文摘gydF4y2Ba

免疫疗法适应症仍不清楚,这是一个伟大的实时患者免疫状态监测的必要性。在这项研究中,我们证实了当地和系统性免疫档案的原位骨肉瘤模型有或没有荧光素酶转染在统计学上等价的。接下来,我们使用流式细胞仪来描述系统性免疫细胞的数量受骨肉瘤疾病恶化的影响。vehicle-inoculated虚假的老鼠相比,发现肿瘤小鼠显著immunophenotype干扰大约在11周后接种(那时90%原发性肿瘤的小鼠暴发性肺转移)。自然杀伤细胞和T调节细胞的数量百分比增加肿瘤小鼠的脾脏(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba而夏姆斯。此外,肿瘤小鼠的脾脏T淋巴细胞显示增加Tim-3 / PD-1疲惫状态(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba还有人口百分比的增加骨髓细胞和整体M1 / M2巨噬细胞标记表达对肿瘤小鼠脾脏与控制(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba最后,治疗20gydF4y2BaμgydF4y2BaggydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1 T细胞减少疲惫回到虚假的地位,相应增加CTLA-4表情细胞毒性T细胞在大多数老鼠进行测试。检查点也增加了脾单核细胞成熟并返回抑制巨噬细胞M1 / M2标记表达虚假的地位。这些数据表明,癌症诱发系统性免疫失调,这些变化可能会阐明和用于治疗目的抽样系统通过脾脏免疫环境。此外,与检查点抑制剂治疗gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1可能中和而不是克服系统性免疫变化引起的恶性发展。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

骨肉瘤是一种非常激进的肿瘤骨,没有实现的新疗法临床三十年来(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。其极端的多形性和高抗原负载(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)让它看似主要候选肿瘤免疫疗法,可以诱导对癌细胞neoantigens可持续的免疫力,从而提供一个可行的治疗策略克服异质性;但是,没有免疫疗法目前涉及的标准护理治疗骨肉瘤。的恶性过程会导致广义免疫功能紊乱和疾病进展(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba6gydF4y2Ba跨多个肿瘤类型),成功通过引入各种免疫疗法进入全身循环包括单克隆抗体检查点阻滞剂如对编程death-ligand 1 (PD-L1)及其受体,程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1) [gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。PD-L1表达在肿瘤和抗原呈递细胞(apc),而其受体PD-1激活T细胞表达;这种交互抑制t细胞活动和与t细胞疲惫(TCE),抑郁状态效应函数和无效能带来的慢性抗原暴露和缺氧gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。PD-L1骨肉瘤肿瘤通常是积极的,它的表达可以移植转移与主要病变(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。虽然封锁这种蛋白质相互作用经历了在某些癌症临床成功,仍有困惑围绕其特定的适应症和只有少数显示响应(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba];转移性骨肉瘤的临床前小鼠模型显示阻力PD-L1 / PD-1封锁[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。此外,目前还没有可靠的方法监测或预测病人应对任何免疫疗法包括检查点阻滞剂,和正在寻找相关的生物标志物gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。事实上,这种性质的数据可能会允许临床医生根据需要调整方案在实时和最大功效可能会发现原因为什么像骨肉瘤肿瘤仍很大程度上对免疫疗法尽管他们高neoantigen负载。从目前一些研究骨肉瘤肿瘤免疫学、数据支持的重要性出现巨噬细胞M1 / M2极化和t细胞疲惫和激活肿瘤间隙,虽然范围一般局限于主要的病变(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。我们认为这些数据需要进一步调查的翻译macrophage-T细胞动力学系统和我们如何使用这些信息引发临床抗肿瘤免疫的病人。在目前的研究中,证实了免疫后两个模型之间的等效性骨肉瘤(有或没有引入病毒的荧光素酶记者向量gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba成像系统(新)可视化),我们进一步明确骨肉瘤的免疫学后果疾病进展。我们也调查的系统性影响单一疗法和检查点的封锁PD-L1使用脾脏免疫状态的晴雨表。总体的假设是脾脏可以作为指标来评估临床相关的变化所带来的系统性macrophage-T细胞immunophenotype骨肉瘤疾病进展和免疫疗法。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。动物gydF4y2Ba

雌性BALB / c小鼠年龄在4 - 5周,20到25克(意味着= 22.5克)的质量得到杰克逊实验室(巴尔港,我)。老鼠分别安置在通风艾伦镇笼子在环境温度下在特定无菌设施玉米穗轴床上用品与12小时光/暗周期,自动lixit水,和食物随意访问。机构批准的所有实验动物保健和使用委员会。gydF4y2Ba

2.2。增长和转染野生型K7M2细胞的准备gydF4y2Ba

K7M2细胞生长和准备如前所述gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。简而言之,野生型(WT)和genome-stable luciferase-transfected (TF) K7M2在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)含10%胎牛血清的边后卫和100单位/毫升青霉素和链霉素(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)。通过一个细胞被用于原位植入的一百万个细胞密度25gydF4y2BaμgydF4y2BaL(磷酸缓冲盐(PBS)没有钙或镁(纽约康宁公司,康宁公司)。gydF4y2Ba

2.3。骨肉瘤BALB / c K7M2同系的小鼠模型gydF4y2Ba

K7M2细胞接种到胫骨或车辆被手术的女性BALB / c小鼠如前所述[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。简单地说,25gydF4y2BaμgydF4y2BaL(包含一百万特遣部队或PBS WT K7M2细胞被分发到皮质窗口通过中心的胫骨近端胫骨耀斑的水平。gydF4y2Ba

WT和TF肿瘤小鼠监控如前所述gydF4y2Ba22gydF4y2Ba依照我们机构的肿瘤负荷评分系统。肿瘤是每天监测使用数字卡钳(最大宽度×最大长度)。肿瘤体积计算使用公式V =(长×宽gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba)/ 2。每只动物的健康评估使用肿瘤得分从0到60(0 =健康动物;60 =需要安乐死)基于标准建立了我们的机构对整体动物健康如前所述gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。一旦达到小鼠肿瘤60分(约11周后接种),动物人道地使用二氧化碳窒息安乐死。gydF4y2Ba

肿瘤如前所述收获(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。简单地说,动物的肿瘤平均达到1.7厘米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba接受姑息手术解剖和臀部关节脱落。使用4 - 0 vicryl缝合皮肤边缘被关闭。肿瘤是分离和准备流式细胞术分析如下所述。一旦肿瘤成绩达到60(约11周后接种),动物安乐死和脾脏收获准备流式细胞术(FC)分析。gydF4y2Ba

2.4。流式细胞术分析肿瘤和脾脏gydF4y2Ba

切除原发肿瘤和脾脏从每个老鼠都碎和消化保持酶的使用mac组织分离包(Miltenyi研究,赤褐色,CA),根据制造商的指导方针。分离后,每个样品过滤70gydF4y2BaμgydF4y2Ba过滤器(Miltenyi研究)和离心机在300 g×10分钟;细胞颗粒resuspended rpmi - 1640。每个单细胞悬液是分成两个。一半的肿瘤单细胞悬浮红细胞裂解处理解决方案(Miltenyi研究),洗两次,统计。gydF4y2Ba

脾脏单细胞悬浮体和肿瘤的另一半单一细胞悬浊液分层在Ficoll-Paque溢价(通用电气医疗集团生命科学、匹兹堡、PA)和离心机在400 g×40分钟20°C允许密度梯度分离白细胞。聚蔗糖后,白细胞(淡黄色的大衣)是收获,与PBS洗两次,统计。gydF4y2Ba

单细胞悬浮体染色后的标准协议。使用流式细胞仪缓冲区,细胞被洗(PBS、2%的边后卫和叠氮化钠0.02%)。细胞颗粒resuspended,阻止使用老鼠老鼠免疫球蛋白g和免疫球蛋白(杰克逊ImmunoResearch西树林,PA),洗,孵化与相应的抗体下面描述。孵化后,细胞被洗,多聚甲醛固定,储存在4°C。gydF4y2Ba

2.4.1。面板1抗体gydF4y2Ba

αgydF4y2Ba-CD45-phycoerithrin cyanine5 (BD生物科学,圣何塞,CA),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CD4-BV510 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Ly6G-V450 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CD8a-Alexa萤石488 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba圣地亚哥-NKp46-PE-eFluor 610 (eBioscience CA),gydF4y2BaαgydF4y2Ba700年-CD11b-Alexa萤石(eBioscience)gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Foxp3-phycoerithrin (eBioscience)gydF4y2Ba

2.4.2。面板2抗体gydF4y2Ba

αgydF4y2Ba-CD45-phycoerithrin cyanine5 (BD生物科学)和gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1-phycoerithrin cyanine7 (eBioscience)gydF4y2Ba

2.4.3。小组3抗体gydF4y2Ba

αgydF4y2Ba-CD45-phycoerithrin cyanine5 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CD4-BV510 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CD8a-Alexa萤石488 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba圣地亚哥-Tim-3-PerCP / Cy5.5 (BioLegend CA),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-1-eFluor 450(热费希尔科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CTLA-4-PE / Cy7 (BioLegend),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Foxp3-phycoerithrin (eBioscience)gydF4y2Ba

2.4.4。面板4抗体gydF4y2Ba

αgydF4y2Ba-CD45-phycoerithrin cyanine5 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CD11b-Alexa萤石700 (eBioscience),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Ly6G-V450 (BD生物科学),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Ly6C-PerCP / Cy5.5 (eBioscience),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CXCL9-phycoerithrin (eBioscience),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-NOS2-PE-cyanine7 (BioLegend),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Tgm2-Alexa488(罗福斯生物制品,利特尔顿有限公司)gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Arg1-APC(研发系统、明尼阿波利斯、锰)gydF4y2Ba

所有细胞的数量和/或相关的标记,它们用于这个手稿在表中定义gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

Foxp3染色,洗后细胞流式细胞仪缓冲区,这些细胞被处理通过一组Foxp3 /转录因子染色缓冲区(eBioscience)根据制造商的指示。简单,细胞颗粒resuspended和1.0毫升的稀释(1:3比例)Foxp3固定/透化作用缓冲了。样品在4°C涡和孵化过夜。第二天,细胞被洗两次1 x Foxp3缓冲和孵化gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Foxp3-phycoerithrin (eBioscience),用1 x Foxp3缓冲区,和resuspended流式细胞仪缓冲区。gydF4y2Ba

面板4包括M1 / M2巨噬细胞的细胞内染色标记。对于这个小组,洗后细胞流式细胞仪缓冲区,这些细胞被进一步加工利用细胞内抗原染色胞内抗原的缓冲设置(BioLegend)根据制造商的指示。简单地说,细胞颗粒resuspended, 100gydF4y2BaμgydF4y2BaL intracellular-fixation缓冲区是补充道。脉冲涡流后,一夜之间细胞在4°C的环境。第二天,细胞被洗两次1 x透化作用缓冲区,孵化的混合液gydF4y2BaαgydF4y2Ba-CXCL9-phycoerithrin (eBioscience),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-NOS2-PE-cyanine7 (BioLegend),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Tgm2-Alexa488(罗福斯生物制剂),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-Arg1-APC(研发系统),洗两次1 x透化作用缓冲区,和resuspended流式细胞仪缓冲区。gydF4y2Ba

细胞进行分析,数据收集的BD LSRFortessa (BD生物科学)使用BD流式细胞仪天后8.0版本软件位于流式细胞术和单细胞核心设施。单一使用OneComp珠子eBeads生成彩色控制(eBiosciences)。至少50000个细胞对每个样本进行了分析。数据分析使用FCS表达6软件(新创软件,格兰岱尔市,CA)。gydF4y2Ba

2.5。t细胞疲惫状态(tc)gydF4y2Ba

T细胞表达疲惫标记PD-1和/或T细胞免疫球蛋白和mucin-domain包含3 (Tim-3)表现出抑郁效应函数和无法增殖(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba];疲惫Tim-3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和PD-1gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba发现了T细胞在骨肉瘤肿瘤组织(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。为了正确比较表达这些TCE标记t细胞剧目在小鼠不同细胞计数,我们归一化总t细胞的人口百分比得出一个整体疲劳状态我们称之为TCE状态(tc)计算由以下方程:gydF4y2Ba

的话说,tc =总PD-1 CD4和Tim-3百分比表达gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(Th)和CD8 T辅助细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞毒性T细胞(ctl)除以总T细胞(CD4人口百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba)取样。这个方程收益率exhaustion-marker表达T淋巴细胞的比例每总淋巴细胞百分比人口和是由同行评议的数据显示,PD-1 Tim-3表情T细胞与TCE的程度(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。正常化的总t细胞数量百分比可以跨多个不同的样本,比较不同t细胞数量。gydF4y2Ba

2.6。gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1治疗gydF4y2Ba

老鼠能有20gydF4y2BaμgydF4y2Bag(1毫克/公斤)gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1(克隆MIH5 eBioscience)通过腹腔内注射每周一和周四当肿瘤第一次明显的开始,一直延续安乐死(约11周后肿瘤细胞接种)。文献中使用的标准剂量是200gydF4y2BaμgydF4y2Bag(10毫克/公斤);然而,1毫克/公斤的用量在先进的人类癌症的临床活动开始(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),虽然延长治疗时间与剂量高达20毫克/公斤对转移性肿瘤K7M2[已被证明无效的gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。这个手稿,只关注与PD-L1封锁相关免疫学变化,产生一个可衡量的免疫反应所需要的最小剂量(1毫克/公斤)被当作没有认识gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1剂量产生骨肉瘤的临床益处。gydF4y2Ba

2.7。统计分析gydF4y2Ba

团体之间的统计学意义使用学生的评估gydF4y2BaTgydF4y2Ba以及α= 0.05和Bonferroni调整。每组至少三种动物被使用,这是一个广泛使用的起始数量,并允许潜在的离群值的决心。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。当地和系统性免疫BALB / c小鼠的环境Orthotopically接种荧光素酶(+)或荧光素酶特遣部队(−)WT K7M2细胞在统计上等价的gydF4y2Ba

之前我们实验室开发了一个原位转移性骨肉瘤模型使用BALB / c同源的K7M2肿瘤细胞转染与荧光素酶利用新实时监测疾病的记者。这个模型允许敏感的可视化和评估主要和转移病灶没有安乐死的免疫活性的老鼠。从临床结果的角度来看,这两个荧光素酶(+)特遣部队和荧光素酶(−)WT模型以前显示导致统计等效的主要病变的形成和肺转移率(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。然而,由于荧光素酶是一种外国胞内蛋白在既定的积极推动者,它是在MHC类我分子(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba),有可能引起非典型免疫反应(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。这手稿专门集中于描述抗肿瘤免疫反应,我们认为这是非常重要的,首先检查是否荧光素酶抗原免疫微环境的重大影响。为了实现这个目标,我们评估了本地(肿瘤收获约1.7厘米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba在卷)和系统(脾)免疫微环境通过流式细胞术。脾脏是一个大型的淋巴免疫器官上,可直接进入血源性病原体和抗原,因此一个好的系统性免疫功能的表现。gydF4y2Ba

来确定当地的肿瘤免疫微环境影响荧光素酶抗原的存在,我们调查各种关键骨髓和淋巴系免疫细胞(总共6个人口)和最大的临床相关性WT肿瘤(gydF4y2BangydF4y2Ba= 11)和TF肿瘤(gydF4y2BangydF4y2Ba1 = 15)小鼠使用抗体面板。人口调查包括CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Bactl, CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba错,CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT调节细胞亚群)、CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNKp46gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba自然杀伤(NK)细胞,CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba髓系细胞(多层陶瓷)和CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba粒细胞。样本所示控制模式补充数据gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba。使用Bonferroni调整,个人使用进行了比较gydF4y2BaαgydF4y2Ba= 0.0083,所有种群被认为统计等效(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba两组之间(表gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。此外,PD-L1表达在肿瘤一直猜测发挥重要作用osteosarcoma-mediated免疫抑制(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba表达不同),我们还研究了是否PD-L1组。我们寻找使用CD45 PD-L1在肿瘤细胞的表达gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba门(确定肿瘤内的所有nonleukocyte人口)在抗体面板2;一个示例闸门模式补充图所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。没有统计学差异(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba在百分比PD-L1表情肿瘤生成的TF肿瘤(gydF4y2BangydF4y2Ba= 15)和WT肿瘤(gydF4y2BangydF4y2Ba=(表11)老鼠gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

进一步评估免疫特遣部队和WT模型之间的等价性,我们试图确定系统性免疫微环境影响荧光素酶的存在。之前的数据显示,大约11周后肿瘤细胞接种,90%的老鼠在TF和WT发达肺转移肿瘤组织(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。这时,老鼠安乐死和脾细胞和抗体immunophenotyped面板1确定脾免疫调节响应晚期疾病组之间是一致的。使用Bonferroni调整,个人使用进行了比较gydF4y2BaαgydF4y2Ba= 0.0083,这样的原发性肿瘤,从两组小鼠的脾微环境几乎一致统计等效(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba粒细胞的百分比(WT除外gydF4y2Ba_{格兰gydF4y2Ba}= 15.27±21.82%:gydF4y2BangydF4y2Ba= 10;特遣部队gydF4y2Ba_{格兰gydF4y2Ba}= 52.33±19.02%:gydF4y2BangydF4y2Ba= 9;gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba这些分析的统计数据如表所示gydF4y2Ba4gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

当一个外国记者蛋白质是引入gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba系统,有可能干扰正常的免疫过程;然而,肿瘤免疫学的这方面是经常被忽视的文学,尽管它有可能无效的结论。这个手稿侧重于阐明抗肿瘤反应,我们提供证据支持,引入荧光素酶记者并没有显著改变抗肿瘤免疫反应。白细胞(WBC)数量检查面板1中提供了一个广泛的概述包括NK细胞肿瘤免疫学的重要介质,ctl,解说,亚群和多层陶瓷。总的来说,从13个特遣部队和WT肿瘤模型的对比,只有一个人口(CD45百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba粒细胞在脾脏)认为从统计学上看是不一样的。但是,我们认为这是一个可能的后果的1型误差在95%置信区间和得出结论,组成的表达荧光素酶记者并没有显着影响的当地(肿瘤)或系统(脾)免疫反应。因此,我们继续我们的研究的系统性免疫反应骨肉瘤只使用TF荧光素酶(+)模型,该模型允许生物荧光检测和量化的疾病负担。gydF4y2Ba

3.2。使用脾脏指纹识别基线系统性免疫与疾病进展和转移的荧光素酶(+)K7M2原位BALB / c小鼠模型的骨肉瘤gydF4y2Ba

有一个关键的知识差距对于恶性肿瘤对患者全身免疫状态的影响,尤其是在肿瘤免疫治疗的上下文。许多免疫疗法(包括单克隆抗体检查点阻滞剂)用于临床前和临床设置给出系统通过血液和可以调节T细胞和装甲运兵车像巨噬细胞之间的相互作用gydF4y2Ba35gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba];然而,我们的了解系统性免疫调节基础肿瘤间隙(或阻力)是不完整的。免疫疗法针对这个轴显示巨大的抗癌潜力,因为Mifamurtide,来到最接近常规临床应用在骨肉瘤gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。此外,目前还没有可靠的方法来监测免疫激活的变化随着时间的推移,一旦主要肿瘤移除。因此,我们试图建立一个基线系统性免疫档案的TF肿瘤小鼠模型,可以使用其他调查人员检查肿瘤和/或treatment-induced免疫调节。脾脏被选为系统性免疫状态的一个标志,因为它是一个中央中心循环免疫细胞(包括成熟的巨噬细胞)和血源性抗原的主要过滤(包括循环肿瘤细胞和碎片)。从可行性和临床转化的角度来看,脾与细针活检进行吸入物是一种有效的细胞学监测平台较低的并发症发生率在人类gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。在11周后接种(在这段时间里,90%的肿瘤小鼠暴发性肺转移),我们使用抗体板3和4监测淋巴系细胞的细胞变化(llc)和多层陶瓷,分别发生在疾病进展的脾脏TF肿瘤的老鼠。抗体面板3检查以下四个LLC的子集的白细胞数量:CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Bactl, CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba错,CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba亚群、CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNKp46gydF4y2Ba^+gydF4y2BaNK细胞(例如控制模式在补充图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。我们也调查了CD4的疲惫状态gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba早期的人口使用典型的细胞表面标记PD-1 Tim-3。TCE效应细胞是一种现象,其特征是减少函数首先描述慢性病毒感染与实例的表达水平的增加PD-1和Tim-3gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。事实上,它已经表明,病毒感染,癌症可能会导致类似的免疫破坏淋巴细胞功能(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。额外的T细胞表面分子LLC面板中包括细胞毒性T lymphocyte-associated蛋白4 (CTLA-4)竞争与CD28绑定86 B7分子CD80和装甲运兵车抑制细胞毒性T淋巴细胞功能也可以在免疫反应中发挥作用的癌症(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。PD-1控制模式的一个例子,Tim-3, CTLA-4表情T细胞中可以看到补充图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。抗体的表达谱数据面板3五小鼠脾脏的表的左栏所示gydF4y2Ba5gydF4y2Ba。总之,NK细胞人口百分比平均为10.78±4.5%;ctl的数量百分比、解说和亚群平均2.73±1.22%,6.45±3.08%,分别和21.09±5.12%。CTLA-4表情ctl和tc平均18.35±10.12%和18.23±4.58%,分别。gydF4y2Ba

抗体面板4研究脾immunophenotype的多层陶瓷组件。三个细胞群检查包括CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba多层陶瓷、CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^−gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞和CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba^−gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba粒细胞(例如控制模式在补充图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。另外,以下四个巨噬细胞极化的表达标记转谷氨酰胺酶2 (Tgm2),精氨酸酶1 (__arg1)趋化因子(C-X-C主题)配体9 (Cxcl9)和一氧化氮合酶2 (Nos2)也在补充图评估(例如控制模式gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。Tgm2 / __arg1和Cxcl9 / Nos2是古典平方米,M1-like巨噬细胞标记通常与pro-tumor抗炎或抗肿瘤炎性相关属性,分别。CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba多层陶瓷分为Ly6CgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba单核细胞和Ly6GgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba粒细胞。从那里,以下四个的总百分比表达Ly6C M1 / M2巨噬细胞标记gydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba单核细胞是决定,这些标记物的表达谱数据从五小鼠的脾脏表的左栏所示gydF4y2Ba6gydF4y2Ba。总之,多层陶瓷、单核细胞/巨噬细胞和粒细胞百分比人口平均5.27±1.11%,4.92±1.29%,分别和57.49±9.62%。百分比的表达个人M1 / M2标记Tgm2 __arg1、Cxcl9,和Nos2巨噬细胞为18.58±5.69%,0.3±0.56%,18.28±5.38%,分别和97.99±1.62%。gydF4y2Ba

这里,我们已经开发出两个深入抗体板(板3和4),可用于评估脾细胞免疫指纹。收集的数据可以用来作为基准来评估免疫调节治疗干预的反应。迄今为止,脾淋巴和骨髓免疫指纹骨肉瘤肿瘤的小鼠肺转移的时候从来没有被调查。注意,在这项研究中,巨噬细胞是不公开的M1和M2分类;相反,我们只报告百分比的表达每个标记整个巨噬细胞表达的人口。而不是研究选择单个标记的存在与否来确定M1 / M2极化,我们的模式提供了一个更加客观的态度巨噬细胞表型癌症等复杂的疾病过程影响巨噬细胞承担中间表型和co-express M1和M2标记(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。分析每个标记的巨噬细胞表达人口比例允许全谱的巨噬细胞表型是赞赏,相比之下,使用单标记错误概括和简化复杂的人口。gydF4y2Ba

3.3。骨肉瘤疾病进展和转移诱导系统性免疫调节可视化的脾细胞ImmunophenotypinggydF4y2Ba

证据表明,骨髓和淋巴血统激活状态在当地和系统性免疫环境可能会携带疾病进展关于骨肉瘤临床有用的信息,转移,和生存gydF4y2Ba16gydF4y2Ba,gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。然而,一旦原发肿瘤被删除时,它不再能提供最新的信息不断发展的抗肿瘤免疫反应。外周血被用来确定免疫状态之外的原发肿瘤与其他癌症(有前景的结果gydF4y2Ba47gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba51gydF4y2Ba];然而,故事不完全成熟的巨噬细胞数据通常不能以这种方式获得的。因此,我们试图确定脾脏可用于检测肿瘤导致免疫调节通过比较TF肿瘤小鼠的脾脏那些虚假的(SH)手术过程检查系统性恶性肿瘤引起的脾免疫调节的程度。SH老鼠接受了相同的手术和肿瘤小鼠抗体板3和4;然而,给它们注射车辆相对于肿瘤细胞。使用Bonferroni调整,个人之间的比较是TF肿瘤(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)和SH (gydF4y2BangydF4y2Ba= 4)通过学生的老鼠gydF4y2BaTgydF4y2Ba以及使用gydF4y2BaαgydF4y2Ba= 0.0083,gydF4y2BaαgydF4y2Ba为抗体板3和4 = 0.00714,分别在95%置信区间评估的意义。在两板之间,无数TF带有显著差异和SH老鼠被发现。板3,NK细胞(TFgydF4y2Ba_NKgydF4y2Ba= 10.78±4.5%;上海gydF4y2Ba_NKgydF4y2Ba= 1.85±0.4%;gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)和Treg (TFgydF4y2Ba_{TreggydF4y2Ba}= 21.09±5.12%;上海gydF4y2Ba_{TreggydF4y2Ba}= 7.25±0.23%;gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)百分比显著增加脾脏的TF肿瘤和SH老鼠。同时,T细胞明显升高的疲惫状态的脾脏肿瘤相比,SH老鼠(TFgydF4y2Ba_tcgydF4y2Ba= 18.23±4.58;上海gydF4y2Ba_tcgydF4y2Ba= 0.16±0.054,gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.0001,图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。有趣的是,还有CTLA-4的百分比的增加gydF4y2Ba^+gydF4y2Bactl在小鼠肿瘤倾向于统计学意义(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba重要的是,总人口百分比ctl和手在统计学上等价的(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba面板4的总百分比多层陶瓷在肿瘤的小鼠脾脏SH (TF相比显著升高gydF4y2Ba_{多层陶瓷gydF4y2Ba}= 5.27±1.11%;上海gydF4y2Ba_{多层陶瓷gydF4y2Ba}= 1.39±0.4%,gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。然而,人口百分比单核细胞/巨噬细胞和粒细胞肿瘤的小鼠脾脏和SH是减少和趋势对统计学意义(gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba),可能表明增加百分之一的不成熟的多层陶瓷展示中间表型。引人注目的是,M1标记Cxcl9 Nos2和M2标记Tgm2显著调节肿瘤小鼠的巨噬细胞的数量(gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba),4.2 e-07(图gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba),0.0025(图gydF4y2Ba2 (d)gydF4y2Ba),分别),显示没有明确的过渡的极化。M2标记__arg1没有污点在任何数量的检查。每个小组的统计数据在表中进行了总结gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6gydF4y2Ba分别为板3和4。gydF4y2Ba

的13个细胞群TF肿瘤和SH组之间相比,七是统计学意义。在淋巴方面,我们看到显著的NK细胞和亚群,这个增加脾亚已经观察到多个肿瘤类型在临床前模型中,与肿瘤大小有关,通常是与整体相关的免疫抑制状态(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。肿瘤小鼠的脾髓室是改变的多层陶瓷池和巨噬细胞成熟,它反映的情况增加炎症单核细胞招聘可能作为储层快速部署到外围组织疾病过程中(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。此外,它也可能代表的积累不成熟髓细胞免疫抑制表型,为其他肿瘤模型(建议gydF4y2Ba55gydF4y2Ba]。巨噬细胞激活的状态在肿瘤的老鼠也显著改变。有趣的是,巨噬细胞M1标记的表达Nos2 / Cxcl9和M2标记Tgm2都显著增加,没有明确的M1 / M2的偏见。这些数据支持与中间表型的进化假说,巨噬细胞主要集中在微环境与复杂的肿瘤发生的过程,简单的M1 / M2分类可能导致错误结论导致了粗略的简化。总体而言,这些数据表明,有一个系统失调的淋巴细胞和骨髓的人口由恶性肿瘤,可以使用这些面板我们描述了监控。这个过程的下一步是更清楚地定义特定功能与观察到的表型相关和临床结果他们交往,这可能是用于帮助确定疾病进展程度和通知预测。gydF4y2Ba

3.4。脾脏可以用作晴雨表的系统性免疫反应治疗用单克隆抗体和免疫阻滞剂α-PD-L1检查站gydF4y2Ba

节gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,我们确定我们的抗体面板可以准确地描述malignancy-induced发生免疫调节与疾病进展。因此,如果我们能够评估免疫系统是如何改变以应对实时免疫治疗,我们可以调整治疗方案,以便适当的免疫反应了在正确的时间以正确的方式操作。因此,如果病人的全身免疫系统定期取样,这些重要的肿瘤免疫逃逸机制可能暴露,妥善治疗。因此,我们试图确定是否脾可以作为一个系统性免疫指标来评估immunotherapy-induced微环境变化。为这部分选择的免疫疗法的研究gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1,用于不同的癌症不同成功率(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]。作为gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1封锁活动已经在文献[建立gydF4y2Ba56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)和整体治疗功效并没有期望的结果的研究,没有必要同形像控制。这些研究,肿瘤小鼠特遣部队(gydF4y2BangydF4y2Ba与20 = 3)治疗腹腔内gydF4y2BaμgydF4y2Ba克gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1抗体在PBS每周两次从第一个明显的主要损伤的迹象。原发性肿瘤被约1.7厘米gydF4y2Ba^3gydF4y2Ba,在大约11周后接种小鼠安乐死。收获脾脏受到修改(mod)面板3(缺乏NKp46 NK细胞标识符)和面板4。使用Bonferroni调整,个人之间的比较来评估的意义gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1治疗(gydF4y2BangydF4y2Ba= 3)和未经处理的(gydF4y2BangydF4y2Ba= 5)TF肿瘤通过学生的老鼠了gydF4y2BaTgydF4y2Ba以及使用gydF4y2BaαgydF4y2Ba= 0.01,gydF4y2BaαgydF4y2Ba= 0.00714抗体电池板3 (mod)和4 95%置信区间,分别。人口调查的小组3 (mod),gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1治疗显著降低脾tc (TFgydF4y2Ba_{(−gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 18.23±4.58;特遣部队gydF4y2Ba_{(+gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 0.79±0.71,gydF4y2Ba )gydF4y2Ba如图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba。然而,有趣的是,三分之二的老鼠显示降低tc回应gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1疗法还显示大量增加CTLA-4的百分比gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba表达了对ctl(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba),可能暗示着一个潜在的肿瘤逃逸机制可以抑制t细胞的活动。gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1治疗也大大增加了人口百分比单核细胞/巨噬细胞(图gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba:特遣部队gydF4y2Ba_{(−gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 4.92±1.29%;特遣部队gydF4y2Ba_{(+gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 12.8±2.92%,gydF4y2Ba )gydF4y2Ba和减少巨噬细胞表达Tgm2(图的百分比gydF4y2Ba3 (d)gydF4y2Ba:特遣部队gydF4y2Ba_{(−gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 18.58±5.69%;特遣部队gydF4y2Ba_{(+gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 2.1±2.17%,gydF4y2Ba ),gydF4y2BaCxcl9(图gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba:特遣部队gydF4y2Ba_{(−gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 18.28±5.38%;特遣部队gydF4y2Ba_{(+gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 1.52±1.24%,gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba和Nos2(图gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba:特遣部队gydF4y2Ba_{(−gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 97.99±1.62%;特遣部队gydF4y2Ba_{(+gydF4y2BaαgydF4y2BaPD-L1)gydF4y2Ba}= 50.89±18.07%,gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba基本上正常化M1 / M2巨噬细胞极化分布回到上海的地位。完整的数据总结表中可以找到gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和gydF4y2Ba8gydF4y2Ba分别为面板3 (mod)和4。gydF4y2Ba

免疫疗法,包括PD-1 / PD-L1封锁显示长期临床活动对多种人类恶性肿瘤(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba60gydF4y2Ba)不含骨肉瘤(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba),尽管有证据表明PD-L1有助于骨肉瘤疾病进展(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。因此,gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1被选为我们的典型的免疫治疗的双重目的检测抗体的能力板检测治疗导致脾微环境的改变,可能阐明其治疗背后的免疫机制的缺点。有趣的是,我们发现,虽然gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1处理和参与小鼠最终死于疾病,gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1单方就足以大幅扭转许多参与肿瘤免疫现象观察老鼠。然而,尽管个人M1和M2标记处理和未经处理的组之间确实显示显著变化,M1, M2标记率统计等效(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba数据显示,gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1单方就可以稳定但不引起广义M1-biased巨噬细胞极化与减少转移有关(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba]。不过,这些数据提供了一个可能的解释为什么联合疗法包括gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1疗法更有效(gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba),因为它似乎中和许多恶性肿瘤引起的免疫效果。有趣的是,三分之二的老鼠接受gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1治疗显示大幅增加表达CTLA-4 ctl,可能揭示肿瘤可以环游的代偿机制gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1 monotherapeutic干预支持先前的结果(gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba]。综上所述,这些数据支持使用免疫治疗的“鸡尾酒”这一目标多个途径采取相似的方法对人类免疫缺陷病毒/获得性免疫缺陷综合症(艾滋病)治疗。此外,我们提供了一个合理的解释gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1单一疗法对骨肉瘤在过去的成功。因此,我们建议,脾脏可能作为晴雨表实时监测疾病进展和患者对免疫疗法,值得进一步调查。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

病毒的荧光素酶记者向量引入K7M2骨肉瘤肿瘤细胞没有明显影响局部或全身性免疫反应疾病进展和转移的原位骨肉瘤的小鼠模型,证实其效用准确建模复杂的免疫微环境动力学尽管荧光素酶记者转染。我们的模型可以用来准确地评估疾病负担(通过新)和免疫动力学与信心,记者蛋白质不会导致明显的免疫障碍。此外,结果表明,骨肉瘤疾病进展和转移诱导系统失调的免疫细胞的数量,包括巨噬细胞成熟和M1 / M2标记表达式,tc, NK细胞数量百分比相比,无病SH控制。这些数据表明,osteosarcoma-induced免疫调节是可观察到的在脾脏抗体面板描述和提供新的见解的复杂角色,巨噬细胞在骨肉瘤疾病进展。的确,肿瘤相关巨噬细胞的患病率和表达单一的巨噬细胞M1 / M2极化标记之前与疾病相关的事件,当总的来说似乎矛盾的gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba]。在这项研究中,我们表明,骨肉瘤疾病进展导致明显的失调与M1和M2的表达增加巨噬细胞激活标记,提供进一步证明为什么单一标记M1 / M2巨噬细胞标识符不准确评估极化状态在复杂的恶性设置。我们的研究还表明,低剂量gydF4y2BaαgydF4y2Ba-PD-L1单独治疗规范化osteosarcoma-induced系统性immunodysregulation回到上海的地位没有改变临床结果;然而,增加补偿在免疫抑制标记CTLA-4 ctl PD-L1封锁之后显示一个潜在的肿瘤逃逸机制。这些数据表明,免疫逃避机制(如PD-L1 / CTLA-4 counter-regulation可以发现immunophenotyping系统性免疫器官脾脏,这可能是非常有用的临床疗法适应immunophenotype,发生在一个特定的时间点。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

这个手稿的主要流式细胞仪数据可以通过联系没有限制访问的主要作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

BAL声明Highmark齐默Biomet和研究咨询公司支付Stryker和Globus生活技术的支持,和他是一个发言人机库假肢。其他作者的报告没有利益冲突。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

本文产生的工作支持的西弗吉尼亚大学CTSI想法CTR支持在NIH /美国国家奖U54GM104942数量和西弗吉尼亚大学流式细胞术和单细胞在格兰特P30GM103488号和S10OD016165核心。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

补充图1:控制模式例子淋系细胞,单核细胞/巨噬细胞和粒细胞抗体面板1。细胞被封闭到CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba组织;从那里,CD4gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^−gydF4y2BaCD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba骨髓细胞谱系细胞Ly6C封闭gydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞和Ly6GgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba粒细胞。补充图2:控制模式例子辅助T细胞,细胞毒性T细胞,T调节细胞抗体面板1。细胞被封闭到CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba组织;从那里,被封闭的CD4细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD8 T辅助细胞gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞毒性T细胞。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞进一步使用Foxp3封闭gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba作为一个定义T调节细胞的标志。补充图3:例子控制模式的自然杀伤细胞抗体面板1。细胞被封闭到CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba组织;从那里,CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞被封闭到NKp46gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba自然杀伤细胞。补充图4:控制模式例子PD-L1积极非白人血液细胞瘤细胞从抗体面板2。肿瘤细胞被封闭进CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba组织;从那里,CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba非白人血液细胞瘤细胞评估程序death-ligand 1 (PD-L1)积极性。注意,尽管这个数字显示染色CD95积极性,这个标志是不包含在分析PD-L1表达式的手稿。补充图5:例子控制模式对细胞毒性T细胞,辅助T细胞、自然杀伤细胞,T调节细胞从抗体面板3。细胞被封闭到CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和CD45gydF4y2Ba^−gydF4y2Ba组织;从那里,CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞被封闭到NKp46gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba自然杀伤细胞,CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD8gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba细胞毒性T细胞和CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba辅助T细胞。CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞是进一步的具体定义CD45的积极性gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD4gydF4y2Ba^+gydF4y2BaFoxp3gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT调节细胞。补充图6:例子控制模式从抗体面板3 t细胞疲劳和功能状态。CD4gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba辅助T细胞和CD8 + T细胞的细胞毒性T细胞被评估为表达疲惫标记程序性细胞死亡蛋白1 (PD-1)和T细胞免疫球蛋白和mucin-domain包含3 (Tim-3)。CD8gydF4y2Ba^+gydF4y2BaT细胞也分别评估的表达抑制分子细胞毒性T lymphocyte-associated蛋白4 (CTLA-4)。补充图7:门控模式例子淋系细胞,单核细胞/巨噬细胞和粒细胞抗体面板4。细胞被封闭到CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba髓系细胞;从CD45gydF4y2Ba^+gydF4y2BaCD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba象限,细胞进一步封闭成Ly6CgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6GgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞和Ly6GgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba^−gydF4y2Ba粒细胞。补充图8:浇注方案例子标记抗体的巨噬细胞M1 / M2偏振面板4。CD11 bgydF4y2Ba^+gydF4y2BaLy6CgydF4y2Ba^+gydF4y2Ba单核细胞/巨噬细胞评估M1活化标志物的表达趋化因子(C-X-C主题)配体9 (Cxcl9)和一氧化氮合酶2 (Nos2)和M2激活标记转谷氨酰胺酶2 (Tgm2)和精氨酸酶1 (__arg1)。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba