文摘

乙醛脱氢酶(ALDH)是一个癌症干细胞标记。视黄酸具有抗肿瘤特性,包括诱导细胞凋亡和增殖的抑制作用。视网膜、视黄酸的前体,可以氧化视黄酸脱氢酶,包括ALDH。我们假设视网膜可能转换为视黄酸效率较高的癌症干细胞,由于高ALDH的活动。我们以前观察到ALDH活动更大的高转移性K7M2骨肉瘤比nonmetastatic K12的操作系统(OS)细胞细胞。我们还证明了ALDH活动与骨肉瘤患者的临床转移,表明ALDH可能是一个特定于转移潜力高细胞的治疗目标。我们目前的结果表明,视网膜优先的表型影响ALDH-high K7M2细胞与ALDH-low K12的细胞,这可能是由视网膜的高效转换视黄酸K7M2 ALDH的细胞。视网膜处理的高转移性K7M2细胞减少核扩散,入侵能力,超强的抗氧化能力。视网膜改变metastasis-related基因的表达。这些观察表明,视网膜可以用来专门针对操作系统的转移性癌症干细胞。

1。介绍

类维生素a是一类化合物组成的几个信号分子,如视黄酸和视黄醛,在结构上与维生素a(视黄醇)[1]。这些分子起到至关重要的作用在各种细胞过程的监管。类维生素a已被证明对细胞产生肿瘤抑制效果根据他们与细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs),以防止细胞循环过程(1]。此外,他们也影响癌症细胞分化和凋亡2]。许多癌症已被证明有异常低水平的各种类维生素a。

视黄酸、视黄醇的导数可以抑制恶性肿瘤的增殖和诱导细胞凋亡和分化在各种类型的癌细胞1,3- - - - - -6]。由于视黄酸的抗肿瘤特性,其作用正在调查在各种恶性肿瘤的治疗3]。目前用于治疗急性早幼粒细胞白血病和已被证明导致完全缓解(7]。视黄酸来源于其前体,all-trans-retinal(也称为视黄醛或维生素A醛)、脱氢酶的作用,包括乙醛脱氢酶(ALDH) (8]。先前的研究已经表明,高ALDH活动预测穷人生存在各种类型的癌症9,10),如乳腺癌[11),上皮癌(12],肉瘤(13]。ALDH活动往往是专门调节在癌症干细胞被认为是肿瘤干细胞的标志(10,14- - - - - -16]。因此,我们认为它是合理的假设,因为更高的癌症干细胞ALDH活动,视网膜可以更有效地转换为视黄酸通过癌症干细胞,因此优先诱导这些细胞的凋亡和变更。

骨肉瘤(OS)是最常见的原发性肿瘤的骨头。它有双峰年龄分布与主峰在第二个十年的生活和一个小峰从50岁的患者中观察到的。肺是最常见的转移扩散,和生存最终是由缺乏肺转移性疾病的存在。因此死亡相关操作系统转移到肺的结果而不是原发肿瘤本身。操作系统并没有改善患者的预后,在过去几十年由于缺少专门针对OS细胞治疗转移性的潜力。由于我们有限的理解生物学的肉瘤转移,这个问题仍然没有解决。

我们演示了各种细胞因子和信号通路的作用在操作系统转移使用两个相关的细胞群发生自发的鼠操作系统(17- - - - - -20.]。这些细胞系,K12 K7M2,不同转移潜能,K7M2显示更多的癌症干细胞的特性和更大的肺转移率与K12的细胞。特征和转移潜能的差异表明,K7M2和K12的特性不同的多个生物因子和信号通路激活状态:ALDH Notch1和哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)。这些信号通路改变操作系统的抑制细胞的行为在体外(17- - - - - -20.]。我们观察到K7M2细胞表明ALDH基因表达和活动大于转移K12的细胞越少。此外,ALDH活动在培养细胞被发现更大的骨肉瘤患者经历了临床转移(21]。我们因此猜测ALDH可能代表一种手段专门针对肿瘤细胞高转移潜能。

我们当前的研究调查的影响小说这些metastasis-related基因治疗方法。在目前的研究中,我们试图利用增加ALDH活动水平在高转移性K7M2 OS细胞研究视网膜细胞生长和转移的影响。考虑到视网膜的能力被ALDH转换为视黄酸和ALDH的高水平的表达在癌症干细胞,我们假设治疗视网膜会选择性地诱导细胞凋亡和抑制肿瘤生长在K7M2 OS细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和视网膜的治疗

K12 K7M2细胞在增殖培养基培养(10%的边后卫在DMEM)。5000个细胞被播种在每个12-well塑料盘。细胞治疗与1µg / mL或5µ克/毫升all-trans-retinal(σ)溶解在1毫升的扩散介质。K7M2细胞治疗1µL DMSO作为控制。细胞培养2天,在被固定为mRNA隔离观察或收获。

2.2。Fluorescence-Activated细胞排序(流式细胞仪)ALDH的细胞活动和排序分析

ALDH酶活性测定使用Aldefluor工具包(干细胞技术)。培养K7M2细胞治疗以及对照组resuspended Aldefluor缓冲区(1×10⁶细胞/毫升)和孵化在37°C按照制造商的指示。在细胞排序过程中,细胞被洗Aldefluor缓冲区和维持在4°C。FL1 BD FACSAria细胞分选系统的通道和FACSDiva软件(6.1.2版;Becton, Dickinson和公司,圣何塞,CA)被用来评估ALDH的活动。Fluorescence-activated细胞排序(流式细胞仪)是用来收集细胞根据其荧光强度,这对应于细胞的ALDH的活动水平。细胞水平高低ALDH分别分离和培养。

2.3。半定量逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

RNeasy +迷你包(试剂盒)和iScript互补脱氧核糖核酸合成装备(Bio-Rad)被用来从细胞中提取RNA并生成cDNA、分别。rt - pcr进行使用Bio-Rad MyiQ热循环(Bio-Rad)。表1显示了感觉和反义为rt - pcr引物及其产品。后循环参数用于所有反应:94°C 5分钟;30以下的周期:变性为45秒95°C,退火30秒(53°C-56°C),并扩展为45秒72°C。目标基因的表达规范化GAPDH的表达,作为控制基因。ImageJ软件(版本1.32 j、美国国立卫生研究院的贝塞斯达,MD)被用来执行rt - pcr分析。乐队的集成密度计算基于面积和平均灰度值的产物。所有分子乐队GAPDH规范化。

2.4。细胞在体外入侵检测

在体外入侵的能力K7M2细胞治疗视网膜与控制使用一个实时细胞入侵和迁移(RT-CIM)分析系统(究其生物科学,Inc .),用好吧transwell板(CIM-plate 16,罗氏诊断GmbH)。威尔斯在参议院的表面涂有基底膜基质(美国BD生物科学,贝德福德,MA)的不同浓度(2.5%,5%,10%)。血清培养基(10%的边后卫)添加到低的井室。细胞(4×10⁴采用无血清每)在参议院被播种。通过基底膜基质细胞的迁移被监控系统24小时每15分钟。数据分析是使用RTCA软件1.2提供的工具。

2.5。肌动蛋白染色

每组细胞治疗与phalloidin共轭Alexa萤石488(表达载体)观察肌动蛋白组织。治疗和控制细胞在增殖培养基生长在12-well板(50000个细胞/板)。第二天,盘子和PBS洗两次,固定在3.7%甲醛溶液在室温下10分钟,并与PBS洗两次。0.1%的细胞被permeabilized Trition x - 100与PBS 20分钟再洗。5μL phalloidin methanolic股票的解决方案,200年μL PBS, 1% BSA添加到每个好,被允许站20分钟,洗前再次与PBS。300年μL (300 nM DAPI用于核染色。

2.6。统计分析

本研究的所有实验的统计分析是使用数据从至少三个样品从每个治疗组。统计学意义是通过学生的评价以及。组间差异被认为是显著的值< 0.05。

3所示。结果

3.1。视网膜处理的高转移性K7M2细胞增殖能力下降和超强的抗氧化能力

K7M2细胞已被证明功能更高ALDH活动与K12的细胞(17,18]。K7M2细胞接受all-trans-retinal (5µg / mL) 2天观察细胞培养皿中较少而参与K7M2细胞(图1(一))。retinal-treated K12的细胞相比,实际上的扩散retinal-treated K7M2细胞更明显降低(图1优先),表明细胞凋亡增加retinal-treated K7M2细胞。此外,retinal-treated K7M2细胞也显示较高的接触过氧化氢诱导细胞凋亡(250µM, 1小时),如被propidium碘(PI)染色(数据没有显示)。我们之前的结果显示,排序ALDH-high K7M2细胞抗氧化应激细胞死亡,而排序ALDH-low细胞(17]。与视网膜细胞治疗ALDH-high K7M2 (5µg / mL) 2天的比例显著增加凋亡细胞接触引起的过氧化氢,而参与控制ALDH-high K7M2细胞(图2)。凋亡效应更明显比ALDH-low K7M2细胞。这个观察表明K7M2细胞的抗氧化应激是优先减少视网膜高ALDH的细胞活动。

3.2。视网膜细胞治疗K7M2导致修改基因表达Metastasis-Related因素和ALDH活动减少

半定量PCR分析K7M2细胞有或没有治疗视网膜的表达水平进行了比较各种信号分子参与细胞增殖、凋亡和转移。治疗视网膜等级的差别导致了对这些信号就是明证Notch1和Hes1的表达下降。此外,还有减少骨形成蛋白2 (BMP2) cMyc,和ALDH水平虽然克罗索,肿瘤抑制,与视网膜up-egulated治疗(图3(一个))。此外,ALDH K7M2细胞的活力测定证实视网膜治疗(包括1µg / mL和5µg / mL)能够减少K7M2 ALDH活动的细胞(图3 (b))。

3.3。视网膜细胞治疗K7M2改变细胞形态特征和入侵能力下降

我们之前的结果表明,K7M2比K12的细胞和细胞功能不同的细胞形态有明显高于迁移和入侵的能力在体外(17,18]。这里,肌动蛋白由phalloidin证明K7M2细胞染色处理视网膜经历了在移民相关细胞形态特征明显的改变减少invadopodia,扮演至关重要的角色在细胞迁移(图/入侵4(一))。最后,在体外入侵检测进一步显示,治疗K7M2细胞视网膜(5µg / mL, 2天)导致减少细胞入侵与未经处理的细胞(图4 (b))。

4所示。讨论

All-trans-retinal是视黄酸的前体,可以转换为视黄酸脱氢酶,包括ALDH。视黄酸已被证明造血和神经干细胞的诱导分化。视黄酸似乎诱导细胞凋亡和分化的癌症和已成功用于治疗急性早幼粒细胞白血病(1,7]。然而,视网膜作为抗增殖剂在操作系统的作用还没有被研究过。基于视网膜可以转换ALDH视黄酸,和ALDH活动通常是在癌症干细胞(9,15,18),我们调查了视网膜的作用会对高转移性细胞OS。

我们的研究显示,视网膜能够优先目标高度转移K7M2细胞功能更ALDH活动和其他干细胞特征,通过抑制增殖和诱导这些细胞的凋亡。视网膜的作用减少细胞增殖和细胞生存被公开展示了细胞使用过氧化氢氧化应激。ALDH-high K7M2细胞表现出更大的增加,细胞凋亡相比ALDH-low K7M2细胞。此外,我们的rt - pcr结果还显示,视网膜治疗各种差别导致对这些基因参与细胞增殖和细胞生存。即Notch1的表达水平,Hes1 cMyc, BMP2降低剂量依赖性的方式。此外,有一个upregulation克罗索,肿瘤抑制基因。

此外,使用视网膜作为治疗剂不仅雇佣视黄酸的抗增殖特性,还利用了某些因素产生的肿瘤干细胞。视网膜上的细胞的作用是由视黄酸2]。鉴于视网膜视黄酸的转换需要脱氢酶的作用,可以预期,视网膜的活动在肿瘤干细胞会更高,产生更高的ALDH的数量,从而使视网膜疗法非常具体。因此,我们的研究结果表明,视网膜可以作为细胞的“特洛伊木马”的专门针对癌症干细胞。

由于肺转移是OS患者死亡率的主要原因,是至关重要的制定治疗方案,专门针对操作系统的转移潜能细胞。肌动蛋白染色进行细胞形态学的变化遵循治疗视网膜。我们之前已经证明invadopodia K7M2细胞形状和外观的变化在细胞的迁移与变更/入侵潜力[17- - - - - -21]。我们的结果表明,除了作为一个抗增殖剂,视网膜也减少了细胞的侵袭性。基于这些结果,我们得出这样的结论:视网膜细胞疗法有可能专门针对转移操作系统,因此有可能减少肺转移的发生率,死亡率在操作系统的根本原因。

本研究的局限性之一是基于实验的结果在体外。虽然一些研究已经证实K7M2细胞相似的行为人类OS细胞的增长,有必要进行在活的有机体内研究以验证这些结果。

5。结论

我们目前的结果表明,视网膜能够具体作用于OS细胞表达高水平的ALDH,以促进这些细胞凋亡。癌症干细胞通常特性高ALDH活动,视网膜可以用来专门抑制癌症干细胞的生长和增强转移潜能。我们的研究首次证明视网膜治疗肿瘤发生的潜在应用。我们建议视网膜可能会用于目标OS细胞具有干细胞特性,最终减少这些细胞转移的能力。

缩写

ALDH:	醛脱氢酶
视网膜:	All-trans-retinal
流式细胞仪:	Fluorescence-activated细胞分类
骨形态发生蛋白:	骨形成蛋白
mTOR:	哺乳动物雷帕霉素靶。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者将从国家卫生研究院授予博士承认资金支持库尔特·维斯(K08 CA177927),肉瘤基金会(SFA),美国匹兹堡大学癌症研究所,匹兹堡治疗肉瘤,Jon Houy Houy家庭爱的记忆。