文摘

卡波济氏肉瘤(KS)在感染艾滋病毒的人可以有一个广泛的临床结果,从懒惰的皮肤肿瘤危及生命的内脏癌症。KS肿瘤包含endothelial-related细胞和炎症细胞,可能感染艾滋病毒。在这项研究中我们测试如果艾滋病毒亲缘进化模式区分KS肿瘤和进展。多点尸检之前与KS参与者死于艾滋病抗逆转录病毒疗法的可用性被确定艾滋病和癌症标本资源(钢芯铝线)。两个病人(KS1和KS2)主要死于non-KS-associated疾病和KS3死于咄咄逼人,一个月内转移KS的诊断。皮肤和内脏肿瘤和nontumor解剖组织获得()。单一基因组测序被用来扩大艾滋病毒RNA和DNA,这是存在于所有肿瘤。独立的艾滋病毒发展史分化KS1肿瘤演化支,KS2 KS3,序列的相互关联的发展史和选择。艾滋病毒划分在KS1证实,KS2肿瘤;然而,在KS3,没有划分样本组织中可见。当样本容量很小,艾滋病毒的进化模式中观察到所有的病人显示肿瘤细胞之间的相互作用和艾滋病毒感染细胞提供一个选择性的优势,可以促进KS进展。

1。介绍

人类免疫缺陷病毒(HIV)流行前,卡波济氏肉瘤(KS)被认为是一种非常罕见的疾病,主要在地中海国家和器官移植受者(1]。尽管人类疱疹病毒8 (HHV8)是KS的病因引起2最HHV8),⁺个人不开发KS。在艾滋病流行初期,KS经常诊断,它被认为是一种由艾滋病诱发的疾病3- - - - - -5]。1990年代中期前和使用抗逆转录病毒疗法(cART)相结合,艾滋病毒⁺患者一生中40%的风险KS [6]。尽管联合抗逆转录病毒疗法(cART)不可否认KS-associated减少艾滋病病毒感染者的死亡率(7- - - - - -9),统计的影响尚不清楚,由于不同的临床定义和购物车的依从性问题(10,11]。此外,KS仍然是最常见的癌症之一⁺患者(12)尽管cART-improved CD4⁺t细胞计数、低病毒载量,降低机会性感染的风险(13- - - - - -16]。KS尤其在资源贫乏的环境中存在问题,在购物车和化疗是有限的(6,17- - - - - -19];然而,即使在资源丰富的环境中,使用购物车和化疗完全缓解KS发生在不到50%的艾滋病毒⁺传播疾病患者(20.]。

KS病变可以孤独的、局部的或传播,但是一个人的肿瘤之间的关系在很大程度上是未知的。虽然许多KS病变皮肤,懒洋洋的,肿瘤可以发生在口腔,淋巴结,和内脏,这可能导致致命的并发症,由于干扰正常的身体机能。病变的生长非常缓慢或快速爆炸。KS定义程控是梭形细胞(SC) [21,22]表示标记的内皮细胞和巨噬细胞谱系(23]。KS肿瘤是多克隆的,阳性的存在HHV8病毒感染与肿瘤有关的b细胞和SCs23),和高度血管化,给他们一个紫色的区别。炎性淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞填充和丰富KS肿瘤肿瘤生长环境通过各种细胞因子的生产(23]。这些免疫细胞都为HIV潜在目标;然而,据我们所知,只有一项研究评估KS肿瘤对艾滋病毒的存在使用早期杂交技术(24]。SCs的患者可以从PBMCs培养KS,表明循环SCs可能导致多个KS的外观损伤(23]。

有可能感染艾滋病毒和发展在许多解剖组织,包括肿瘤(25- - - - - -27]。以前,我们表明,在淋巴瘤肿瘤有别于艾滋病病毒种群健康组织(25]。在这里,我们的目标是描述HIV人群KS肿瘤是否艾滋病毒亲缘进化可以用来追踪肿瘤和发展本地KS简单的购物车的使用。我们获得肿瘤和nontumor组织采样事后剖析从艾滋病和癌症标本资源(钢芯铝线)从三个艾滋病毒⁺/ KS⁺病人死于艾滋病激进,我们生成的艾滋病毒env-nef使用单一基因组测序序列(SGS)描述病毒进化模式。

2。材料和方法

2.1。病人和生物材料

这三个男性患者纳入本研究被诊断为艾滋病病毒感染和先进死于艾滋病没有收到车(表1)。100毫克的冷冻尸体解剖肿瘤和nontumor组织通过钢芯铝线(http://acsr.ucsf.edu/)。组织被归类为肿瘤或nontumor组织学检查。钢芯铝线是国家癌症机构资助的组织库程序,从患者获得组织在适当的同意和发布组织调查人员批准后提出研究和deidentification样本和临床历史。钢芯铝线是被Biorepositories办公室和美国国立卫生研究院Biospecimen研究HIPAA兼容和按照道德标准的《赫尔辛基宣言》。此外,所有材料下获得加州大学旧金山委员会批准对人类的研究。

2.2。RNA / DNA提取

总RNA基因组DNA分离分别从每个组织切片(30 - 50 ng)使用AllPrep DNA / RNA迷你包(试剂盒# 80204)。组织均质提取之前在缓冲RLT +(裂解缓冲)使用TissueRupter静均质器(# 9001271)试剂盒新鲜无菌一次性探针为每个样本(试剂盒# 990890)。制造商的指导方针之后,除了两个50μL最后洗脱RNase-free用水在RNA隔离。100年μL最终产生的RNA量集中使用RNeasyMinElute清理工具(试剂盒# 74204)。RNA和DNA拔牙、互补脱氧核糖核酸的合成,进行了第一轮PCR设置要求限制访问权限,amplicon-free房间单独的空气处理和实验室设备,没有放大PCR产品或重组克隆质粒被允许,和工作表面和设备被彻底清洗之前和之后使用Eliminase®(鲜美实验室,Inc .)。互补脱氧核糖核酸合成使用上标®三世第一链合成系统(生命表达载体技术# 18080 - 051)使用提供的低聚糖(dT)_20.底漆根据制造商的建议。RNA是孵化在65°C 5分钟deoxynucleoside三磷酸腺苷(0.5毫米)和5μM益生元(dT)_20.然后迅速冷却4°C。合成第一链cDNA 40了μL包含1 x逆转录反应体积缓冲(10毫米Tris-HCl (pH值8.4),25 mMKCl), 5毫米MgCl₂二硫苏糖醇,10毫米,2 U /μL (RNase-OUT™(核糖核酸酶抑制剂)和10 U /μL上标三世rt,反应是加热到50°C 50分钟,其次是85°C 5分钟。反应是冷却到37°C和0.1 U /μL (大肠杆菌核糖核酸酶H添加,紧随其后的是20分钟的孵化。互补脱氧核糖核酸是储存在−20°C。

2.3。测序协议

修改单基因组测序协议被用来扩大艾滋病毒有关env和nef序列(28]。互补脱氧核糖核酸和基因组DNA平均连续稀释到30%或更少的嵌套PCR反应是积极的。在第一轮PCR,稀释cDNA或基因组DNA在25放大μL反应包含1 x®铂蓝PCR SuperMix(生命表达载体技术)和0.2μM的底漆:EF2 5′-ACAGTCTATTATGGGGTRCC-3′NR1, 5′-AGCTCCCAGGCTCAGATCT-3′(6333 - 6352个基点和9558 - 9576个基点的艾滋病毒HXB2 resp)。用以下循环参数:初始变性95°C 5分钟,其次是35周期的变性在94°C 1分钟,退火在58°C 1分钟,在72°C和扩展了4分钟,最后一个扩展的时间10分钟72°C。第二轮PCR gp120由1μL的第一轮PCR添加到24μL第二轮反应1 x铂组成的蓝色PCR SuperMix(生命表达载体技术)和0.2μM的底漆:EF3、5′CATAATGTTTGGGCCACACA-3′和ER2 5′-CACCACTCTTCTYTTTGCC-3′(6420 - 6439个基点和7724 - 7742个基点的艾滋病毒HXB2 resp)。用以下循环参数:初始变性95°C 5分钟,其次是35周期在94°C的变性1分钟,退火在58°C 1分钟,在72°C和扩展2分钟,最后一个扩展的时间10分钟72°C。这第二轮PCR生成1.3 Kb的产品,几乎涵盖了整个envgp120基因。第二轮envgp120 PCR产品可视化在1%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色,和反应包含一个1.3 Kb产品被认为是积极的和选择排序。随后,第一轮反应与积极的第二轮pcr gp120被用来放大nef基因序列。第二轮nefPCR是1μL的第一轮PCR添加到24μL第二轮反应1 x铂组成的蓝色PCR SuperMix(生命表达载体技术)和0.2μM的底漆:NF1 5′-TTAGGCAGGGATAYTCACC-3′、NR2 5′-ATCTGAGGGCTCGCCACT-3′(8347 - 8365个基点和9488 - 9505的艾滋病毒HXB2 resp)。用以下循环参数:初始变性95°C 5分钟,其次是35周期在94°C的变性1分钟,退火在58°C 1分钟,在72°C和扩展2分钟,最终扩展72°C 10分钟。第二轮nefpcr可视化在1%琼脂糖凝胶与溴化乙锭染色,包含产品单1.1 Kb和反应被认为是积极的和选择排序。引物的设计使用Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/),通过观察的区域保护发表HIV亚型B的比对序列从洛斯阿拉莫斯艾滋病毒序列数据库(下载http://www.hiv.lanl.gov/)。DNA测序进行应用生物系统公司3730 xl分析仪(生命技术)佛罗里达大学的跨学科的生物技术研究中心(UF ICBR)。所有序列都组装和符合Geneious R7软件包(Biomattershttp://www.geneious.com/),后跟一个手动优化区域包含插入和删除。序列数据已经提交给基因库(加入数字KU709129-KU709831)。

2.4。序列分析

Env和nef比对生成使用ClustalW [29日]在MEGA5 [30.手工制作)进一步优化。由于大量的插入和删除,通常有问题的一致,区域与大量的插入和删除envV1、V2和V4域被移除。一个初始最大似然发展史是推断使用来自所有病人的基因序列,以确保没有交叉污染。两两之间的距离内分析和组织RNA和DNA序列数量随着时间的推移在MEGA5评估(30.)使用Tamura-Nei分子模型与标准错误(使用模型选择确定)估计,到1000年启动复制。克鲁斯卡尔-沃利斯测试是用来确定意义意味着两两之间的距离在不同的解剖组织。个人最大似然的发展史推断为每个病人在GTR模式的核苷酸进化和伽马分布率变化在网站(+ G)使用PhyML [31日]。统计支持评估200引导程序复制。Slatkin-Maddison测试(32)是用来确定序列来自不同组织之间的区分,并使用1000复制的提示意义评估随机化,实现HYPHY v.1.0 [33]。快,无约束贝叶斯近似推断选择(信息面板)模型,实现数据的猴子(http://datamonkey.org/),是用来识别氨基酸网站在选择序列每个人来自不同的组织。网站的后验概率> 0.9(多元化)增加或减少(净化)产生相对于同义替换率被认为是经历一个重要的选择压力水平。选择网站编号根据HIV分子克隆HXB2(基因库加入# AF358141)。

3所示。结果

3.1。临床特点的病人队列

所有的病人(KS1-KS3) < 50 CD4细胞/毫米³在死亡和被诊断为KS死前的几个月(表1)。KS1和艾滋病毒感染住了七年。他是由于住院鸟型分支杆菌复杂的,肺孢子菌肺炎,和消耗综合征死亡前11个月。五个月之前死亡,医疗记录显示多个类似艾滋病的症状;然而,KS没有指定。尸检,许多感染被确定在他的整个身体,包括传播KS,没有之前报道或其来源是接近死亡。KS2 KS1的临床历史相似,有多个感染;然而,这个病人有一个最初的KS诊断前五个月死亡。同时,这个病人被诊断为基于积极的体腔的淋巴瘤(BCBL)死前的四个月,是接受化疗。BCBL可能与主积液淋巴瘤通常由HHV8,卡波济肉瘤疱疹病毒。KS3有九年历史的艾滋病毒感染常有上呼吸道感染。他被诊断出患有KS之前一个月死亡。 His KS lesions became rapidly disseminated on the skin and internally, which lead directly to his death due to respiratory distress.

3.2。艾滋病毒RNA和DNA测序成功从所有KS肿瘤

从RNA病毒序列得到13/14从DNA组织和12/14组织(表1)。初步最大似然(ML)所有序列的系统发育树证实了不同人口艾滋病毒序列为每一个病人,表明没有实验室交叉污染。

3.3。KS肿瘤可以包含不同的艾滋病毒隔离

毫升的发展史是推断出来的env和nef序列的数量为所有三个病人。在KS1env发展史,四个不同的和得到广泛支持的演化支(模拟)明显包含大多数tumor-derived序列(图1)。相对较长的内部分支导致每个进化枝表示从其余的病毒数量相当大的分歧。大多数淋巴结肿瘤序列(19/34)在两个截然不同的演化支(A, D)。大部分的皮肤肿瘤(20/32)也位于两个不同序列不同的演化支(c)。其中一个(B)包含两个DNA和RNA序列,而另一个(C)是由专门的RNA序列皮肤肿瘤。大部分分支直接导致皮肤tumor-derived序列非常短,而导致淋巴结tumor-derived序列很长时间,显示更多的分支进化枝中。其余淋巴结和皮肤肿瘤RNA和DNA序列位于高度混合演化支(E-F)。的nef发展史KS1有类似的分支结构,更加明显的多样性在一个淋巴结肿瘤分化枝(C)。同样的,所有皮肤tumor-derived序列除了一个聚集在一起在一个独特的和得到广泛支持的进化枝KS2env和nef(一)(图2)。小肠tumor-derived RNA序列被穿插nontumor spleen-derived在两个基因序列;然而,一些bowel-derived序列得到()。分行的nontumor进化枝显示相当大的结构在这两个基因,与人口不断多元化病毒一致。在nef发展史,两个截然不同的演化支混合进化枝中很明显,这是不存在的env树。相比之下,对于KS3,所有肿瘤和nontumor-derived序列大都是点缀env和nef的发展史(图3)。三个支持演化支出现在两个基因(a - c)。有趣的是,这个病人被诊断为先进的和侵略性的肿瘤发生前不到一个月死亡。

3.4。KS-Associated病毒在肿瘤区分KS1 KS3 KS2但不是

当两两距离计算序列来自每个肿瘤和nontumor组织,只有一个观察显著差异()(KS1淋巴结肿瘤nef与nontumornef序列)。病毒数量明显区分两个肿瘤和正常组织的在每个env和nef在KS1和KS2 ()。另一方面,基因流中发现三个站点的两个基因在KS3 (env:;nef:)。病毒的数量由结合肿瘤位置又与nontumor种群相比显著区分env和nef在KS1 KS2以及nefKS3 ()。

3.5。积极的和消极的选择密码子和组织在KS1和较少KS2 KS3相比(表2和3)

在选择密码子的比例env没有显著变化之间的积极的和消极的选择网站整体或在任何单一主题。然而,要么选择压力下的数量明显高于在KS3 KS1和KS2 ()。在nef,数量明显高于的消极选择密码子在积极选择密码子观察所有患者()。密码子在选择修复KS1和KS2,只有一个在KS2两个组织之间共享。相比之下,在KS3env序列的数量,所有共享的积极的和消极的选择密码子在肿瘤组织内还发现了nontumor序列;同样,在KS3nef序列的数量,所有的共享选择密码子从肿瘤中确定nontumor组织除了31 - 67密码子位置。

4所示。讨论

在这项研究中,我们调查了艾滋病毒的进化模式是否可以区分转移KS患者未经治疗的车。我们分析了艾滋病毒env和nef序列从肿瘤和nontumor解剖网站与KS三人死亡。医疗记录表明,受试者KS1和KS2比主题KS3 KS进展缓慢;然而,所有患者内脏KS,表明一个晚期癌症死于艾滋病。艾滋病毒的RNA或DNA是放大从所有肿瘤在这项研究中,证明,类似于之前的研究25)、癌症组织含有大量的艾滋病病毒。此外,艾滋病毒序列的数量由大多数组织有相似的遗传距离,表明任何限制艾滋病毒进化的组织环境。

艾滋病毒从肿瘤站点KS1和KS2区划相对于nontumor病毒,有限的基因流之间的隔间;然而,在肿瘤病毒的亚种群也存在。此外,密码子选择分析表明,蛋白质含量,KS1和KS2种群进化序列在不同的肿瘤/ nontumor独立选择压力下网站。相比之下,病人死于高度侵略性的KS (KS3)非常不同的模式。病毒在肿瘤和nontumor组织完全穿插non-tissue-specific病毒种群结构。这些发现可能造成大量的场景,包括以下几点:(1)亚种群的病毒在肿瘤可以从最近的病毒迁移从另一个结果,未取样的解剖位置;(2)肿瘤病毒人口发展独立由于物理障碍限制基因流动;(3)肿瘤的病毒种群进化为了应对当地选择性压力;(4)病毒序列在一个或多个网站可以代表档案病毒被激活,因为癌症的增长。第一个场景是不可测试; however, we are conducting additional studies with more tumor and nontumor tissues from other KS patients, including KS derived from patients on cART with no detectable plasma viral load. While the second scenario is possible, unlike the brain in which viral flow is impeded by the blood-brain barrier, KS tumors are highly vascularized which would in theory provide ample opportunity for migration. Furthermore, a small number of tumor viruses were found in nontumor tissues, also suggesting a lack of physical barrier. In considering the third and fourth scenario, we did find that codon positions were under varied selective pressures in the tumors from KS1 and KS2 when compared to nontumor tissues (as expected from the phylogeny). For KS3, most, but not all, selected codons were shared among tissues; however, this patient had widely metastatic KS at the time of death. Therefore, it is possible that tumor-compartmentalized HIV populations could have existed in this patient prior to the rapid outgrowth and spread of the cancer, perhaps represented by one of the distinct subpopulations.

复活和克隆扩增病毒种群可能符合大相同或几乎相同的肿瘤相关病毒的演化支KS1 KS2的发展史和衍生DNA和RNA序列的分离成不同的演化支KS1肿瘤内。这个假设可能会进一步调查通过识别受感染的细胞类型在每个肿瘤。此外,识别宿主基因组中插入网站在这些肿瘤可以帮助理解如果艾滋病毒感染肿瘤细胞在肿瘤物理迁移到其他网站。艾滋病毒整合位点最近的一项研究显示,一个艾滋病毒的持久性机制内t细胞克隆扩张[有关34]。有趣的是,作者还发现插入网站丰富了基因在细胞生长34),这表明插入网站本身可能促进肿瘤发生。在癌症和艾滋病痴呆研究组织巨噬细胞在我们实验室进行显示,主要HIV整合网站tissue-associated巨噬细胞(tam)与细胞激活包括上游的氟癌基因,这可能导致克隆扩张(35- - - - - -38]。这个顺序是一致的发病机理模型中插入病毒促进持久的细胞激活,克隆扩张,和迁移的艾滋病毒⁺从肿瘤nontumor网站36]。

这里的病人研究都cART-naive;然而,KS仍然是一个重大疾病甚至对患者进行购物车。对一些病人来说,迅速发展的KS甚至发生在车下检测不到病毒载量(39]。这些案件通常分为相关免疫重建炎性综合症(IRIS) [19,39,40),一个研究现象的死灰复燃的潜在病理在车(41- - - - - -46]。IRIS-related恶化合并感染通常发生在治疗的前6个月,与局部组织炎症和低CD4计数,和通常在资源有限的设置41,47]。尽管t细胞修复和激活已被认为是导致这些患者,KS进展已经证明(没有直接联系47]。先天免疫功能障碍(如macrophage-activation)也被提供在购物车作为进步的KS的解释,即恢复t细胞数量与现有激活巨噬细胞之间的相互作用会导致增加虹膜(19]。

5。结论

卡波济氏肉瘤(KS)仍然是一个主要的癌症发生在HIV阳性患者尽管immune-restorative联合抗逆转录病毒疗法(cART)。在这项研究中我们从肿瘤和nontumor组织分离出艾滋病毒网站从病人死于KS已经转移的脏器(KS1-KS3)。KS1和KS2死于其他AIDS-associated并发症,而KS3直接死于一个高度积极的KS,转移到肺部,造成死亡1月内初始KS诊断。我们比较了艾滋病毒序列中病人的组织网站和发现KS1和KS2独特的艾滋病毒在肿瘤nontumor网站相比,而艾滋病病毒在KS3自由迁移所有组织中。虽然这项研究是基于一个非常小的样本大小,结果表明,艾滋病毒相关机制可能促进积极的KS的转移过程。同样重要的是要注意,目前尚不清楚如何其他AIDS-associated癌症可能影响的研究(例如,淋巴瘤KS1和BCBL KS2)。持续的研究之间的进化模式内和KS肿瘤可以帮助理解转移机制以及描述一个额外的艾滋病毒水库在购物车。进化研究艾滋病毒在肿瘤组织中非常缺乏,和进一步的调查可以提供额外的透明度机制的艾滋病毒相关癌症。

信息披露

投资者没有参与研究设计、数据收集和解释,或决定提交出版。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

苏珊娜·拉默斯先生和丽贝卡的贡献同样上升到这个工作。

确认

这项工作是由美国国立卫生研究院的资助下NIMH R01-MH100984和NCI钢芯铝线UM1-CA181255-03迈克尔·s·麦格拉思和赠款P50-GM103297 R01-NS063897马可生活。提供额外的支持是Navidea生物制药公司。