15例尤文氏肉瘤分子确诊病例中CD99和PAX8的免疫组化分析

摘要

尤文氏肉瘤是一种罕见的恶性肿瘤。考虑到临床、放射学和组织病理学方面，我们强烈建议采用多学科的方法来作出正确的诊断。因为在高达90%的病例中，t (11;22)(抓起;q12)产生嵌合融合转录本EWSR1-FLI-1。病理学家除了常规技术(苏木精和伊红)外，还有一些工具，如免疫组化，在鉴别诊断中起着非常重要的作用。我们报告了15例分子证实的ES，通过免疫组化，我们发现对CD99的敏感性为100%，对PAX8的敏感性为80%。这表明灵敏度高;然而，我们知道CD99和PAX8也在其他肿瘤中表达。因此，在所有情况下都应进行分子确证。

1.介绍

尤文氏肉瘤（ESs）相对少见，至少占原发性恶性骨肿瘤的6%。它是儿童和年轻人中仅次于骨肉瘤的第二常见骨肉瘤[1.,2.]．

目前有几种方法用于ES的诊断。应对患者进行正确的复查和体格检查，寻找主要在四肢迅速增长的肿块、疼痛和间歇性发热等体征或症状。计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI)等成像技术对于确定这些肿瘤的大小、溶骨或硬化迹象、扩展和不明确的界限至关重要。MRI在评估对新辅助治疗的反应、直接手术切除和检测局部复发或转移性疾病方面也很重要[3.]．肿瘤的组织学和免疫组化特征是正确的组织病理学诊断的必要条件。通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或荧光原位杂交(FISH)的遗传学研究表明，在大约90%的病例中，存在高度敏感的染色体易位:22)(抓起;12)。22q12上EWSR1基因与FLI111q24上的基因产生嵌合融合转录本EWSR1-FLI-1[4.]．在目前的时代，随着下一代测序（NGS）技术的出现，ES诊断的电子显微镜研究几乎已经过时了;然而，它们可用于识别不同程度的神经分区分化。

免疫组化(IHC)是一种成熟的工具，广泛用于帮助识别广泛的特定病理过程。它也被用于涉及骨骼和软组织的实验研究。除了描述性分析，用于评估不同骨参数的多参数、半定量评分系统代表了生物医学研究中包括组织病理学信息的通用方法[5.,6.]．

CD99代表一种表面糖蛋白，由位于X和Y性染色体短臂的伪常染色体MIC2基因编码[7.]．CD99 (MIC2)已被不同的作者在ES中广泛分析[8.,9]．在大约95％的ES [10]．CD99是es的非特异性标记，但它是一个非常敏感的标记[11]众所周知，许多其他小圆细胞肿瘤与间变性大细胞淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤/白血病一样，可显示轻度、局灶性和不规则的CD99免疫反应性[12,13]，差异化的滑膜不良肉瘤（圆形细胞变异）[14,15]占横纹肌肉瘤的10%至25%[16]约20%的促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤[17]横纹肌肉瘤和促结缔组织增生性小圆细胞瘤显示胞质CD99免疫反应性，而ES为典型的膜状免疫反应性。

配对盒基因-8蛋白(PAX8)是一种肾脏谱系转录因子，是甲状腺、肾脏和müllerian系统器官发生的关键转录因子[18]．在甲状腺、甲状旁腺、肾脏、胸腺和女性生殖道的上皮性肿瘤中也有表达，最常见于浆液性卵巢癌和子宫内膜样肿瘤[19]．

关于PAX8在肉瘤（如横纹肌肉瘤、恶性横纹肌样肿瘤和肾透明细胞肉瘤）中的表达，已有几项研究发表[20]．Chang等在27例ES/原始神经外胚层肿瘤(PNET)中报道了1例PAX8的表达[21]．

我们提出了一系列的15例分子证实的ES，试图找到其对CD99和PAX8的免疫反应性的意义，以确定是否有足够的敏感性用于这些肿瘤的诊断。

2.材料和方法

我们对过去6年(2014-2019年)我科15例诊断为ES的病例进行了回顾性研究。

应用的纳入标准是[1.]先前肿瘤的放射学特征及[2.]为IHC研究提供足够的10%中性缓冲福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤组织块。本综述分析的临床和放射学数据汇总在表中1.．临床和放射学数据来源于本机构使用的数据库(电子病历)中收集的报告。

一旦获得作为环钻活检、核心针活检或切除术的肿瘤组织，并在我们的病理实验室进行处理（10%中性缓冲福尔马林在至少12小时内固定，然后石蜡包埋），在所有病例中制备一组苏木精和伊红（H&E）染色的载玻片（Dako Agilent，CoverStainer）。

我们设计了一个免疫组化小组，包括CD99和PAX8（表1）2.）.使用徕卡DM2000 LED光学显微镜进行组织学和免疫组织化学分析。

在分析后阶段，我们应用了一个多参数、半定量的综合IHC评分系统，即免疫反应评分（IRS），其范围为0-12，是阳性细胞比例评分（0-4）和染色强度评分（0-3）的乘积，结果是：0-1（阴性）、2-3（轻度），4-8（中等）和9-12（强阳性）[22,23]，如表所示3.．

所有病例均采用荧光原位杂交(FISH)技术，使用双色分离探针(Vysis EWSR1 Break Apart FISH Probe Kit)检测EWSR1基因的重排。3μ所有病例均取FFPE肿瘤组织切片。制备了一组H&E染色玻片与未染色玻片的夹层，用于识别肿瘤区域。FISH的玻片预处理是根据制造商的标准建议进行的。使用徕卡DM 5500b荧光显微镜和电荷耦合器件相机(徕卡生物系统公司)捕捉图像。病理学家和生物学家使用CytoVision软件对图像进行分析。每张幻灯片至少有100个细胞被标记。只有当>20%的肿瘤细胞出现信号分裂(信号分离超过2个信号直径)时，才报道EWSR1的存在。

3.结果

３．１．临床结果

表格1.含有一起描述的15例的临床细节。年龄范围在14至73岁之间，平均为31年，24岁中位，以及14岁的模式。60％的患者年轻于30年。我们发现男性优势（66.66％的男性和33.33％的女性），性别比例为2：1。最普遍的参与现场，46.66％（7例）是长骨的变形态椎间膜部分。其他53.33％（8例）涉及来自PENINEAL，辉腾，大腿和逆流量的软组织。一个涉及胸壁和肺（Askin肿瘤）的一个案例，两种情况是肺转移。

３.２．放射学结果

在15例（100%）患者中，在活检前进行了CT和MRI的放射学研究。之后，进行了正电子发射断层扫描计算机断层扫描（PET-CT）的完整延伸研究。肿瘤的放射学大小为4 厘米至18厘米 最大直径为cm，平均值为10 cm.8例（53.33%）在诊断时表现为肿瘤累及骨组织，其中100%在放射学研究中表现为溶骨性体征。其他7例在放射学研究中表现为界限不清，如表所示1.．

３．３．组织学结果

所有病例的组织学模式均有小的变异。绝大多数病例为均匀的小而圆的细胞，胞浆透明或轻度嗜酸性周期性酸-席夫- (PAS-)阳性，胞浆膜不清晰。肿瘤细胞含有圆形细胞核，细胞核内染色质细小而均匀。部分病例显示神经外胚层分化区域(如Homer Wright莲座排列)，如图所示1（a）．

3．4．免疫组织化学结果

在12例(80%)患者中，PAX8表现为核轻到中度免疫反应(见表)4.和数字1（b）).所有病例（100%）显示CD99呈膜状弥漫性强免疫反应性（表1）3.和数字1（c））.

3.5.分子结果

所有病例(100%)在不同比例的肿瘤细胞中均存在EWSR1基因重排(见表1)4.和数字1（d））.

4.讨论

ES代表了至少6%的原发性恶性骨肿瘤，在儿童和年轻人中更为常见[1.,2.]我们报告了一系列15例经分子证实的ES病例。

在本次审查分析的患者组中，年龄范围为14至73岁，平均31岁，中位数为24岁[24]．这些结果类似于其他作者发现的年龄范围，但也可以影响老年患者作为Marilena Cesari和同事发表的结果。他们确定了从40至70岁的年龄（中位45岁）的患者的三十一名患者[25]．

最经常受到ES受影响的三个骨区是骨盆骨骼，特别是髂骨，骨干或半骨质 - 透析性部分（股骨，胫骨和肱骨）和胸壁（肋骨）。放射学上，病变可以是裂解的，混合的裂解 - 硬化，或者很少，主要是硬化。CT，特别是MRI成像在进一步描绘普通X线片上不易表现的疾病程度方面非常宝贵。镓闪烁和钆增强的MRI图像是遵循治疗的回应最好的最佳方法[26]．本研究分析的15例(100%)患者在活检前进行了CT和MRI的放射学研究。在此之后，对所有患者进行了完整的PET-CT扫描扩展研究。15例中有8例(53.33%)表现为溶骨性损伤。

现在，免疫组化仍然是病理学家和肿瘤科医师的有用工具，因为它给出了与肿瘤肿瘤发生相关的信息。免疫组织化学对未知起源的转移案例中的差异诊断至关重要。它也可用作生物标志物，提供有关对特定疗法的易感性的信息，并帮助我们确定预后和治疗因素的信息[27]．

与其他作者相比，我们在ES中CD99的免疫反应性方面获得了类似的结果。在大约95%的ES中可以看到强烈的弥漫性膜表达[10]．CD99是es的非特异性标记，但它是一个非常敏感的标记[11]通过这种方式，Baldauf及其同事提出了一种建立ES诊断的工作流程模型：对于临床和/或放射学怀疑的尤因肉瘤，应首先对活检组织进行CD99染色。如果CD99为正值（定义为IRS > 2） ，如可用，首选验证性分子诊断程序（如FISH、RT-PCR和/或NGS技术）[28]这是必要的，以排除在鉴别诊断中可能显示CD99免疫反应性的其他圆细胞肿瘤。诸如FISH和RT-PCR等分子技术可以检测EWSR1基因的重排，但它们不是ES独有的。EWSR1基因已被确定为多种临床和病理多样性肉瘤以及一些非实质性肿瘤的合作伙伴。前者包括ES和类似（尤因样）小圆细胞肉瘤、促结缔组织增生小圆细胞瘤、粘液样脂肪肉瘤、骨外粘液样软骨肉瘤、血管瘤样纤维组织细胞瘤、软组织透明细胞肉瘤和胃肠道透明细胞肉瘤样肿瘤、原发性肺粘液样肉瘤、，涎腺外肌上皮肿瘤和散发性低度纤维黏液样肉瘤、硬化性上皮样纤维肉瘤和间皮瘤[29]．为了确定ES的诊断，需要通过FISH、RT-PCR或NGS检测EWSR1基因的确切融合伴侣。大约85%的ES患者有EWSR1-FLI1融合;10%的病例中存在EWSR1- erg融合，而3%的病例中检测到EWSR1与ETS家族转录因子的其他成员融合[30]．

PAX8在ES中的免疫反应性尚未得到广泛研究。Bui等人研究了原发性肾和肾外ES/PNET的PAX8染色模式，以探索其潜在的诊断和预后作用。他们还发现PAX8在两例原发性肾ES中分别有中度(2+)和强(3+)免疫反应性，22例肾外ES中有14例(64%)也有PAX8染色。最新的染色强度从1+到3+不等。他们提出用PAX8对ES/PNET进行染色并不依赖于起始位点[31]Paul Weisman等人最近报告了一例腹腔内PAX8阳性ES。RT-PCR检测中存在EWSR1-ERG融合转录本证实了该诊断[32]．在我们的综述中，我们发现12例(80%)PAX8核表达为轻到中度。

5.结论

ES在一般人群中不常见。正确的诊断需要多学科的方法。放射学检查起着基础性作用，因为CT或MRI提供的信息包括大小、确切情况以及一些侵袭性放射学标准，如肿瘤坏死或溶骨性损伤。在我们的研究中，所有病例或患者都需要进行放射学检查在长骨上生长的软骨表现出溶骨性行为。

从病理学家的角度来看，ES的诊断是一个挑战，因为这需要将形态学和显微镜标准与临床和放射学数据相结合。免疫组化对ES的诊断和鉴别诊断具有重要意义。

在免疫组化分析中，我们发现100%和80%的病例分别表现为CD99的强烈免疫反应和PAX8的轻到中度免疫反应。这可以被认为是一个高灵敏度，即使我们的样本不是这么大。然而，CD99和PAX8在ES中的特异性是有限的，因为它的免疫反应性在许多其他肿瘤中普遍可见。需要一个完整的鉴别诊断来排除其他间质、淋巴或上皮来源的圆形细胞肿瘤，这些肿瘤也可能对这些标志物产生免疫反应。免疫组化和分子检测在几乎所有的ES病例中都是必要的，以确认诊断。

ES诊断必须通过分子测试进行确认。在所有情况下，如有可能，应进行FISH和RT-PCR以及NGS DNA测序。

这种方法需要一个更深入的分子研究和一个大的前瞻性系列来阐明PAX8在基因致癌中的意义及其对治疗反应和预后的潜在后果。

数据可用性

数据文件在Harvard Dataverse中公开提供：https://doi.org/10.7910/DVN/CDIMTD．

的利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

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