文摘
胚胎性横纹肌肉瘤(erm)是最常见的软组织肉瘤在儿童和青少年。Parameningeal erm是一个变种,往往比erm更难治疗发生在其他网站。一个14岁的女性性欲与持续性头痛和快速减肥被诊断出患有parameningeal erm。她进步,尽管与长春新碱化疗去世,放线菌素d,环磷酰胺+ 50.4 Gy放射治疗的原发肿瘤。肿瘤标本被迅速收购解剖和肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠创建patient-derived异种移植(PDX)动物模型。作为解剖标本有碱性R1181C突变,PDX肿瘤轴承动物治疗pan-kinase抑制剂lestaurtinib但证明没有减少肿瘤的生长,表明单药激酶抑制剂治疗在类似的情况下可能是不够的。这种独特的parameningeal erm PDX模型是公开的临床前研究。
1。介绍
横纹肌肉瘤(RMS)间质肿瘤显示骨骼肌分化和代表最常见的小儿软组织肉瘤1]。RMS分为肺泡(武器)和胚(erm)类型,每个类别显示明显的组织学外观、行为和对治疗的反应。约60%的RMS胚的类型(2]。erm礼物通常在泌尿生殖器的头部和颈部区域。武器相比,胚胎性横纹肌肉瘤的发病的平均年龄是年轻10岁之前大多数情况下诊断,预后是整体更有利的(3]。虽然大多数的武器显示平衡易位的融合PAX3: FOX01或PAX7: FOX01最近的出版物显示驱动突变(例如,国家管制当局方面,喀斯特,hra FGFR4, PIK3CA CTNNB1, FBXW7,和BCOR胚子类型)可能支撑发展的RMS (erm) [4,5]。这些研究表明,易位负面的武器可能更类似于erm比组织学外观可能建议(6,7]。erm当前定义总体显示预后比武器5年存活率为80%和52% (8]。
除了组织学类型、发病的年龄和大小的肿瘤,肿瘤的分期和预后非常重要的RMS (9]。Parameningeal横纹肌肉瘤(PM-RMS)占头颈部RMS的一半情况下,包括肿瘤位于鼻旁窦、鼻腔、中耳,颞颥骨下的和pterygopalatine窝(8]。大多数PM-RMS胚类型的,而那些有肺泡功能显示预后差10]。患者parameningeal erm四年无故障存活率为68%在最近的儿童肿瘤协会研究相比,74%为类似erm原发性肿瘤在其他网站11]。PM-RMS预后较差的主要是由于无法理解网站的和难以实现负外科利润(12]。局部复发是最常见的复发,和不良的预后功能包括颅内扩散和脑膜的参与10]。
在转基因小鼠,extra-axial erm和手臂的头部和颈部已生成的表达Pax3: Foxo1融合基因和突变的合作13- - - - - -15]。成人多形性横纹肌肉瘤也被证明开发自然老化/ J小鼠(16]或致癌喀斯特的表达式(6,7]。刺猬的组成性激活途径在小鼠的脂肪细胞谱系与头颈部肿瘤的形成类似erm [17]。然而,临床前模型parameningeal erm肿瘤仍然缺乏。异种移植模型的癌症可以反映人类肿瘤的异质性,并创建一个间质和血管环境不出现在细胞系。保存这些关系可以更准确地模拟人类肿瘤的行为,特别是他们对治疗的反应。在免疫功能不全的试验动物和皮下植入不准确模拟人体环境,这是最近的近似用于研究。
的稀有PM-RMS和临床访问网站收集的活检组织异种移植困难。在这里,我们提供了一个宝贵的PDX模型,首次parameningeal erm临床前模型,为探索parameningeal RMS的生物学和临床治疗途径,创建的组织获得了尸检。
2。案例展示
一位14岁的女孩面对历史的几周的持续的头痛,沙哑的声音,和20磅体重与舌头偏差在考试。脑部核磁共振成像扫描显示1×2厘米提高右侧颅骨建立大规模入侵的舌下神经运河(图1(一))。质量的活检显示低分化肿瘤与轮损坏细胞黏液样背景(图1 (b))。一个广泛的免疫组织化学小组包括积极的肌间线蛋白和myogenin污渍符合横纹肌肉瘤和细胞遗传学测试为阴性(2;13)和(1;13)易位,这将更加符合肺泡横纹肌肉瘤。任何未分化的特性被发现,肿瘤诊断为胚胎性横纹肌肉瘤。肿瘤并不适合完整的手术切除,因此病人被诊断为国税局第二阶段,第三组erm。病人接受标准与长春新碱化疗,放线菌素d和环磷酰胺。局部放疗(RT)立即开始治疗症状和50.4 Gy RT当地肿瘤产生缓慢改善声带麻痹和分辨率舌头的偏差。
(一)
(b)
(c)
(d)
大约6个月后开始化疗和完成后4个月RT,病人出现下肢乏力,步态障碍,大小便失禁,头痛。成像显示新的扩散leptomeningeal转移涉及到整个大脑和脊柱。ventriculoperitoneal分流器被放置,下肢无力,尿失禁的症状,病人紧急地收到30 Gy姑息RT降低胸椎。完成RT后不久,她呼吸困难,癫痫,精神状态改变。正在进行的呼吸衰竭和神经功能恶化,家庭和医疗团队决定转变病人舒适护理。病人拔管后不久去世,允许执行一个完整的解剖是由家庭。这项研究是进行适当的机构审查委员会批准。
死后验尸了约28小时。检查发现许多肉质质量从1到6厘米涉及大脑(左额叶和枕叶皮质区和潜在的白质,扣带回双边,胼胝体膝,左基底神经节,下丘脑和左丘脑,海马,和视交叉),小脑、脑干和软脑膜。从几个脑转移瘤是收获无菌网站立即放置在RPMI解决方案和部分固定在10%的福尔马林从同一解剖组织学网站。组织学显示低分化肿瘤与圆形细长管道残存细胞黏液样背景,高度类似以前的活组织检查(图1 (c))。
3所示。材料和方法
3.1。PDX模型创建
NSG (NOD.Cg -Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/ SzJ)小鼠获得杰克逊实验室。这些高度免疫缺陷小鼠没有成熟的T、B淋巴细胞或功能自然杀伤细胞和也有细胞因子信号下降,呈现他们优秀的学科对人类组织移植。所有的研究都是杰克逊实验室的批准机构动物保健和使用委员会。肿瘤块直接取自病人(50 - 125毫米3)植入皮下的右后侧收件人使用套管针女NSG老鼠。肿瘤可以长到约1000毫米3当肿瘤被收集和分析到大约50毫米3碎片。碎片在NSG老鼠连续通过创建群小鼠药物检测的目的。保持模型和减少遗传漂变,片段P0 DMSO和P1段落被冻结在10%。这些片段是用于生成低通道数群小鼠肿瘤轴承作为研究的需要。PDX功效研究不超出通道6。
3.2。基因组学
基因表达分析执行与人类外显子1.0阵列(Affymetrix,圣克拉拉,CA)。只有初始段肿瘤(P0)基因表达的特征,因为病人样本无法足够迅速地收集,确保数据质量。PDX基因表达微阵列处理在R统计编程环境(18]。首先,数组是加载和分为探针集BrainArray版本17 CDF (19)和运用人类基因注释(注释版70使用人工组装GRCh37)。个人调查强度分位数规范化,对数转换,但没有进行背景校正。总结表达强度与probe-level模型生成实现的AffyPLM R包(20.),拟合对数强度的一个简单的模型为每个探测器作为样本效应的总和,探测效果,残余项,代表总结整个强度的样品效果记录/基因。鼠标对数组进行评估污染影响杂交的NSG小鼠皮肤样品一式三份阵列hugene - 1.0阵列。
拷贝数变异对病人肿瘤和6.0 P0 PDX肿瘤与人类全基因组分析SNP数组(Affymetrix)。的全基因组allele-specific拷贝数资料、分数异常细胞,和肿瘤倍性估计使用ASCAT 2.2 (21,22]。ASCAT的输入数据是使用PennCNV-Affy包(移动电话产生的文件23)中提取日志R比率(远程雷达)和b (BAF)和执行GC频率校正。合奏基因(70年人类基因组注释版)被注释的分段拷贝数主要(CNVa)和次要(CNVb)等位基因。总拷贝数计算通过添加的值主要和次要的等位基因。一段被定义为杂合性丢失(LOH)如果大等位基因频率大于0.5度和等位基因是小于0.1。
癌症TruSeq扩增子面板。使用Illumina公司协议,突变热点从四十八(48)癌症相关基因扩增和测序Illumina公司MiSeq音序器。TruSeq数据分析使用生物信息学分析管道在杰克逊实验室开发的。简而言之,测序平台产生的读取最初评估老鼠污染使用Xenome v1.0.0 [24]。人类是否进一步受到质量控制使用特定的读取NGSQCtoolkit v2.3(25),读取与基础质量大于30 70%以上的基地被用于下游分析。高质量的读取映射到人类基因组(Hg19)使用BWA(26]。结果校准由坐标排序,进一步转化为二进制对齐格式,皮卡德工具(http://picard.sourceforge.net/)。随后,IndelRealigner和BaseRecalibrator模块在基因组分析工具(GATK)被用来预处理对齐27,28]。重新和调整BAM文件作为输入GATK-UnifiedGenotyper和变体电话被限制到目标区域(安捷伦sureSelect v4),软过滤与阅读深度小于140。最后,Pindel(29日)是用于识别微小缺失和所有变异等位基因频率大于5%的人报告。
3.3。荧光原位杂交(鱼)
鱼与formalin-fixed进行石蜡包埋(FFPE)组织部分(4μM,从组织块pcb - 00082 - pt)使用标准操作规程(SOP)在杰克逊CLIA-certified临床细胞遗传学实验室建立基因组医学实验室。FFPE幻灯片是烤60°C在室温下过夜,然后用二甲苯deparaffinized三次,每次15分钟。幻灯片和100%乙醇脱水在室温下2分钟,风干大约15分钟。幻灯片是处理组织预处理和消化包根据制造商提供的说明(CytoCell)。消化后,幻灯片脱水有70%,90%,和100%乙醇,分别在室温下2分钟,其次是空气干燥。变性和杂交,幻灯片是脸朝下放置到一个干净的)幻灯片和清白的组织切片石蜡幻灯片上是与相应的肿瘤组织区域)。用钻石笔,目标肿瘤区域标记处理在幻灯片上的鱼。10μL (PAX3 Breakapart探针应用(012年Cytocell,有限合伙人)和PAX7 Breakapart探针(Cytocell,有限合伙人013)到两个独立的领域,分别和地区布满了22×22毫米2玻璃盖片。整个区域被密封橡胶水泥和探针和幻灯片codenatured Hybrite在94°C的3分钟。幻灯片是放置在一个湿润室和孵化37°C孵化器48小时。posthybridization洗,幻灯片沉浸在0.5 x SSC在72°C 5分钟。他们洗了3次1 xpbs渐变为0.025% 20在室温下,每次2分钟。10μL (DAPI标记区域和它覆盖着22×22毫米2玻璃盖片。玻璃盖片的边缘密封了指甲油,防止幻灯片干燥。在这项研究中,我们也表现相间鱼正常的人类控制细胞系(GM12878)作为控制测试。鱼幻灯片使用徕卡GSL120图像扫描仪系统进行了分析。
3.4。在肿瘤疗效评价轴承老鼠
因为病人的肿瘤样本存在一个筛选突变,有力,fda批准的激酶抑制剂lestaurtinib被选为临床前研究。NSG小鼠PDX肿瘤段# 2和平均规模为250 ~ 300毫米3被随机分配到车辆控制和lestaurtinib (LC实验室、沃本、MA)治疗组。Lestaurtinib准备在40%聚乙二醇100(光谱新布伦瑞克,新泽西州),10%聚维酮(ISP), 2%苯甲醇(,)如前所述30.]。总共有9个剂量给予皮下注射在三周给药期间每2到3天就在10毫克/公斤。肿瘤体积测量与数字卡尺每周3次,使用公式计算:0.5×长×宽2(毫米3)。体重,头发外套,和活动监控每周3次,每天检查动物福利。动物安乐死当肿瘤达到2000毫米3肿瘤的端点。实验进行了两次。第一实验车辆组招收7小鼠和lestaurtinib组6小鼠。第二个实验在两组小鼠6。
3.5。统计分析
肿瘤体积与标准错误被绘制。曲线被截断时,尤其是群组目前研究的动物数量下降到低于50%的动物数量开始队列。肿瘤生长延迟(TGD)方法被用来分析肿瘤药物治疗的影响时间端点(TTE)治疗给药方案(11]。统计学意义治疗TTE值中值比较确定的生存率较双尾以95%的置信度值统计分析。
4所示。结果与讨论
五个直接从病人肿瘤碎片(50 - 125毫米3)植入5接受者NSG老鼠开发病人派生异种移植模型。肿瘤移植的4个月内,所有五个老鼠产生肿瘤约1000毫米3体积。组织学分析所有异种移植和显示高度相似的特征病人之前premortem活检和尸检标本(图1 (d))。ki - 67免疫组织化学染色法进行确认人类细胞在异种移植增殖样本。这个模型和相关数据是公开和代表JAX肿瘤模型库作为PDX TM00360 [31日]。
拷贝数变异只是评估对患者肿瘤的P0 PDX肿瘤失败的质量控制。几个地区的染色体观察放大和删除符合之前横纹肌肉瘤的分析包括收益在染色体2、8、11、12、20 (32]。此外,在染色体观察5到19岁。损失观察染色体2、9、10和11所示。基因在放大区域包括几个经常放大在软组织肿瘤:到,MDM2、GLI4, MYC [33]。
TruSeq癌症面板有针对性的扩增子测序在病人和P0 PDX肿瘤样本显示一个碱性R1181C突变和没有其他48个基因的突变面板包括国家管制当局方面,喀斯特,极品,PIK3CA,CTNNB1,FBXW7基因。的BCOR和FGFR4基因不像他们不包含在分析TruSeq癌症面板。鱼化验显示没有涉及PAX3分裂或PAX7。
所有的老鼠一样容忍身体重量的治疗和临床观察剩余的稳定为车辆和lestaurtinib治疗老鼠。对治疗肿瘤增长逐渐随着时间的推移所表示的意思是肿瘤体积。车辆之间没有统计学意义在肿瘤的生长和lestaurtinib治疗组和kaplan meier生存曲线车辆和lestaurtinib治疗组之间没有显著差异(;图2)。
(一)
(b)
横纹肌肉瘤化疗是主要的治疗方法,尤其是在这种情况下我们的病人,手术切除是不可行的34]。Monsma等人先前使用的PDX模型肺泡横纹肌肉瘤,首先识别潜在的治疗基因表达分析,然后测试代理的功效在活的有机体内(35]。这种方法类似于一个在我们的研究中。之前鼠标erm模型显示不同的通路与个人通路相关肿瘤发生特定的网站,这表明代网站特定的异种移植能借洞察治疗罕见变异,如PM-RMS [36]。
5。结论
据我们所知,这是第一个patient-derived异种移植为parameningeal横纹肌肉瘤。我们和其他人以前描述的重要性研究解剖37,38]。这个病人死于重型erm与质量效应在完成辐射,同时还接受化学治疗。能够获得治疗耐药erm肿瘤组织解剖并生成PDX至关重要我们理解耐药性的机制和能力评估新的治疗方法针对识别目标的影响。这是特别感兴趣的,虽然这个肿瘤并展示一个碱性R1181C突变,lestaurtinib (71 nM Kd alaska airlines)仍然没有影响(39]。这种突变可能不会开车可能对治疗的反应,或者大多数复发癌症不会回应单药治疗。虽然我们的研究没有证明反应的异种移植肿瘤pan-kinase抑制剂,代PDX从解剖组织提供了一个工具来识别潜在的新靶向治疗,以及治疗可能目标lestaurtinib抗肿瘤。
信息披露
所有作者都批准提交的论文。
利益冲突
没有利益冲突报告除了注意作者尼尔·c·古德温是受雇于一家盈利性公司,市场patient-derived异种移植,而作者Kaur巴利语,卡罗尔·j·布尔特和苏珊·d·Airhart受雇于一个非营利公司市场patient-derived异种移植。
作者的贡献
所有作者的工作作出了重要贡献。
确认
这项工作是由一个Nylund家庭遗赠,反弹基础遗留礼物试点项目,和勇敢的礼物,更强,更聪明儿童癌症基金会战斗。作者也负债累累的家庭使这无私的组织可能的礼物。