诱导成肌分化提高软组织肉瘤耐药细胞的化学敏感性

摘要

横纹肌肉瘤(RMS)和横纹肌样肿瘤(RT)是罕见的软组织恶性肿瘤，在婴儿、儿童和青少年中发病率最高。晚期、复发和/或转移性RMS和RT对治疗反应较差。肿瘤内的异质性是治疗耐药的主要机制之一。在本研究中，我们研究了胚胎RMS (ERMS)细胞系和RT细胞系中的肌源性决定因子1 (MYOD1)和Noggin (NOG)标记物，以及表达MYOD1和NOG的亚群对化疗的差异反应。重要的是，我们发现这些标记共同鉴定了对长春新碱和阿霉素(ERMS和rt两种常用的化疗药物)具有初级耐药的细胞亚群(MYOD1+ NOG+细胞)。耐药的MYOD1+ NOG+细胞表达未分化细胞的标记物，如肌原蛋白和ID1。长春新碱与TPA/GSK126(一种可以诱导RMS细胞株分化的药物组合)联合，能够部分克服MYOD1/NOG细胞的化疗耐药。

1.介绍

横纹肌肉瘤(RMS)和横纹肌样肿瘤(RT)是罕见的软组织恶性肿瘤，在婴儿、儿童和青少年中发病率最高。在美国，每年大约有400至500例RMS新病例，而只有大约15例RT新病例，约占所有儿童癌症的3%。尽管RMS在成人中很少发生，但结果明显更糟[1.]．许多晚期RMS的成年患者死亡是因为他们的癌症对现有的治疗方法表现出或产生了耐药性。RMS包括两个主要的组织学变异，肺泡和胚胎(ERMS)。ERMS具有更复杂和异质性的遗传谱，但总体预后更好，低风险组5年生存率高达90% [2.]然而，当ERMS进展、复发和/或转移时，它们被归类为高风险，对治疗反应差（化疗耐药），无进展生存期少于1.5年，5年生存率低至20%[3.–5.]．在儿童和成人中，RMS和RT都会用手术，辐射和化疗的疗法组合治疗[6.,7.]．

肿瘤内的异质性是肿瘤耐药和复发的主要机制之一。构成肿瘤细胞的基因组、转录组和蛋白质组的异质性表现为对应用治疗的不同反应[8.–10.].尽管临床肿瘤的反应可能是体积缩小，甚至在治疗后无法检测到，但治疗干预可促进最初少量无反应细胞的扩增，并重建原发肿瘤和/或转移[11.]因此，肿瘤内异质性是有效癌症治疗的主要障碍[12.]．RMS和RT的两种主要变异已被报道在患者中具有肿瘤内异质性[13.,14.]．在胚胎横纹肌肉瘤中，肿瘤内多样性与生存率降低相关[15.]在治疗过程中，患者的症状也发生了变化[16.,17.]．

为了设计出能够针对异质肿瘤群体的治疗方法，不仅要确定不同肿瘤亚群的特征，还要了解细胞亚群在治疗过程中可能发生的变化。这些信息可以指导高阶联合疗法的设计[11.];然而，关于治疗下RMS和RT肿瘤内异质性变化的数据有限。

在本研究中，我们研究了ERMS和RT细胞株中与MYOD1和Noggin标记物异质性相关的化疗反应差异。RD细胞系，RMS研究中最常用的细胞系之一[18.]，以及a -204细胞系，最初鉴定为RMS，后来分类为横纹肌样肿瘤(RT) [19.]．有报道称，RMS肿瘤MYOD1呈阳性，细胞间异质性显著[18.]，而RT被认为对MYOD1为阴性[20.,21.]．MYOD1是驱动肌细胞前体向成熟肌细胞分化的四种肌源性调节基因之一，它已被证明足以将非肌细胞转化为肌母细胞样细胞[22.]．MYOD1等肌源性转录因子通常在稳态和组织修复过程中受到严格调控[22.,23.]，但在RMS中，MYOD1被解除调控或发生突变，导致患者生存率降低[15.,24.]．NOG是另一种严格调控的蛋白质，是正确的肌肉形态发生所必需的[25.]及成人肌肉内环境平衡[26.修复[27.]．NOG拮抗骨形态发生蛋白(bmp)，通过结合bmp受体，调节增殖和分化。分化(Id)蛋白抑制剂是BMP信号转导的重要下游效应物，在几种癌症中未受调控[28.]在成肌细胞中，Id蛋白通过隔离和拮抗MYOD1和肌生成素转录活性来抑制细胞分化和增强细胞增殖[29.]．在rms中，形态发生信号传导是异常，导致肌原素前体和/或分化细胞的增殖和分化改变[30]．进一步分析MYOD1和形态发生蛋白NOG可以为了解化疗耐药机制提供线索，可能导致改善治疗和临床预后。

2.材料和方法

2.1.细胞系

RD (ATCC®CCL-136™)和A-204 (ATCC®HTB-82™)购自美国类型培养收集(Manassas, VA)，并在标准条件(37°C, 5% CO)下培养_2.）在补充10％胎牛血清的DMEM高葡萄糖中。如下所述，在每个测定之前将细胞接种24小时。

2．2.药物制备及治疗

所有的药物都是按照制造商的指示准备和储存的。详细地说，阿霉素(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)， 12- o -十四烷酰基phorbol-13-acetate (TPA) (EMD Millipore, Temecula, CA)和GSK126 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA)在100% DMSO中重悬并在−20℃保存。长春新碱(AdipoGen, San Diego, CA)在无菌水中重悬，4°C保存。细胞在播种后24小时后按图中所示的剂量处理在6孔板中。药物在全培养基中稀释，最终DMSO在细胞上的浓度从不超过0.01%。

2.3。流式细胞仪

在用荧光铬缀合的抗人抗体染色之前，在制造商的方案中染色，对固定和透化的RMS和RT细胞悬浮液进行细胞内染色在用荧光染色的抗人抗体染色的微小修改。简而言之，将细胞在固定/渗液缓冲液中温育40分钟，用烫发/洗涤缓冲液洗涤，用2％兔/ 2％小鼠正常血清孵育15分钟以阻断非特异性结合。然后将细胞染色2小时，用脓性/洗涤缓冲液中的荧光色谱 - 共轭抗体的混合物：Bcl-2（克隆100）来自Biolegend，MyoD1（多克隆）和来自Bioss抗体，Myod1（克隆SPM427）和肌原素的NOG（多克隆）（克隆MgN185 + F5D）从Novus生物学和来自Santa Cruz生物技术的ID1（克隆B-8），然后在染色混合物中包含生物素化抗体（Invitrogen）染色。通过滴定曲线建立最佳抗体稀释。根据标准流式细胞术协议制备匹配同种型对照，以确定背景信号。在冰上进行所有步骤，并在黑暗中保持样品。使用8色纹状体（SAN JOSE，CA）S1000EX设备进行流式细胞术。使用CellCapture软件（Stratizigm）分析数据。

２.４.细胞增殖实验

根据制造商的协议(Invitrogen公司，Carlsbad, CA)，使用CellTrace™Violet细胞增殖试剂盒进行细胞增殖试验。简单地说，细胞在5μ在PBS溶液中放置20分钟的染料 室温下，用培养基洗涤，以0.4℃接种于6孔板中 × 10^6.细胞每孔，培养4天。然后用PBS洗涤培养板以去除非粘附的死细胞，并用0.25%胰蛋白酶/10收获活的粘附细胞 PBS中的mM-EDTA，对细胞内标记物进行染色，并通过流式细胞术进行分析。

2.5.细胞抗药性测定

将细胞接种到0.4×10的6孔板中^6.长春新碱(1和10 nM)或阿霉素(0.1和1μM) 48小时。为了进行分析，用PBS洗涤板以去除死亡细胞，用胰蛋白酶/EDTA收集贴壁细胞，用自动化细胞计数器NC-200 (Chemometec)测定细胞活力。细胞活力评估后，染色进行流式细胞术分析。

2.6。肌源性分化的诱导

将细胞接种到0.4×10的6孔板中^6.在12- o - tetradecanoylphorboll -13-acetate (TPA) (EMD Millipore, Temecula, CA)和GSK126 (AdooQ Bioscience, Irvine, CA)的存在下培养24小时，浓度分别为0.1和5μM、 分别，如前所述[31].在指定的时间点收集细胞，计数并染色以获得细胞内标记物。

2.7。统计分析

所有统计分析均使用GraphPad Prism 6 (La Jolla, CA)软件进行。单因素方差分析(One-way ANOVA test, Tukey’s correction for multiple comparison)用于评估经处理和未经处理的细胞培养中亚群之间的差异α设置为0.05。采用D’agostino & Pearson正态性检验验证数据正态分布。在某些情况下，是一对双尾t-test已被使用。

3.结果

3.1.MYOD1和Noggin表达的异质性

的蛋白表达MYOD1和诺金通过流式细胞术对RD和A-204细胞系中的基因进行评估，以评估这些标记物在细胞群中的分布。据报道，RMS肿瘤对MYOD1呈阳性，细胞间具有明显的异质性[18.]，而RT被认为对MYOD1为阴性[20.,21.]．有趣的是，我们发现MYOD1在大约5 ~ 25%的RD细胞和1 ~ 10%的A-204细胞中表达，而大多数细胞(≥80%)MYOD1低于检测水平(见表)1.）.NOG阳性细胞（NOG +）始终构成RD和A-204（30至90％）中的大部分细胞。在该群体中，10-25％和1-10％也分别在RD和A-204中的MyoD1（MyoD1 + Nog +）是阳性的。大多数（> 90％）Myod1 +细胞对于Nog也是阳性的，而RD和A-204则单阳性细胞（Myod1 + Nog-）小于Myod1种群的5％，占总量的1％。重要的是，观察到的百分比的变异性高，并且通过这2个标记鉴定的群体在连续体内（图1（a）)，这有力地说明了标记表达的动态调控和表达谱在亚群之间的转变。我们进行了进一步的实验，以确定这些标记物在化疗过程中的动态变化，并评估这些细胞亚群是否与增加的化疗耐受性或化疗敏感性有关。

3.2。Myod1 / Nog表达细胞显示出更高水平的化学化学

RD和A-204细胞用长春新碱和阿霉素处理，这两种常用的RMS化疗药物[32,33，以检测MYOD1和NOG标记在存活48小时急性治疗的细胞亚群中的表达谱。在两种细胞系中，MYOD1+ NOG+细胞的百分比均以剂量依赖的方式增加(图)1（a）和1（b））.其中，在长春新碱最高剂量时，MYOD1+ NOG+的比例增加了2.4倍( )5.9倍( )为RD和A-204(图1（b）上面板)。阿霉素也有类似的效果，MYOD1+ NOG+的比例增加了4.1倍( )16.6倍( )在RD和A-204中1（b）,下半部分)。因此，我们观察到两种细胞系的Noggin mRNA水平均呈剂量依赖性增加(补充图)S1 (a)和S1 (b))有趣的是，在a-204细胞系中观察到MYOD1 mRNA水平的剂量依赖性增加（图S1 (b))，而在RD中，mRNA水平波动，结果没有显著差异。目前，本研究分析的MYOD1/NOG亚群(MYOD1是一种转录因子，Noggin是一种分泌蛋白)没有特异性的细胞膜标记物来阻止活细胞分选(如通过荧光激活细胞分选，FACS)进行功能分析。然而，我们通过流式细胞术计算整个群体中使用标量长春新碱处理的每个细胞亚群的绝对细胞数来解决与每个标记物相关的初级耐药性(补充图)S2和S3和补充方法)。我们观察到RD细胞系整个群体的IC50为0.7 nM, MYOD1−NOG−和MYOD−NOG+亚群的IC50低于0.5 nM，而MYOD1+ NOG+亚群的细胞数量没有减少(补充图)S2）.A-204也观察到类似的响应模式(图)S3）.剂量超过1uM的阿霉素在宽波长范围内具有高水平的自体荧光([34]和个人观察），从而排除了通过流式细胞术对该药物进行相同的剂量反应分析。然而，MYOD1+NOG+细胞的百分比为0.1 μ米和1μM阿霉素（图1.)以剂量依赖的方式增加。分析BCL2的蛋白水平，BCL2是一种具有良好特征的抗凋亡标记物[35,36，我们发现在未处理的RD和A-204细胞株中，MYOD1+ NOG+亚群的表达水平更高(图)2.）.在MYOD1+ NOG+细胞中，与MYOD1−NOG−细胞相比，BCL2在MYOD1+ NOG+细胞中的表达显著提高3.7倍和4.0倍(RD: ;A-204： )与MYOD1相比，分别为1.5倍和1.6倍− NOG+细胞（RD: ;A-204： )，分别。重要的是，仅表达NOG而不表达MYOD1的细胞也显示出比双阴性(MYOD1−NOG−)细胞更高的BCL2表达水平，这表明NOG标记参与了化疗耐药。

3.3.TPA/GSK126诱导前体样MYOD1+/NOG+细胞分化，并提高长春新碱的疗效

与MYOD1相比，MYOD1+NOG+细胞的myogenin（MYOG）表达水平增加了2.3倍− NOG+单阳性细胞( )，MYOD−NOG−双阴性细胞未检测到MYOG。MYOG是驱动骨骼肌细胞分化的肌源性调节因子之一[37,38]在肌生成的后期，细胞中的MYOG表达紧随MYOD1的表达并与之重叠，在成肌细胞的终末分化中起着不可或缺的作用[39]重要的是，与MYOD1相比，MYOD1+NOG+细胞的分化抑制因子1（ID1）表达水平（ID1平均荧光强度）高2.0倍− NOG+单阳性细胞( )通过流式细胞术进行评估。

由于对化疗耐药的MYOD1+NOG+细胞表现出未分化细胞的特征，且其百分比在化疗后增加，因此测试了长春新碱和12-O-十四烷基佛波醇-13-醋酸盐（TPA）/GSK126（TPA/GSK126）的联合治疗方法。TPA/GSK126已被证明可诱导RMS细胞系的分化[31但尚未进行与化疗联合使用的试验。经TPA/GSK126治疗6天后，MYOD1+ NOG+细胞中MYOG蛋白水平显著升高，提示诱导分化。在RD细胞系中，与未处理的MYOD1+ NOG+细胞相比，TPA/ gsk126处理的MYOD1+ NOG+细胞中MYOG表达增加了1.2倍( )，在A-204细胞系中，相应地为1.3倍( ）.虽然平均upregulation MYOG表达谦虚,大约增加20%,MYOG分散的细胞亚群中蛋白质含量RD强烈减少MYOD1 +支架+细胞治疗后,指示一个健壮的感应细胞中表达水平较低的MYOG(2倍)。TPA/GSK126治疗不仅诱导MYOG表达，提示细胞分化，而且通过减少RMS细胞培养中活细胞绝对数量的平均2倍而显示出治疗效果( )（图3.)重要的是，当与长春新碱联合使用时，观察到通过进一步降低细胞活力而提高疗效。具体而言，在RD长春新碱单独使用时，与未处理细胞相比，活细胞数量减少了6.7倍，TPA/GSK126减少了2倍，而长春新碱与TPA/GSK126联合使用则减少了9.7倍丁利（图3.)因此，在RD中，长春新碱与TPA/GSK126联合使用的效果比单独使用长春新碱的效果高1.5倍，比单独使用TPA/GSK126的效果高4.8倍。在A-204细胞培养中，长春新碱使活细胞数比未处理细胞减少6.2倍，TPA/GSK126减少3.1倍，长春新碱与TPA/GS联合使用的效果更差K126 14.2倍，长春新碱的有效性增加2.3倍，TPA/GSK126的有效性增加4.6倍。

4.讨论

用标准的化疗药物治疗RMS常常由于出现耐药性和复发而失败。由于RMS肿瘤细胞对这些药物表现出肿瘤内的差异反应，因此可以推测肿瘤细胞之间存在一定程度的异质性。在这项体外研究中，长春新碱和阿霉素耐药亚群在两个患者来源的软组织肿瘤模型(a -204，一个横纹肌肉瘤细胞系，和RD，一个胚胎横纹肌肉瘤细胞系)中被鉴定为表达MYOD1和NOG标记的细胞。MYOD1+ NOG+细胞亚群在治疗前表现出BCL2蛋白表达水平升高，这表明抗细胞死亡是该细胞亚群的固有属性，导致对化疗药物的原发性耐药。

RMS和RT细胞异常增殖并保持未分化特征。然而，在肿瘤内部，细胞可能有不同程度的分化。MYOD1/NOG标记物的动态表达表明，这些细胞可能表现为能够维持肿瘤生长的早期祖细胞。MYOG是肌源性调节因子之一，位于驱动骨骼肌细胞分化的MEF2、MYF5、MRF4和MYOD1的下游[37,38]．MYOG在细胞中的表达与MYOD1在肌形成后期紧密的时间重叠，在成肌细胞的最终分化中起着不可或缺的作用[39]．此外，这些结果表明，MYOD1/NOG双阳性细胞的分化程度低于其余细胞。由于RMS被认为是前体细胞未能完成向骨骼肌分化过程的结果，因此我们研究了利用分化治疗来解决MYOD1/NOG耐药细胞问题的可能性。分化疗法的概念早在1970年代提出了基于的恶性肿瘤细胞(可能癌症干细胞或传播肿瘤细胞)分化成不那么咄咄逼人或良性细胞,可以分化成为一个替代或补充策略chemotherapy-mediated细胞毒性(40–42]．已经表明，分化治疗可以通过防止组织侵袭和转移来减少恶性肿瘤[43]白血病是迄今为止研究最多的分化治疗癌症，也是唯一成功应用的癌症[44]．然而，对于实体肿瘤，这种策略的效果有限[45,46因此，它被认为是其他治疗方法的潜在辅助剂。一些研究评估了不同肉瘤的分化治疗策略[47–51，但尚未对该方法与标准化疗联合使用及其对化疗耐药细胞的影响进行评估。ID1蛋白表达增加是前体细胞的特征[25.,52]总之，这些数据表明MYOD1+NOG+细胞是在分化过程中停止的细胞，表达高水平的MYOG和ID1。

由于RD和A-204 MYOD1+NOG+细胞（1）表现出对化疗的抵抗，（2）表现出未分化细胞的特征，（3）化疗后它们的百分比增加，长春新碱与12-O-十四烷基佛波醇-13-乙酸酯（TPA）和GSK126（TPA/GSK126）联合试验.TPA/GSK126已被证明可诱导RMS细胞系的分化[31]但尚未与化疗联合进行试验。TPA促进RD患者生长停滞和骨骼肌分化[53]通过PKCα活化[54]GSK126是EZH2的选择性抑制剂，EZH2是一种组蛋白甲基转移酶，表观遗传抑制肌源性基因的转录[48]．在这里，除了分化剂TPA/GSK126的直接作用，他们联合化疗对化疗耐药细胞群的影响被检查。分化剂TPA/GSK126诱导分化标志物MYOG在RD和A-204细胞中的表达。与长春新碱或单独TPA/GSK126相比，与长春新碱联合使用时，细胞死亡增加。

机制MYOD1和Noggin的表达对化疗耐药性的影响需要进一步阐明。MYOD1和NOG可能不积极参与该过程，但可能是其他更基本机制的指标或与之相关。MYOD1、NOG和BCL2表达水平的共表达和正相关需要进一步的机制研究c调查。

5。结论

在本研究中，在胚胎横纹肌肉瘤(ERMS)和横纹肌样瘤(RT)细胞系中研究了肌原性决定因子1 (MYOD1)和形态发生蛋白Noggin (NOG)。晚期、复发和/或转移性RMS和RT对治疗反应较差。肿瘤内的异质性是治疗耐药的主要机制之一。异构MYOD1表达水平和钉在两个细胞系,观察MYOD1 +支架+族群的细胞至关重要的是显示主要阻力长春新碱、阿霉素两种常用化疗erm和rt,除了凋亡标记BCL2表明药物抗性的表达,MYOD1+ NOG+细胞表达未分化细胞的标记物如ID1和MYOG。随后的三种药物联合长春新碱与TPA/GSK126分化治疗方法的测试表明，细胞化疗耐药的部分覆盖。

数据可用性

所有用于支持本研究结果的流式细胞术数据、细胞计数和活力数据可根据要求从通讯作者处获得。

的利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢罗文大学库珀医学院的Andrea Bottaro博士对手稿的批判性阅读。这项工作得到了库珀基金会的支持。

补充材料

图S1：经治疗的ERMS和RT细胞系中MYOD1和Noggin mRNA的相对表达水平。图S2：经长春新碱治疗的ERMS RD细胞系的剂量-反应曲线。图S3：经长春新碱治疗的RT A-204细胞系的剂量-反应曲线。(补充材料)

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