文摘
黏液样脂肪肉瘤是一种恶性软组织肉瘤,其特征是一个特殊的t(12、16)(问题;赛)易位产生融合癌蛋白,FUS-CHOP。这种癌症放射治疗是非常敏感和展品肺外转移的一种独特的模式。在这里,我们报告的生成和特征时空上限制肉瘤小鼠模型由FUS-CHOP驱动的。使用不同的Cre司机在脂肪细胞谱系,我们发起在活的有机体内表达FUS-CHOP肿瘤发生Prrx1+间叶细胞的祖细胞。相比之下,表达FUS-CHOP不会形成肿瘤细胞分化程度更高在活的有机体内,和早期癌蛋白的表达在胚胎发生是致命的。我们也使用在活的有机体内电穿孔和CRISPR技术快速生成时空上限制高档FUS-CHOP-driven肉瘤临床前研究的小鼠模型。
1。介绍
软组织肉瘤是结缔组织的肿瘤可以出现在身体的任何地方,近1/3的患者都是致命的。黏液样脂肪肉瘤(mlp)是一种恶性脂肪肉瘤,占大约30%的脂肪肉瘤,最常见的软组织肉瘤亚型。临床上,mlp的特点是其显著的放疗反应相比其他软组织肉瘤亚型(1,2]。此外,这些肿瘤转移至骨骼、肝脏和其他软组织网站,而大多数其他软组织肉瘤最常见的肺转移。mlp往往发生在四肢,特别是大腿肌肉组织内(3]。
mlp的遗传标志的t(12、16)(问题;赛)易位,近95%的病例存在(4,5),生成一个新颖的融合蛋白,FUS-CHOP [6]。的叔子也在近80%的突变mlp、暗示激活端粒的维护是很重要的在mlp肿瘤发生[7]。mlp的外显子组分析揭示了其他一些周期性突变编码序列相对于其他实体肿瘤(8]。这些数据表明,FUS-CHOP在大多数mlp肿瘤发生易位是主要的驱动程序。
FUS-CHOP融合癌蛋白,付家的n端通过一个独特的加入链接器区域与整个切蛋白质。有趣的是,转基因小鼠实验表明,付家的截短形式的表达异常砍的存在足以生成肿瘤(9]。然而,无论是截断付还是异常的肿瘤发生砍就足够。这些实验表明,协同机制造成的肿瘤发生异常付和mlp砍表达式。排骨(也称为DDIT3 / GADD153)是一种C / EBP家族蛋白在脂肪生成过程中发挥作用,是由ER应激诱导的,增长逮捕,DNA损伤(10- - - - - -12]。尽管插嘴细胞应激反应的作用,不引起电离辐射(13]。付家纯合子基因敲除小鼠对辐射敏感的和展览基因组不稳定性(14,15]。付,融合在肉瘤,是一种rna结合蛋白(RBP)是付家的成员/ EWS / TAF15(场效应晶体管)蛋白家族的RBPs包含prion-like域(PrLDs) [16,17]。其他肉瘤和场效应晶体管的家庭成员通常发生易位可能变换间叶细胞正常分化为骨祖细胞,脂肪、软骨和肌肉细胞。至少有四个FUS-CHOP记录变异存在,但记录结构不影响预后[4]。因此,FUS-CHOP似乎是主要的致癌司机mlp、但mlp肿瘤发生的确切机制还有待阐明。
mlp生物学中一个关键问题是细胞的身份。才有可能致癌融合转化细胞中表达适当的细胞类型在一个宽松的发展阶段。在这个场景中,致癌融合的表达在不同的细胞类型或错误的发展阶段并不会导致转换。在mlp、起源的细胞是未定义的。先前mlp表示FUS-CHOP无所不在的小鼠模型。虽然这些研究报告代小鼠脂肪肉瘤,肿瘤不像人类黏液样脂肪肉瘤组织学检查(18,19]。黏液样脂肪肉瘤的研究起源的细胞,我们生成的新型转基因小鼠Cre-activatable FUS-CHOP易位成绩单。我们走过这些老鼠线表达Cre重组酶在间充质和脂肪组织血统,因为mlp出现最常见的大腿和间充质来源的可能20.- - - - - -23]。最后,为了更准确的人类疾病模型与内生的易位表示付家子,我们试图用CRISPR技术用于基因组编辑生成FUS-CHOP内生老鼠基因易位。
2。材料和方法
2.1。小鼠模型生成和动物使用
Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠通过人类生成7 - 2 FUS-CHOP易位变体cDNA从NCBI数据库并生成的目标向量Rosa26轨迹(6]。的设计目标向量和新霉素盒两侧attB和attP网站与液氧转录/翻译“停止”盒式上游FUS-CHOP进一步描述部分3。R1老鼠胚胎干细胞(ESCs) electroporated使用标准技术,并与新霉素ESCs被选中。ESC测试克隆成功目标的向量Rosa26通过PCR轨迹和确认。成功线代创始人老鼠了Rosa26PhiC31 / +老鼠(JAX股票都没有。007670年(24])来重组attB和attP网站和删除新磁带。然后,小鼠与野生型小鼠129 / SvJ交叉生成Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠。这些老鼠被跨越了克里尔和细胞类型特异的Cre用以下:Meox2-Cre(JAX股票都没有。003755年(25]),PdgfRα-Cre(JAX股票都没有。013148年(26]),Prrx1-Cre(JAX股票都没有。005584年(27]),Prrx1-CreER-GFP(JAX股票都没有。029211年(28)),aP2-CreER(Yann Herault实验室的礼物29日])。
2.2。体内Cre交货或激活
老鼠缺乏Cre表达式被注射了一种腺病毒表达Cre Ad5CMVCre(爱荷华大学病毒载体核心,VVC-U Iowa-5),通过Cre重组酶激活重组。病毒是由混合25μL Ad-Cre 600μL最小基本培养基(Sigma-Aldrich M4655)。3μL 2 M CaCl2是添加到每个病毒制备、混合和孵化在室温下15分钟前注射50μL为腓肠肌肌。激活空间限制的方式认为,5毫克/毫升4-hydroxytamoxifen (4-OHT,σ,H7904)解决方案在25%乙醇/ 75%玉米油管理通过肌肉注射。解决方案是由溶解在乙醇和孵化4-OHT 60°C 2小时用颤抖的。接下来,玉米油被添加在一个3:1玉米油乙醇比例,连续震动在65°C 1小时。能整除的是储存在−80°C。20μL是注入实验老鼠的腓肠肌。之前所有的老鼠和2%异氟烷麻醉注射或手术。动物研究都是按照协议执行批准的杜克大学制度动物保健和使用委员会。
2.3。质粒结构和克隆
Tyler Jacks pSECC向量是请提供(MIT)科赫研究所(30.]。对克隆pSECC-sgp53, BbsI是用来消化pSECC和退火sgp53(表S1)被克隆到向量。sgp53是之前报道sgRNA瞄准的第7外显子序列p53在老鼠31日,32]。桑格的向量序列是一个用于测序引物针对U6发起人pSECC确认成功克隆。
2.4。基因分型
老鼠的基因用尾巴从老鼠幼崽。尾巴与KAPA老鼠基因组DNA提取试剂盒(KAPA生物系统公司,KK7352),并使用引物PCR进行补充表中列出1。PCR产品在1%琼脂糖凝胶电泳后被可视化。
2.5。腺病毒的结构和生成
的AdFC adenoviral向量是由pX333向量骨干(33]。克隆pX333-FC sgFus(表S1)和sgChop(表S1通过两轮)被克隆到px333克隆。最后,一个片段pX333-FC向量包括Cas9转基因和2 sgRNAs subcloned到Ad5 adenoviral穿梭载体所描述的Maddalo et al。33)使用XhoI和EcoRI网站生成AdFC穿梭载体腺病毒的一代。T4限制性内切酶和连接酶都是来自新英格兰生物学实验室购买。重组腺病毒是由Viraquest inc .)和验证在体外之前使用在活的有机体内。
2.6。体内电穿孔
小鼠麻醉后,50μ克裸DNA质粒在无菌生理盐水稀释使用31-gauge胰岛素注射器注入腓肠肌。最后一个DNA浓度的1μ克/μL使用,50μL是在每个注入。电穿孔是管理如前所述32]。短暂,一对电极针5毫米的差距是插入包括注射部位的肌肉,和电动脉冲被交付使用BTX电平方Porator ECM830 (BTX,圣地亚哥,CA)。三个100 V脉冲接种注射部位。每个脉冲的持续时间是200 ms,和三个脉冲50微秒。
2.7。免疫组织化学
一夜之间,肿瘤被浸泡在福尔马林溶液转移到70%乙醇,石蜡包埋,切片5μ米厚度。Deparaffinized和水化幻灯片用3%过氧化氢被封锁。抗原检索是由沸腾在2% citrate-based抗原暴露的解决方案(向量h - 3300) 15分钟。幻灯片被封锁在PBS 5%正常血清+ 0.25% Tween-20和孵化主要抗体:1:500鼠标anti-CHOP(# 2895)细胞信号,1:50只兔子anti-CD31 (Abcam ab28364), 1: 100鼠标anti-desmin(安捷伦M076029-2), 1: 200年兔anti-vimentin (Abcam ab92547), 1: 1只兔子anti-S100 (Dako GA504),和1:100只兔子anti-cytokeratin (Abcam ab9377)在PBS稀释+ 0.25% Tween-20 + 5%正常血清一夜之间在4°C。洗后,幻灯片被孵化与生物素化的二次抗体,包括1:200年马anti-mouse免疫球蛋白(向量ba - 2000)或1:200只山羊anti-rabbit免疫球蛋白(向量ba - 1000)在室温下1小时。幻灯片与VECTASTAIN孵化精英ABC试剂(向量pk - 7100)在室温下30分钟前信号可视化3,3′-diaminobenzidine (DAB)过氧化物酶底物工具包(向量sk - 4100)。组织部分被肉瘤病理学家检查(D.M.卡多纳·)。
2.8。免疫印迹
样本细胞溶解在30分钟里帕缓冲区在冰上(Sigma-Aldrich R0278),用简单地说,然后在10000 x·g离心20分钟在4°C。蛋白质浓度测定溶菌产物的上层清液由BCA化验(皮尔斯,23225)。样本中煮4 x Laemmli样品缓冲在95°C (Bio-Rad, 1610747) 5分钟,然后冷却到室温之前加载在4 - 20% Tris-glycine聚丙烯酰胺凝胶。样本在200 V电泳转移到硝基之前30分钟。膜被封锁在Tris-buffered脱脂奶粉5%生理盐水(TBS,康宁,46 - 012厘米)。接下来,一夜之间,膜被孵化在4°C主要抗体稀释TBS-T Tween-20(0.1%):付,1:1000 (Abcam ab84078);切,1:1000(细胞信号技术,2895年代);肌动蛋白1:10000 (BD生物科学,612656);p531:1000(细胞信号技术,32532年代);和p21, 1: 200(圣克鲁斯生物技术、sc - 6246)。TBS-T的膜清洗三次5分钟前二次抗体孵化与山羊anti-rabbit IRDye800 (Li-Cor生物科学,P / N, 925 - 32211年)和山羊anti-mouse IRDye680 (Li-Cor生物科学,P / N, 925 - 68070年)在1:10000稀释TBS-T 1 h在室温下。膜清洗三次在TBS-T 5分钟和成像使用奥德赛CLx (Li-Cor生物科学)。归一化图像分析和量化了使用图像工作室(版本5.2,Li-Cor生物科学,P / N, 9140 - 500年)。
2.9。定量rt - pcr
细胞与试剂盒细胞溶解试剂(热费舍尔,15596026)。RNA分离样品使用Direct-zol RNA MiniPrep工具包(R2051 Zymo研究)。RNA样本反向转录cDNA使用iScript先进的互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad, 1725038)。TaqMan从热费舍尔被用于PCR探针:Gapdh (MM99999915) Trp53 (Mm01731290) Cdkn1a (Mm00432448) Bbc3 (Mm0051926), Mdm2 (Mm01233136)和伯灵顿(Mm00432051)。盘子是运行在一个QuantStudio 6 Flex实时PCR系统(热费希尔),使用比较C和数据进行了分析T生成表达式叠化值的方法。
2.10。放射治疗
细胞培养的辐照实验前至少24小时。X-RAD 160(精密x射线)细胞照射系统是用于160千伏峰值×18马能量。一个F1过滤器(2毫米铝)是用于光束调节。样本距离设置为40厘米。一剂10 Gy,计算基于年度剂量测定法确定治疗时间230秒。
2.11。组织培养和细胞线代
NIH-3T3细胞系买来写明ATCC (crl - 1658),在DMEM培养(热费希尔科学,11965092)补充10%胎牛血清(antibiotic-antimycotic热费希尔科学,16000044)和1%(热费希尔科学,10091148)和孵化37°C公司为5%2在进行细胞培养孵化器。肿瘤细胞从初级分离小鼠肉瘤和扩展在体外使用标准的组织培养方法。短暂,肿瘤组织细胞培养中碎罩和消化分离在PBS缓冲(热费希尔科学,14040133)含有胶原酶IV型(5毫克/毫升,热费希尔科学,17104 - 019),dispase(1.3毫克/毫升,热费希尔科学,17105 - 041)以及胰蛋白酶(0.05%,热费希尔科学,25200056)1 h在37°C。细胞被洗PBS(热费希尔科学,10010023)和过滤使用40毫米筛(康宁,431750)和培养至少四个段落前耗尽基质用于实验。
2.12。基因编辑和验证
为在体外编辑、细胞转染质粒DNA使用TransIT-LT1转染试剂(Mirus生物MIR2300)按照制造商的指示。细胞收获48 - 72小时后,和基因组DNA提取DNeasy血液和组织工具包(试剂盒,69504)。为在活的有机体内编辑、老鼠注射AdFC病毒在腓肠肌肌肉或腹股沟脂肪垫。72小时后,肌肉被隔离和基因组DNA提取DNeasy血液和组织工具。编辑是评估使用土地测量员突变检测试验(IDT, 706020)和PCR。
2.13。软琼脂转换试验
1.8% Bactoagar diH2O和热压处理过的。2和1 x DMEM准备使用DMEM粉(热费希尔科学,12100046),胎牛血清(热费希尔科学,16000044),和antibiotic-antimycotic(热费希尔科学,10091148)。0.6%琼脂是由稀释1.8%琼脂DMEM和保存在一个42°C水浴。3毫升的0.6%琼脂是倒/ 6-well板和允许固化在10分钟之前转移到一个孵化器。细胞使胰蛋白酶化和计算使用锥虫蓝溶液(热费希尔科学,15250061)。250年μL细胞和500μL 0.6%的琼脂涨跌互现,轻轻的用移液器吸取到琼脂底部在每个创建0.4%琼脂顶层。5000细胞被镀在每个细胞株的一式三份。电镀后,盘子被放置在一个孵化器,并允许增长3 - 4周。媒介是补充每周增加0.5毫升的DMEM /好,防止干燥。
2.14。检测和分析染色体重组
PCR和执行的老鼠Fus-Chop ddPCR放大使用引物生成易位结(补充表1)。AccuPrime Taq DNA聚合酶,高保真(热费希尔科学,12346086),是按照制造商的说明用于PCR。QX200 ddPCR EvaGreen Supermix (Bio-Rad, 1864034)是用于ddPCR按照制造商的指示。PCR产品直接用于凝胶电泳或克隆到pCR4-TOPO TA向量(热费希尔科学、K457501) Sanger测序。ddPCR样本分析在QX200™AutoDG™滴数字™PCR系统。
3所示。结果
3.1。设计和生成条件FUS-CHOP老鼠
转基因小鼠模型的条件表达式FUS-CHOP开始,我们使用标准的转基因小鼠方法FUS-CHOP互补脱氧核糖核酸(图1(一))[6]。我们使用7 - 2易位的变种人FUS-CHOP已报道,形成肿瘤在小鼠表达组织下EF-1α子,也该小鼠模型中使用(18]。7 - 2易位变体,是第一个报道的变种被发现的易位mlp、加入的第一个7个外显子付家外显子2的框架切通过一个简短的翻译链接器最初的部分5′UTR区域切。的FUS-CHOP互补脱氧核糖核酸是插入一个向量定位鼠标Rosa26轨迹的下游LSL cassette-a转录停止盒两侧是两个loxP网站(液氧)。的Rosa26轨迹是广泛表达在老鼠的细胞和组织。LSL盒式使时间与空间限制的激活FUS-CHOP由Cre重组酶表达。一个土拨鼠肝炎病毒(WHV)转录后的监管元素聚腺苷酸化(WPRE-pA)被下游的信号FUS-CHOP互补脱氧核糖核酸来提高转基因表达。最后,我们包括Neo盒两侧attB和attP网站的3′末端目标向量的积极的选择胚胎干细胞(ES)与新霉素细胞克隆。
(一)
(b)
(c)
经过积极的选择的ES细胞克隆,他们注入囊胚,后来移植到寄养家庭。出生的嵌合幼崽基因分型来确认的FUS-CHOP互补脱氧核糖核酸在体细胞基因组DNA(图1 (b))。积极嵌合体与野生型129 /交叉SvJ小鼠和基因分型来确定生殖系的传播目标向量(图1 (c))。老鼠证实生殖系LSL-FUS-CHOP / +等位基因的传播成为创业者的交叉Rosa26PhiC-Neo / +老鼠删除新磁带。最后,这些小鼠与野生型小鼠129 / SvJ交叉,交叉PhiC /新等位基因,导致实验与基因型的转基因小鼠模型Rosa26LSL-FUS-CHOP / + (LSL-FC老鼠(图)1(一))。确认成功LSL-FUS-CHOP等位基因敲入到Rosa26轨迹和文档富达cDNA序列,我们底漆和桑格测序走去Rosa26在这些老鼠(补充图轨迹1)。
限制FUS-CHOP表达特定的间充质细胞和脂肪细胞前体的数量,我们交叉Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠各种鼠标线表达Cre重组酶(表1)。这些老鼠表示Cre重组酶的修复方式,或无所不在地从早期胚胎发生。这些Cre司机候选人的选择是基于Cre的表达在不同的发展阶段和脂肪生成34- - - - - -36]。Meox2-Cre老鼠表达Cre在整个动物早期胚胎发生(25,37]。PdgfRα-Cre老鼠表达重组酶在早期中胚层发育的后期。Prrx1表达发生晚于PdgfRα表达式中胚层发育期间,但在对脂肪细胞谱系的承诺。重要的是,Prrx1-Cre老鼠限制Cre活动大多是白色脂肪组织在雄性和雌性老鼠35]。最后,aP2(或Fabp4)是成熟的脂肪细胞中高度表达,有低水平的未分化细胞aP2表达式。
3.2。FUS-CHOP表达式的Prrx1血统驱动器Sarcomagenesis
原发性肉瘤发展Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠时,老鼠表示在特定的间叶细胞谱系Cre发展(图2和表2)。Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠了Meox2-Cre和PdgfRα-Cre老鼠胚胎致死;Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠了aP2-CreER老鼠的肿瘤患者,完全没有形成任何一年后交付的肌内4-hydroxytamoxifen (IM 4-OHT)或腹腔内它莫西芬(IP Tam)激活Cre成熟脂肪细胞(表2)。然而,肿瘤形成Prrx1-Cre;Rosa26FUS-CHOP / +老鼠。Prrx1-Cre;Rosa26FUS-CHOP / +老鼠出生后不久出现keratoacanthomas(图2(一)、补充图2)。一些群众自行解决,和36%的小鼠肉瘤发展腓肠肌或骨(图2(b))。组织学检查这些肿瘤与梭形细胞(图高档未分化肉瘤2(c))。免疫组织化学显示,这些肿瘤表达FUS-CHOP核(图2(d))。相反,肿瘤小鼠模型的未分化的多形性肉瘤LSL-KrasG12D;p53fl / fl老鼠不表达FUS-CHOP(图2(e))38]。因此,Prrx1表达的细胞是起始FUS-CHOP sarcomagenesis的宽容。
由于keratoacanthomas的形成和空间限制代肿瘤,我们交叉Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠Prrx1-CreER-GFP老鼠允许特定站点通过激活肌肉4-OHT克里尔的肿瘤生成。这些小鼠肿瘤形成相似的外显率(33.3%)相比,老鼠的Cre表示Prrx1从出生(表的启动子2)。然而,我们观察到肿瘤并不局限于注射部位,可能由于相信系统的泄漏。泄漏的进一步证据在noninjected肿瘤的形成Prrx1-CreER-GFP,Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠。
肌内注射腺病毒表达的Cre重组酶(AdCre)小鼠致癌基因的激活条件喀斯特G12D和删除p53(LSL-KrasG12D;p53fl / fl)生成主软组织肉瘤与高外显率我们之前报道38]。注入AdCre的腓肠肌肌肉Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠来激活FUS-CHOP表达式是不足以形成肿瘤(表2)。人类大多数mlp与内源性肿瘤易位有1:1:1化学计量比野生型付,野生型切,FUS-CHOP。因此,我们培育Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠纯合性更准确地模仿这种化学计量学在老鼠。激活的两个副本FUS-CHOP通过AdCre交付Rosa26LSL-FUS-CHOP / LSL-FUS-CHOP老鼠也不足以产生肿瘤。有趣的是,激活FUS-CHOP同步删除p53通过AdCre交付Rosa26LSL-FUS-CHOP / +,p53fl / fl老鼠是足以产生肿瘤(表2)。同样的,当两份FUS-CHOP被激活p53co-deletion,肿瘤也形成了。最重要的是,因为没有形成肿瘤Rosa26LSL-FUS-CHOP / +或Rosa26LSL-FUS-CHOP / LSL-FUS-CHOP小鼠的完好无损p53,这些数据表明FUS-CHOP-driven肉瘤小鼠依赖于失活p53或者是p53途径。
3.3。FUS-CHOP-Driven肿瘤的分子表征所示p53路径依赖
为了避免keratoacanthomas暂时和空间限制肿瘤的形成发展临床前模型来研究FUS-CHOP-driven sarcomagenesis在活的有机体内,我们生成的Rosa26FUS-CHOP;p53(FCP)模型,它提供了一个包含Cre质粒(pSECC-sgp53)激活表达FUS-CHOP, Cas9和p53单导RNA (sgRNA)、sgp53创建插入/删除(indels)p53(图3)[30.]。交付pSECC-sgp53,但不是控制pSECC质粒炒sgRNA (sgScr),通过电穿孔到腓肠肌肌肉产生原发性肉瘤约9 - 12周(数据外显率100%3 (b)和3 (c)、表2)。CD31染色的肿瘤显示分支“鱼尾纹”血管肿瘤模型(图3 (f))。“鱼尾纹”mlp的脉管系统是一个特殊的特性2]。然而,肿瘤缺乏黏液样基质背景人类mlp(图中找到3 (d))。相反,这些肿瘤组织学检查像高档肉瘤细胞性高。进一步描述FUS-CHOP-driven肿瘤,我们执行包含IHC标记表示在不同组织血统(图3 (g))。喀斯特G12D;p53- / -(KP)小鼠未分化的多形性肉瘤为阴性细胞角蛋白,并与分散树突细胞类型混杂在一起出现焦积极S100的检测。相比之下,FUS-CHOP肿瘤阴性细胞角蛋白和S100,这表明这些肿瘤可能并不来源于上皮细胞或神经嵴血统。此外,由于CD31包含IHC(图3 (f))只有积极在血管和肿瘤细胞,肿瘤不太可能来源于内皮细胞。然而,KP和FUS-CHOP肿瘤波形蛋白阳性符合地区间充质来源和不完整的肌间线蛋白阳性的肿瘤。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
进一步调查的作用p53在FUS-CHOP-driven肉瘤,我们审问p53信号在原发肿瘤细胞系来源于不同p53状态(图4(a))。例如,0592年和1536年肿瘤代表两个肿瘤形成,没有故意删除p53。肿瘤相比之下,1650年、2148年、2149年和2150年形成了CRISPR-mediated indelsp53。这些肿瘤都有强劲的表达FUS-CHOP蛋白质(图4(b))。NIH-3T3细胞作为负控制FUS-CHOP表达式,和gene-edited 3 t3细胞线窝藏FUS-CHOP内生轨迹作为积极的控制(3 t3-fc)。我们从这些肿瘤生成稳定的细胞系和辐照细胞激活10 Gy x射线辐射p53。1小时后,我们收获的细胞和西方进行印迹p53和p53p21转录目标描述的状态p53和p53分别为通路(图4(c))。西方墨迹图显示,p53不是肿瘤细胞系中表达0592年,1650年和2148年。在indelsp53是故意设计的在活的有机体内通过CRISPR / Cas9肿瘤1650年和2148年开始时,肿瘤0592可能遗失了p53通过克隆选择在活的有机体内。2149细胞系来源于肿瘤显示了强劲p53表达即使没有辐射。这个肿瘤是在活的有机体内CRISPR / Cas9,高基线p53表达式表明,p53稳定点突变可能是生成通过nonhomologous end-joining (NHEJ)修复后CRISPR / Cas9编辑。因为p21不是诱导在这个细胞株辐照后,过表达p53似乎非功能。虽然p53表达和诱导肿瘤细胞系中检测到来自1536年p53在这个细胞株未能诱导p21表达,这表明表示p53非功能。审问p53信号在肿瘤细胞系更多的定量,我们执行中存在测量数的表达变化p53目标基因如彪马,p21 Cdkn1a (),Mdm2,伯灵顿1小时后辐射(图4(d))。感应的p53目标FUS-CHOP细胞系的基因表达受到了损害,但不是在3 t3积极控制细胞系,功能p53。我们也观察到高基线p21水平在一个细胞系来源于FUS-CHOP-driven肿瘤(1650)。这个细胞株没有表达p53蛋白p21激活观察照射后通过p53独立的机制。综上所述,这些数据表明,在老鼠FUS-CHOP-driven肿瘤p53本身或其下游信号必须为肿瘤发生破坏。在模型中发起CRISPR / Cas9基因编辑使用p53sgRNA,p53是灭活肿瘤起始。其他模型的Cre / loxP技术激活表达FUS-CHOP没有直接的目标p53看来,克隆选择驱动器p53通路在肿瘤发生失活在活的有机体内。
3.4。代的内生易位在体外
除了产生转基因小鼠模型的条件表达式FUS-CHOP组织的方式,我们也设计了一个策略来生成内源性FUS-CHOP染色体重组在活的有机体内使用CRISPR / Cas9技术(图5)。这种方法将使快速、特定站点代原地小鼠肿瘤由FUS-CHOP易位表示从内生付轨迹haploinsufficiency付和排骨。生成FUS-CHOP融合,我们修改了dual-guide质粒系统描述Maddalo et al。33),以下简称pX333-FC,交付sgRNAs瞄准付家和切分别为7基因内区和内含子1(图5(a))。帮助选择和浓缩的细胞窝藏易位,我们克隆版本的pX333-FC含有嘌呤霉素抗性标记或在转染GFP使用。
与pX333-FC NIH-3T3细胞转染,基因组DNA化验使用测量员核酸内切酶检测突变和确认Cas9活动目标位点(图5(b))。Cas9-mediated双链网站的乳沟,indels形式由于nonhomologous end-joining (NHEJ)修复。PCR扩增子的利益其次是变性的重复周期和退火将产生扩增子形成不匹配。测量员核酸内切酶特别是裂解位点的DNA不匹配时,将产生两个片段在凝胶上运行。这里,乳沟产品演示成功的存在和具体CRISPR / Cas9活动。此外,t(7; 10)易位检测PCR(图5(c))和测序(图确认5(d))。这个实验表明,pX333-FC可以用于生成Fus-Chop易位NIH-3T3细胞。我们已经成功地使用这种方法来生成融合在其他细胞系来源于KP小鼠肉瘤(38)(补充图3(一个))。
使用这种方法,我们生成一个稳定Fus-Chop-expressing NIH-3T3细胞系使用CRISPR / Cas9技术。首先,我们pX333-FC-GFP质粒转染到NIH-3T3细胞和排序单GFP-positive细胞流入96 -孔板。殖民地形成从单细胞PCR筛选的融合转录结。此外,使用两种不同的抗体免疫印迹付,砍了成功costaining约70 kDa,与以前公布的数据一致FUS-CHOP癌蛋白,并预测大小(图5(e))。
评估这些细胞系的转换功能,我们在软琼脂转换进行化验。只有NIH-3T3细胞阳性FUS-CHOP后基因组编辑可以在软琼脂(图形式的殖民地5(f),补充图3 (b))。这些细胞也形成肿瘤后,20天的后肢肌内注射3 3 NCr裸体小鼠(补充图3 (c))。没有在异体骨移植的肿瘤形成的控制缺乏FUS-CHOP NIH-3T3细胞同种异体移植物实验期间6周。
3.5。CRISPR-Mediated染色体重组在活的有机体内
确定生成内源性染色体重组的效率通过CRISPR / Cas9可能建立的重要意义在活的有机体内模型使用这种方法,因为针对关键的祖细胞诱导致癌易位可能启动一个技术障碍小鼠的肿瘤。评估的效率产生内生Fus-Chop易位在体外,我们使用pX333-FC-GFP产生内生Fus-Chop KP肉瘤细胞株表达。我们筛选229单KP细胞隔离9阳性的单细胞克隆FUS-CHOP易位(大约3.9%的效率)(补充图3(一个))。
我们试图生成Fus-Chop易位在野生型小鼠内源性轨迹通过使用腺病毒,AdFC,提供两个sgRNAs Cas9目标各自的内含子付家和切(图5(a))。我们克隆和验证AdFC生成原地肿瘤表达Fus-Chop野生型老鼠。AdFC成功生成的内生Fus-Chop易位在体外和在活的有机体内检测到的易位junction-specific PCR(图6),但我们从来没有观察到129年野生型肿瘤/ SvJ小鼠注射AdFC(表2)。因为我们能够探测到Fus-Chop易位在基因组DNA从老鼠的腓肠肌肌肉注射AdFC,这表明t(7; 10)易位成功在肌肉细胞生成,但没有足够的转换。因为我们之前实验建议p53失活是重要FUS-CHOP-driven老鼠体内的肿瘤发生,我们试图启动肿瘤生成t (7; 10)p53fl / fl老鼠被co-administering AdCre,删除p53和AdFC工程师易位。这些病毒产生肿瘤的老鼠coinjected(表2)。这些数据从我们的转基因小鼠模型,结果表明,易位可能过于低效率在活的有机体内设置生成肿瘤。更精确地测量的效率产生CRISPR-mediated易位,我们使用滴数字PCR (ddPCR)。我们转导NIH-3T3细胞在体外在感染的不同多样性(MOI) AdFC病毒和ddPCR量化(补充图提取基因组DNA4)。易位效率被证实是大约3%在体外(数据6(c)和6(d))。我们假设效率可能会降低在活的有机体内是一代某些癌症的瓶颈,需要多个肿瘤发生的基因突变,如FUS-CHOP-driven肿瘤。
4所示。讨论
特定的肉瘤亚型港特定的基因融合,这可能推动sarcomagenesis这些肿瘤(39]。染色体重组长期以来被认为是重要的肉瘤的诊断和治疗,但这些基因的生物学作用融合在sarcomagenesis知之甚少。这里,我们生成和多种转基因小鼠模型的特征FUS-CHOP-driven肉瘤sarcomagenesis所需解剖分子事件在活的有机体内。
我们成功地生成由FUS-CHOP小鼠肉瘤,概括人类mlp的“鱼尾纹”脉管系统组织学检查和类似高档软组织肉瘤。这些FUS-CHOP-driven肿瘤主要是在起源和间叶细胞不表达标记上皮的分化、血管或神经嵴组织基于包含IHC(数字3 (f)- - - - - -3 (g))。在老鼠身上,我们发现改变p53途径所需FUS-CHOP-mediated肿瘤发生。使用在活的有机体内电穿孔CRISPR / Cas9技术,我们也产生了时空上与高外显率限制FUS-CHOP-driven肉瘤模型形式。因为不同的肉瘤亚型似乎源自不同的间充质细胞谱系,我们假设FUS-CHOP-driven sarcomagenesis可能的修复。
解决这个问题,我们使用一个条件基因表达策略,允许我们限制FUS-CHOP致癌基因表达特定组织血统在活的有机体内(图1和表1)。我们的小鼠模型表明,特定的组织和发展阶段是FUS-CHOP-driven肿瘤形成的宽容。具体地说,组织表达Prrx1早期中胚层和间叶细胞祖细胞的标记在多个组织(27FUS-CHOP-driven肿瘤),是宽松的。我们发现早期胚胎FUS-CHOP的表达式Meox2-Cre和PdgfRα-Cre老鼠是致命的。此外,FUS-CHOP的表达式aP2表达的细胞,如成熟的脂肪细胞,没有形成肿瘤。重要的是,虽然我们的小鼠模型识别Prrx1表达细胞的来源FUS-CHOP-driven肿瘤细胞表达PdgfRα不能排除作为FUS-CHOP-driven潜在肿瘤起源细胞肿瘤。在PdgfRα-Cre老鼠,所有细胞表达PdgfRα在胚胎早期表达FUS-CHOP导致胚胎杀伤力,但成年小鼠组织表达PdgfRα可能仍然被FUS-CHOP宽松的转换。尽管这个警告,我们表明,并不是所有的组织都是宽容的转换通过FUS-CHOP实验使用三个小鼠模型(表2)。首先,aP2-CreER,Rosa26FUS-CHOP / +鼠标表明,在分化的脂肪组织表达aP2,FUS-CHOP不足以启动肿瘤发生。第二,我们表明,Rosa26LSL-FUS-CHOP / +老鼠,激活FUS-CHOP腓肠肌肌肉通过AdCre政府也不能满足转换。在人类mlp肿瘤,除了FUS-CHOP易位的形成,一个野生的副本和付家砍丢失和付家的化学计量比砍FUS-CHOP是1:1:1。因此,我们使用的第三个模型FUS-CHOP-driven肉瘤问基因剂量FUS-CHOP-driven变换是非常重要的。激活两份FUS-CHOP腓肠肌肌肉的Rosa26LSL-FUS-CHOP / LSL-FUS-CHOP老鼠通过AdCre管理没有形成肿瘤。综上所述,这些模型证明FUS-CHOP干扰正常发展时表示早期仅在胚胎发生和FUS-CHOP表达不足以启动sarcomagenesis分化细胞。此外,基因剂量不能克服遗传或表观遗传障碍,限制的组织性质FUS-CHOP-driven sarcomagenesis。
我们得出这样的结论在活的有机体内实验,FUS-CHOP不足以驱动在所有细胞类型和肿瘤发生Prrx1血统是宽松的变换。接下来,我们假设,除了组织特异性,可能还有其他分子的决定因素FUS-CHOP-driven sarcomagenesis。p53据报道在mlp突变,所有肉瘤最常见的突变基因(23,40- - - - - -42]。过度的p53与减少转移无病生存在本地化mlp [4],mlp已经生成的模型p53零背景(23,43]。这些研究表明,p53在大多数mlp起始和发展中扮演一个重要的角色。不过,最早的mlp小鼠模型不需要p53缺失或失活,这表明失活p53不需要sarcomagenesis [9,44]。澄清的作用p53在FUS-CHOP-driven sarcomagenesis,我们交叉Rosa26LSL-FUS-CHOP / +和Rosa26LSL-FUS-CHOP / LSL-FUS-CHOP小鼠p53fl / fl老鼠(表2)。管理AdCre成功生成肿瘤只在液氧的老鼠p53等位基因和p53删除在肿瘤。此外,尽管成功建模FUS-CHOP-driven肉瘤Prrx1组织血统没有目标p53突变,免疫印迹分析原发肿瘤细胞系来自这些肿瘤显示p53在这些肿瘤蛋白质是缺席或非功能性(图4(c))。诱导基因表达在一些p53下游靶基因在电离辐射也没有FUS-CHOP-driven肿瘤细胞株(图4(d))。因此,这些数据表明,FUS-CHOP-driven sarcomagenesis在老鼠身上p53pathway-dependent,需要的失活p53。虽然它很确定p53是重要的预防肿瘤发生条件因地制宜删除或击倒p53为老鼠sarcomagenesis[是不够的32,38]。相比之下,FUS-CHOP-driven肉瘤模型外显率达到100%Rosa26LSL-FUS-CHOP / LSL-FUS-CHOP;p53fl / fl老鼠在2 - 3个月。这种差异表明FUS-CHOP表达导致小鼠肉瘤的发展。
转基因小鼠模型表达人类转基因解剖肿瘤发生机制的有力工具。然而,外源转基因的规定可能不同于基因表达的内源性轨迹。最准确的模型FUS-CHOP-driven sarcomagenesis,我们假设CRISPR / Cas9技术可以应用到生成t(7; 10)易位(相当于t(12、16)在人类)在小鼠内源性轨迹。这种方法的优点包括基因融合表达的内源性启动子在生理水平在野生型中付家启动子/增强子的监管,同时编辑haploinsufficient为野生型的基因组付家和野生型切。我们生成和验证一个腺病毒,AdFC交付Cas9和sgRNAs付家和切生成t(7; 10)(图6)。虽然这种方法是有效的在体外,没有肿瘤形成在活的有机体内(图5、表2)。基于我们之前的发现,我们也假设缺乏同步p53失活可能阻止肿瘤形成。为了验证这个假设,我们co-delivered AdCre AdFC进p53fl / fl老鼠,但是我们没有观察到肿瘤(表2)。因此,我们认为,低在活的有机体内易位效率可能是一个技术障碍CRISPR-mediated肿瘤发生在这个系统。虽然CRISPR / Cas9每个基因敲除小鼠模型只需要一个打击,易位模型,每个单元格编辑只有两个机会形式重组之前PAM网站被破坏和不可能进一步编辑。此外,NHEJ修复必须生产出的产品,是在坐标系没有删除,这进一步降低了生成功能融合蛋白的效率。ddPCR易位事件和量化在活的有机体内易位检测表明,尽管在老鼠易位正在形成,不够宽容的细胞FUS-CHOP-driven肿瘤发生是编辑形成肿瘤。另外,尽管重组发生在细胞,这些易位不是发生在一个允许细胞类型。额外的研究DNA拓扑和物种特异性的作用区别人类和老鼠可能会进一步阐明生物学translocation-mediated sarcomagenesis。
总之,我们报告的生成多个条件FUS-CHOP-driven肉瘤小鼠模型和显示Prrx1表达细胞黏液样脂肪肉瘤的一个潜在来源。我们还表明,脂肪细胞分化不转换FUS-CHOP和宽容p53通道失活老鼠sarcomagenesis所需。我们证明CRISPR / Cas9可以用来快速生成FUS-CHOP易位在活的有机体内和在体外,但易位效率、发展阶段和组织特异性肿瘤发生障碍。这些转基因小鼠模型和小说CRISPR工具将加快研究FUS-CHOP translocation-driven sarcomagenesis,可以作为宝贵的FUS-CHOP-driven肉瘤的临床前模型研究应对放疗,化疗,治疗和小说。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果中包括文章和补充信息文件(年代)。
的利益冲突
所有作者声明没有利益冲突有关的出版。大卫·g·基尔希接收财务赔偿并服务于Lumicell的科学顾问委员会,Inc .)创始人之一他也是一个和接收股票从XRAD疗法。这些利益不直接相关的工作。
作者的贡献
m . C。,一个。V., and D. G. K. designed experiments. M. C., E. S. X., N. H. L., L. L., and Y. M. performed experiments. M. C. and E. S. X. performed在活的有机体内电穿孔。m . c, n . l .进行免疫印迹和组织文化。m . C。,E. S. X., and Y. M. performed histology, and D. M. C. analyzed H&E and IHC slides. M. C. and L. L. bred and maintained animals. A. V. and D. G. K. interpreted results and provided critical advice for the manuscript. M. C. and D. G. K. drafted the manuscript. All authors edited the manuscript.
确认
作者感谢Yann Herault慷慨地提供aP2相信老鼠和广州慷慨地提供Prrx1相信老鼠。作者承认公爵癌症研究所转基因老鼠在设计核心的援助Rosa26LSL-FUS-CHOP针对构造和生成Rosa26LSL-FUS-CHOP老鼠。这项工作是由美国国家癌症研究所支持,NIH(奖号。F30CA206424 T32GM007171 m . c和d·g·k . R35CA197616)和由杰弗里Beene癌症研究基金会(v)和斯塔尔财团(v)。
补充材料
补充表1。益生元序列引物和sgRNAs使用。补充图1 - 4。桑格测序,组织学,克隆筛选,转换化验和ddPCR原始计数。(补充材料)