是75%和25%,分别为(3]。RMS的存活率为88%(低风险),76%(中度风险)和25 - 40%(风险高;包括fusion-positive RMS) (5,6]。此外,老年时的诊断与存活率下降(7]。尽管与传统化疗药物强化治疗,转移性疾病患者的存活率仍然很低为每个这些亚型(5年操作系统:∼10 - 25%)。此外,生存率都停滞在过去几十年和新颖的治疗方法,因此,必要的。
粘着斑激酶(FAK)是一个nonreceptor酪氨酸激酶(non-RTK)参与无数的细胞过程。FAK充当信号和支架蛋白。FAK信号能力的依赖一些激酶的磷酸化作用域(Tyr397、Tyr567 Tyr577)和通常涉及交互Src, non-RTK已知的重要性在肉瘤(8]。激活后,FAK磷酸化在Tyr397自身磷酸化网站。除了激酶活性,Tyr397磷酸化作为高亲和性结合位点为Src家族激酶(SFK),如Src。Src活动是由其自身磷酸化域Tyr416 [9]。在绑定,Src激活Tyr567 FAK和Tyr577域,导致FAK完全激活。FAK-Src复杂可以随后激活下游信号通路,导致过程的激活参与细胞增殖、生存、入侵、移民和癌症干细胞活动(10]。FAK和Src超表达在多种肿瘤类型和与侵袭性和转移性疾病,和病人的结果(了10,11])。此外,先前phosphoproteomic筛查的ES和RMS细胞系和肿瘤组织高FAK磷酸化(12,13]。此外,ES和RMS细胞系显示并发FAK磷酸化和Src,使FAK-Src复杂的一个潜在的治疗目标在这些肉瘤亚型(12,14]。按照观察pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式和水平,在体外和在活的有机体内抗肿瘤作用后单FAK和Src抑制被报道在ES和RMS (12,13,15- - - - - -18]。达沙替尼单药治疗已经在第二阶段的研究调查(SARC009)先进的肉瘤患者包括ES和RMS但是失败作为一个代理在这些亚型(19]。单defactinib也DSRCT临床效果有限,,和RMS病人之前在非小细胞肺癌(20.]。在肝细胞癌,这是表明,达沙替尼治疗诱导激活FAK upregulation [21]。因此,我们特别检查的影响针对FAK-Src实腹式预应力型钢混凝土表情复杂,应对pFAK和小学和后处理的临床肿瘤部分切除术,转移和局部复发DSRCT (n= 13),ES (n= 68),RMS(武器n嗯= 21日n= 39),通过确定的抗肿瘤效应的综合治疗FAK抑制剂defactinib和multikinase (Abl / SFK)抑制剂在DSRCT达沙替尼,ES,武器,和erm细胞株。defactinib和达沙替尼联合治疗在一个评估在活的有机体内DSRCT和erm模型。
2。材料和方法
2.1。免疫组织化学(包含IHC)
组织微阵列(tma)包含主要和后处理切除术,转移或局部复发肿瘤组织DSRCT (n= 13),ES (n= 68),武器(n= 21),汇率机制(n为基线FAK = 39)染色,Src,磷酸化FAK Tyr397 (pFAK)和磷酸化Src Tyr416实腹式预应力型钢混凝土)(表达式。pFAK表达式可以评估DSRCT 13/13, 68/68, 20/21的手臂,39/39 erm组织部分。pSrc表达式可以评估DSRCT 12/13, 64/68, 21/21的手臂,37/39 erm组织部分。病人特点展示在表1。详细描述和统计分析的方法可以补充材料中发现的。
2.2。细胞培养和化合物
JN-DSRCT-1细胞系(EWSR1-WT1)慷慨地提供了珍妮特·希普利博士(英国癌症研究所)。EW8(尤因肉瘤EWSR1-FLI1) RD (erm) Rh18 (erm) Rh30 PAX3-FOXO1A(武器),和Rh41(手臂、PAX3-FOXO1A)细胞系慷慨提供的彼得·霍顿博士(美国儿科临床前测试程序)和TC32细胞系(尤因肉瘤,EWSR1-FLI1)博士提供的慷慨Friederike Meyer-Wentrup(公主Maxima儿科肿瘤学中心,乌特勒支,荷兰)。
JN-DSRCT-1在DMEM培养:F12 GlutaMAX™介质(Gibco,热费舍尔、布雷达问)。EW8, Rh41, Rh30 RPMI 1640培养基培养(Lonza, Westburg Leusden, NL)。RD和TC32培养在DMEM (Lonza)和5 Rh18真品的介质(Lonza)。所有文化媒体补充10%胎牛血清(Gibco)和庆大霉素0.1%或1%青霉素和链霉素(Lonza)。细胞培养在湿润的气氛中5%的有限公司2/ 95%空气在37°C。
FAK抑制剂defactinib和Abl / SFK抑制剂达沙替尼买来Selleckchem(美国休斯顿,德克萨斯州)和在DMSO溶液稀释在体外实验。Defactinib,达沙替尼被稀释0.5%羟丙基甲基纤维素(HPMC) /无菌水渐变- 80 0.2%和9.5% DMSO / 5.1% PEG-300/5.1%渐变- 80在无菌水22]在活的有机体内实验,分别。
2.3。细胞生存能力分析
细胞生存能力评估的MTS (3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium)测定。细胞治疗的药物浓度增加72 h (TC32, EW8 Rh30, RD), 120 h (JN-DSRCT-1和Rh41),或144 h (Rh18),基于估计细胞分裂率。MTS的解决方案(CellTiter 96水溶液细胞增殖试验、Promega WI,美国)添加(10μl),和盘子被孵化2 h在37°C。灭绝为490 nm (iMark微型板块吸光度读者,Bio-Rad, CA,美国)。集成电路50值计算与GraphPad Prism 5.03版本软件。
2.4。联合治疗
细胞生存能力defactinib同时联合治疗后,达沙替尼是评估,和药物协同计算如前所述[23]。所有药物浓度组合在一个常数比表达的一小部分或IC的乘法50浓度,结合指数(CI)和减少剂量指数(DRI)计算使用CompuSyn软件(24]。CI CI > < 1.0、CI = 1.0和1.0代表协同,添加剂,分别和拮抗效应。DRI > 1.0意味着良好的剂量减少药物的联合治疗。药物协同isobologram表示。X - y轴表示分数部分药物的联合治疗(D1+ D2)有必要减少x %细胞生存能力(DX)1/2除以必要剂量作为一个代理来减少相同的x %细胞生存能力(D1/2)。D1 = defactinib D2 =达沙替尼。
2.5。免疫印迹
免疫印迹分析如前所述[23]。细胞治疗24 h IC50基于单药或联合治疗。详细描述每个抗体的补充材料中可以找到。
2.6。细胞凋亡检测
凋亡细胞的水平后24 - 48 h IC50基于单药和联合治疗是测量使用膜联蛋白V / propidium碘(PI) double-staining细胞凋亡测定(BioVision、钙、美国)。分离和坚持收集细胞,随后孵化与膜联蛋白V-FITC CaCl和π2纯度的浓缩铀的培养基。凋亡细胞的数量(膜联蛋白V+)测量CytoFLEX流式细胞分析仪(美国贝克曼库尔特,CA)和计算FlowJo 10.0版。
2.7。体内联合治疗
所有适用的国际、国家和机构指南遵循动物保健和使用。所有程序执行按照道德标准内梅亨大学动物伦理委员会荷兰奈梅亨(项目#2015 - 0109)。
总共5×106JN-DSRCT-1或RD细胞皮下注射1:1培养基:基底膜基质®矩阵(美国纽约康宁)解决方案,在男性(JN-DSRCT-1)和女性(RD) SCID小鼠(6 - 8周的年龄)。实验开始的肿瘤大小约0.25 - -0.4厘米3,动物被随机分配到治疗组(每组5老鼠)。Defactinib和达沙替尼在50毫克/公斤/天21 (RD)或(JN-DSRCT-1) 28天。肿瘤生长监测每周两次卡尺测量和描绘成相对肿瘤体积(RTV)如前所述23]。肿瘤的可行性(%)(H & E染色)是由一个专家评估病理学家(超滤)和caspase-3(凋亡),ƴH2AX、(p) FAK和(p) Src表达式被包含IHC评估剩下的可行的肿瘤组织如前所述,在补充材料(23]。
3所示。结果
3.1。pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式和在临床肿瘤组织
基线FAK、Src pFAK (Tyr397),实腹式预应力型钢混凝土(Tyr416)表达式和评估肿瘤组织的初级和后处理切除术,转移或局部复发DSRCT (n= 13),ES (n= 68),武器(n= 21),汇率机制(n= 39)。样品的数量可以改变之间的染色,因为并不是所有的样本为每个染色可评价的。每一个例子染色强度补充图描述了S1。
基线FAK表达(h值> 0)被认为在92%的DSRCT(12/13), 85%的ES(52/61), 70%的武器(14/20)和61%(22/36)的erm组织。
pFAK表达式(h值> 0)被认为在77%的DSRCT(10/13), 25%的ES(17/68), 70%的武器(14/20)和26%的erm组织(10/39)。高pFAK表达式(h值> 100)被发现在38%的DSRCT(5/13), 3%的ES(2/68), 15%的武器(3/20)和13%的汇率机制(5/39)(图1(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
基线Src表达式被认为在100%的DSRCT(13/13), 88%的ES(56/64), 95%的武器(19/20)和86%的汇率机制(32/37)。pSrc表达式(h值> 0)被认为在83%的DSRCT(10/12), 39%的ES(25/64), 76%的武器(16/21)和35%的erm组织(13/37)。实腹式预应力型钢混凝土表达高(h值> 100)是在DRSCT的58%(7/12),8%(5/64),38%的武器(8/21)和19%的汇率机制(7/37)(图1 (b))。
实腹式预应力型钢混凝土表达式可以评估在并发pFAK和12 DSRCT, 62年,20武器,36 erm肿瘤样本。并发pFAKpos和pSrcpos表达式被认为在8/12 (67%)DSRCT, 4/62(6%), 7/20(35%)的手臂,7/36 (19%)erm肿瘤组织(表2)。这些样本,4/8 DSRCT 0/4 ES, 3/7的手臂,4/7 erm并发pFAK肿瘤组织显示高和pSrc高表达式(表2,图1 (c))。pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式和DSRCT表现出显著相关性(h值> 50岁 ),ES (h值> 50岁 ),武器(h值> 100年, ),和erm肿瘤组织(h值> 50岁 ;h值> 100年, )(表2)。积极的pFAK和并发实腹式预应力型钢混凝土表达式(包括积极pFAK和 )显著降低武器患者的总体生存(图1 (d))。实腹式预应力型钢混凝土,pFAK,或并发pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式,不与病人特征或风平浪静生存(EFS)和主之间没有差别,后处理,转移,或复发性DSRCT,手臂,嗯,ES肿瘤样本(数据没有显示)。
3.2。单Defactinib,达沙替尼治疗
基线水平表达pFAK实腹式预应力型钢混凝土(Tyr416) (Tyr397)和DSRCT, ES,武器,和erm细胞系和defactinib和达沙替尼治疗的影响细胞的生存能力测定。每个子类型使用两个细胞系,除了DSRCT,只有一个建立细胞系。实腹式预应力型钢混凝土表情,所有的细胞系显示pFAK和实腹式预应力型钢混凝土Rh18细胞系中表达较低(图2 /S2A)。Defactinib与IC达沙替尼治疗抑制细胞生存能力50值从2.5到6.4不等μM和0.6到7.7μ分别为M(表3)。细胞生存能力降低剂量依赖性的方式在所有的细胞系,除了达沙替尼治疗在Rh30细胞系(图3/开通)。达沙替尼治疗导致倾斜的细胞活力,减少大约50%的细胞生存能力在0.6开始减少μ米治疗。
3.3。Defactinib和达沙替尼联合治疗
3.3.1。实腹式预应力型钢混凝土表达式pFAK和
调查是否针对FAK-Src复杂可能会增加单药治疗后观察治疗反应,我们调查的影响同时defactinib和达沙替尼联合治疗(p) FAK和(p) Src表达式在一个代表细胞系/肉瘤亚型:JN-DSRCT-1, TC32 Rh30, RD。免疫印迹结果如图2与量化在图S3(一)(d))。达沙替尼单药治疗和联合治疗导致一个完整的实腹式预应力型钢混凝土在每个细胞减少。Defactinib单药治疗和联合治疗导致明显减少pFAK Rh30, RD, TC32细胞系。在pFAK JN-DSRCT-1显示一定的降低单defactinib治疗和联合治疗。在治疗总FAK的表达没有明显改变。总SRC表达增加达沙替尼和联合治疗后出现。
3.3.2。细胞生存能力和药物协同作用
细胞生存分析显示转向更高的抗肿瘤效应的联合治疗DSRCT各自的单药治疗相比,嗯,和手臂细胞系(数字4(一)- - - - - -4 (c),S4 (a - b))。ES细胞系,TC32 EW8,没有显示一个增强细胞活力降低联合治疗后比单药治疗(图4 (d)/S4 (c))。药物协同作用(CI < 1.0)和良好的DRI (DRI > 1.0)联合治疗的观察使用浓度等于或低于2×IC50价值DSRCT erm,手臂细胞系。ES细胞系表现出更多的累加效应后联合治疗(CI 1.0∼)(图4(S4 (a - c)、表4/S1)。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3.3。DNA损伤
DNA损伤的程度是24小时后检查联合治疗在一个细胞系/子类型选择最显著的转变细胞生存能力相比,联合治疗后各自的单药治疗(JN-DSRCT-1, RD, Rh30 TC32)。磷酸化H2AX (γH2AX)表达式,表明DNA损伤,联合治疗增加与单药治疗相比,特别是在TC-32, RD, Rh30细胞系(图2/S3 (e))。
3.3.4。细胞凋亡
24小时单defactinib(26%)和达沙替尼治疗(25%)显著增加细胞凋亡而JN-DSRCT-1 vehicle-treated细胞(9%)细胞( - - - - - -值< 0.01;没有显示)。此外,JN-DSRCT-1细胞表现出显著增加细胞凋亡后24小时联合治疗(60%)相比,defactinib(26%)和达沙替尼(25%)单药治疗。没有显著增加细胞凋亡可以观察到在RD, Rh30, TC32细胞后24小时单defactinib治疗(图5;24 h)。长期治疗(48小时)defactinib显示增加凋亡细胞细胞株(图5)。达沙替尼治疗(48小时)也增加了TC32细胞系的细胞凋亡。达沙替尼治疗不诱导细胞凋亡的RMS细胞系。Forty-eight-hour联合治疗诱导细胞凋亡在每个细胞株,尽管不是defactinib相比明显不同,在TC32细胞,达沙替尼单药治疗(图5)。
3.4。体内Defactinib和达沙替尼联合治疗在DSRCT erm模型
DSRCT和erm细胞显示最大的潜在受益于针对FAK-Src复杂在体外通过显示明显的细胞生存能力降低联合治疗(数字4(一)和4(b))。因此,DSRCT和erm模型被用来解决defactinib的抗肿瘤效应,达沙替尼的组合体内。单药治疗和联合治疗的影响相对肿瘤体积(RTV) DSRCT和erm模型(数据6(一)和6 (b))。DSRCT模型只显示一个非常温和增长阻碍影响肿瘤体积的可视化模型。治疗持续时间减少到21天RD模型由于肿瘤的指数增长,导致皮肤溃疡,端点的实验。相比缺乏变化的RTV可行的肿瘤组织的数量下降达沙替尼和联合治疗后相比,defactinib-treated组在这两种亚型,与显著差异defactinib与达沙替尼治疗DSRCT模型和车辆与达沙替尼和联合治疗在RD模型。之间没有区别观察组织生存能力达沙替尼,combination-treated组和caspase-3表达式(数据未显示)剩下的可行的肿瘤组织中不同的治疗组(数据没有差异6 (c)- - - - - -6 (f))。FAK和Src表情并没有改变治疗后JN-DSRCT模型(数据6 (g)- - - - - -6(我))。pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式显示(几乎)和完整的还原后单达沙替尼和联合治疗DSRCT模型(数据6 (c)- - - - - -6 (d))。FAK和Src表达式都仍然存在但单达沙替尼治疗后低(RD模型 )(数据6(h) -6(我))。pFAK表达式仍然存在以下单达沙替尼治疗但完全联合治疗后减少。此外,一个完整的实腹式预应力型钢混凝土可以减少单达沙替尼和联合治疗(数据后观察6 (e)- - - - - -6 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
磷酸化H2AX (γH2AX)表达是主要的RD模型和显著的高于dasatinib-treated肿瘤相比汽车集团( )(数据6 (h)- - - - - -6(我))。
4所示。讨论
FAK和Src抑制,无论是作为单药或联合治疗的一部分,曾被证明有临床效果在各种肿瘤类型(21,25- - - - - -37]。在这项研究中,我们具体分析了针对FAK-Src复杂的影响在儿科和阿雅肉瘤通过检查pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式和在临床肿瘤DSRCT材料,ES,武器,和erm患者和通过检查在体外和在活的有机体内影响FAK抑制剂defactinib和Abl / SFK抑制剂达沙替尼联合治疗。
并发积极pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式被观察到在DSRCT的67%,和6%,35%,和19%的erm肿瘤组织。这表明FAK-Src复杂可能是亚组病人治疗的目标。此外,积极pFAK和并发积极pFAK实腹式预应力型钢混凝土表达式和武器的整体存活率显著降低患者。然而,一个更大的群体的分析需要验证的预后价值水平和实腹式预应力型钢混凝土DSRCT表达式,并发pFAK和ES,武器,嗯。
符合之前的发现,单药治疗defactinib或达沙替尼导致剂量依赖性降低细胞生存能力erm,武器,和ES细胞系12,13,15,16]。我们现在还显示,第一次JN-DSRCT-1细胞系的积极成果。此外,在体外defactinib和达沙替尼治疗DSRCT显示药物的协同作用,嗯,和手臂细胞。类似的协同效应以前观察到神经母细胞瘤,急性淋巴细胞白血病,肝细胞癌(HCC)细胞(21,27,32]。DSRCT erm,手臂细胞显示更高水平的药物协同作用与胚胎干细胞相比。这可能是由于观察到胚胎干细胞已经表现出明显的单一defactinib和单一的达沙替尼治疗后细胞凋亡增加。我们意识到我们可能错过细胞系之间的可变性,因为选择检查组合效果的只有一个细胞系/肉瘤亚型。
我们表现出明显的减少在pFAK defactinib实腹式预应力型钢混凝土达沙替尼治疗后治疗和实腹式预应力型钢混凝土后明显减少pFAK和联合治疗。总Src的表情似乎增加达沙替尼和联合治疗后,这是意想不到的,而且在以前的研究中显示(38- - - - - -41]。
在活的有机体内分析,同时结合治疗没有显示影响相对肿瘤体积。DSRCT模型,这可能是由于其非常温和增长阻碍的可视化对肿瘤体积的影响。另一方面RD模型显示一个指数级增长,这可能复杂的治疗。我们确实显示减少肿瘤生存能力达沙替尼和联合治疗。基于这些发现,它可以表明,类似于先进的STS pazopanib功效,额外的测量肿瘤代谢利用放射性标记可能会导致更好的达沙替尼和defactinib治疗疗效[表示42]。减少肿瘤可行性相似单达沙替尼和联合治疗组,和磷酸化H2AX明显高于肿瘤治疗达沙替尼。众所周知,达沙替尼可以引起DNA损伤(43]。的在活的有机体内结果显示,联合治疗不表现出优越的影响达沙替尼单药治疗相比,如图所示在体外。上级在活的有机体内达沙替尼的影响可能解释为达沙替尼的抗血管生成属性(44]。
然而,达沙替尼单药治疗已经进行第二阶段研究先进的肉瘤患者和失败作为一个代理在大多数肉瘤亚型,包括尤因肉瘤、横纹肌肉瘤(19]。因此,达沙替尼的其他组合策略应该被考虑。自达沙替尼已表现出协同免疫抑制检查站在非小细胞肺癌模型中,这可能是一个有前途的组合为未来的研究(45]。
FAK-Src定位的影响,在本研究中可能可能被低估,因为二维培养的细胞的细胞外基质的缺失。
此外,FAK-Src复杂的作用在肿瘤细胞入侵,和粘附表明在活的有机体内联合治疗集中在肿瘤迁移和肿瘤转移的网站可能的结果对进一步研究[10]。
5。结论
总之,实腹式预应力型钢混凝土表达式出现在并发pFAK和DSRCT的子集,ES,武器,和erm肿瘤组织。,结合细胞生存能力,减少诱导的DNA损伤和细胞凋亡增加在DSRCT defactinib和达沙替尼联合治疗之后,嗯,和手臂细胞表明FAK-Src复杂的目标可以提高这些肉瘤亚型的抗肿瘤效应。这些承诺在体外结果不幸不转化为有前途的在活的有机体内结果我们没有观察到显著影响肿瘤体积和没有发现优越组合的影响在活的有机体内相比,达沙替尼单药治疗。因此,这些结果还不鼓励进一步的临床研究DSRCT这种联合治疗的治疗潜力,武器,嗯。
数据可用性
数据请求到相应的作者。
信息披露
给出了一个早期版本的手稿以PDF托管内梅亨大学内梅亨库,奈梅亨:https://repository.ubn.ru.nl/bitstream/handle/2066/204354/204354.pdf范博士(博士论文Erp,第三章)。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者要感谢珍妮特·希普利博士(英国癌症研究所)、彼得·霍顿博士(美国儿科临床前测试项目)、博士Friederike Meyer-Wentrup(公主Maxima儿科肿瘤学中心,问)为我们提供用于本研究的细胞系。这项研究是由“马瑞医生左het Zadel voor de kankerbestrijding”(NL)。
补充材料
2.1辅料描述。免疫组织化学(包含IHC)和统计分析。2.5免疫印迹。图S1:实腹式预应力型钢混凝土表达式pFAK和。实腹式预应力型钢混凝土染色pFAK强度的一个例子,通过免疫组织化学方法在肿瘤组织评估(包含IHC)。强度分为消极的(0),弱阳性(1),积极的(2),高度阳性(3)表达式。武器肿瘤组织作为一个例子。图片拍摄40 x放大。图S2:实腹式预应力型钢混凝土表达式和pFAK和defactinib和达沙替尼单药治疗EW8 (ES), Rh41(武器),和Rh18 (erm)细胞。(a)基线pFAK实腹式预应力型钢混凝土(Tyr416)表达式(Tyr397)和EW8, Rh41, Rh18细胞系。(b)细胞生存能力(%)EW8 defactinib和达沙替尼单药治疗后,Rh41, Rh18细胞系。图S3:实腹式预应力型钢混凝土,pFAK量化,和γH2AX表达式。FAK,量化的(a) (b) pFAK (Tyr397), (c), Src,实腹式预应力型钢混凝土(Tyr416), (d)和(e)γH2AX (Ser139)表达式24 h后单药和联合治疗。(p) FAK, Src (p),γH2AX表达式GAPDH描绘成一定比例的加载控制。图S4:defactinib和达沙替尼联合治疗的影响(a - c)。细胞生存能力(%)同时defactinib和达沙替尼之后,定比联合治疗在Rh18 (a), Rh41 (b),和EW8 (c)细胞株与相应的isobologram,代表药物协同作用的水平。isobologram代表的X轴和y轴的一部分部分药物联合治疗(D1+ D2)必要减少x %细胞生存能力(D1/2)除以必要剂量减少作为一个代理来生成一个类似x %的细胞生存能力(DX)1/2。D1= defactinib, D2=达沙替尼。X -线连接Y相互重合(CI = 1)代表了一种添加剂效果。点的线被认为是协同(CI < 1.0)。表S1。defactinib FA、CI和DRI值,达沙替尼联合治疗在EW8 Rh41, Rh18细胞系。(补充材料)