文摘
黏液样/圆细胞脂肪肉瘤(毫升/ RCLS)是第二个最常见的脂肪肉瘤融合致癌基因的类型和特征FUS-DDIT3或EWSR1-DDIT3。前面分析的细胞周期调控蛋白透露G1-cyclins突出表达,细胞周期蛋白依赖激酶及其抑制剂,但很少细胞进展通过G1 / S边界。在这里,我们调查扩展到蛋白参与细胞衰老在基于免疫组织化学研究17毫升/ RCLS病例。大亚种群的肿瘤细胞表达了RBL2口袋蛋白质和衰老相关的异染色质1γ和IL8受体β。我们得出这样的结论:美国/ RCLS组织包含肿瘤细胞衰老的主要人群,这可能解释这种肿瘤类型的缓慢增长。
1。介绍
脂肪肉瘤是最常见的软组织肿瘤在人类和黏液样/圆细胞脂肪肉瘤(毫升/ RCLS)是第二个最常见的脂肪肉瘤类型。在多数情况下MLS / RCLS大肌肉发展,通常在大腿1]。MLS / RCLS组织组成的圆形到椭圆形形变量间充质细胞和成脂细胞的数量,设置在黏液样基质细管道毛细管网。大多数情况下MLS肿瘤生长相对较慢,但10 - 15%显示超细胞圆细胞形态(RCLS)用更少的黏液状的组件与不利预后有关(1]。
融合致癌基因FUS-DDIT3或EWSR1-DDIT3出现在几乎所有情况下MLS / RCLS。他们的结果t(12;16)或t(12;22)染色体易位和诱发的角色在发展联盟/ RCLS [2- - - - - -5]。FUS-DDIT3和EWSR1-DDIT3编码转录因子异常解除目标基因的表达(6- - - - - -8]。例如,我们之前显示FUS-DDIT3直接诱发白细胞介素6的生产和IL8通过绑定白细胞介素6和IL8启动子(9,10]。
最近的一项研究报告说,大多数美国/ RCLS病例也叔启动子突变,这表明一个叔活动增加和延长细胞寿命11]。RCLS变体也与额外的突变有关,通常在PIK3CA [12]。
先前的研究的细胞周期调节蛋白在MLS / RCLS显示经济增长的一个突出的表达促进G1细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK),与细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂coexpressed P16, P19和P27(也称为CDKN2A、CDKN2D CDKN1B, resp。) (13]。该模式表明,生长促进细胞周期蛋白/ CDK活动中和了CDK抑制剂,这可以解释低频率被Ki67增殖细胞和细胞周期蛋白染色(通常小于8 - 4%,职责。)(13]。
最近的衰老细胞的调查结果表明,他们表达细胞周期蛋白,G1 CDKs及其抑制剂以及典型的细胞因子及其受体表达的签名(14- - - - - -17]。这些新数据和概念提供了一个可能的解释观察到的表达模式在美国职业足球大联盟/ RCLS和促使重新调查关注衰老标记。在目前的研究中,我们采用免疫组织化学(包含IHC)和一群17毫升/ RCLS病例分析与经济增长相关的蛋白质的表达控制和衰老。结果表明,很大比例的美国职业足球大联盟/ RCLS肿瘤细胞衰老。
2。材料和方法
2.1。组织样本
所有肿瘤的临床病理的特点提出了在桌子上1。Formalin-fixed组织在手术之前从未经处理的情况下与MLS / RCLS嵌入在使用常规石蜡过程和储存在室温下。本研究使用组织样本是伦理委员会审批与哥德堡大学的有关。所有选定MLS例检查两个临床病理学家专业软组织肿瘤的第一作者,也是临床病理学家。
2.2。细胞培养
人类包皮派生成纤维细胞(8)通过在RPMI1640培养5%胎牛血清。免疫荧光法研究了5天之后10 Gy剂量的x射线辐射。MLS细胞系402 - 91,1765 - 92,和2645 - 94和HT1080克隆4,18,19]在RPMI1640培养GlutaMAX和8%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。所有的媒体和补充剂从生活中获得的技术。所有的细胞都维持在37°C与空气含有5%股份有限公司2。
2.3。il - 6依赖试验
MLS细胞系402 - 91,1765 - 92,和2645 - 94年被播种到96微量滴定板在2000细胞/好,可以满足于8小时。培养基中补充了取代3%胎牛血清,有或没有一个单位/毫升的重组白细胞介素6和0.5有或没有μ白细胞介素6克/毫升的单克隆抗体马伯206(研发系统)。台盼蓝排斥细胞数在一个倒置显微镜后48小时的潜伏期。一个巴尔病毒无限增殖lymphoblastoid细胞系作为积极响应控制(20.]。
2.4。免疫组织化学和免疫荧光显微镜
一系列的5μ从每个活检组织部分被削减,deparaffinised,水化,在微波炉煮10分钟抗原决定基查询系统,并与表中列出的抗体染色2。结合抗体是用LSAB可视化二次抗体链霉亲和素生物素过氧化物酶系统(DAKO)。彩色部分是光学显微镜检查。
免疫荧光分析、文化人类成纤维细胞被洗两次与PBS和固定在4%多聚甲醛在PBS。在PBS两个洗后,幻灯片是安装在一个包含DNA结合的山不变色染料DAPI (4 6-diamidino-2-phenylindole盐酸盐)(Olink生物科学)和荧光显微镜检查。数为每一个抗原抗体进行了测试和评估包含IHC染色的组织部分包含发表积极的和消极的细胞群。所选主要抗体被免疫印迹分析,还测试了MLS细胞系和其他参考细胞系(其它地方描述的那样13]。辐照成纤维细胞被用作控制衰老标记(表使用3)。RB1表达的检测工作满意只有抗体和协议详细表2。评估包含IHC染色是由克里斯蒂娜Kabjorn,专业病理学家,皮埃尔阿曼。
2.5。流仪分析细胞周期的相位分布
脱蜡,石蜡包埋,formalin-fixed组织和单细胞悬浮体准备贴上propidium碘(生命技术、目录号P3566)根据供应商协议,如前所述21]。流仪分析使用流式细胞仪DNA含量是评价石中剑系统(BD生物科学)。ModFit LT软件(真实软件公司)是用于分析和峰值检测识别G1的分布、年代,G2的细胞。
2.6。鱼的分析
间期鱼FUS-DDIT3分析和EWSR1-DDIT3重组(22)是对formalin-fixed执行1 - 4μ石蜡组织切片。三个分开探针、DDIT3付,EWSR1 (Vysis Inc .),根据厂家提供的协议使用。核与10复染色μL 4′, 6′, -diamidino-2′-phenylindole盐酸盐(DAPI)。由两个独立的部分进行了分析和重新分析评论家。至少每节100核得分。完整的解释、融合和分裂的信号是基于指南推荐的制造商和其他临床实验室使用这种方法。
3所示。结果
辐照成纤维细胞被用作控制衰老标记和抗体。我们的数据显示出很强的表达的调查相比,辐照细胞衰老相关的标记来控制培养细胞(表3)。
我们Ki67包含IHC染色结果(表1)和以前的数据13]表明,大多数美国职业足球大联盟情况下包含很少Ki 67阳性细胞,通常低于4%,但一些RCLS组织包含较小的组织地区高达8%阳性细胞。先前的调查还显示只有少数细胞表达S-G2阶段特定的细胞周期蛋白,说明大多数的细胞被逮捕在G1期13]。在这里,我们的流式细胞术分析从两个人类细胞核毫升/ RCLS g1期细胞组织显示,94%和96%,分别为(图1),支持我们的结论,大多数美国/ RCLS肿瘤细胞在细胞周期G1期的被捕。
(一)
(b)
包含IHC口袋蛋白质的分析显示,9 - 94%的细胞表达RB1相关的扩散和0 - 93%蛋白质RBL2表示剩下的阶段。因此很明显,有重叠RB1和RBL2蛋白质的表达。
我们只包含IHC分析显示弱信号RB1蛋白质相比,美国职业足球大联盟组织控制从其他类型的肿瘤组织样本。这促使进一步分析RB1在MLS细胞蛋白表达。免疫印迹分析显示强烈的表达一个正常大小的RB1蛋白在所有三个调查MLS派生细胞系(图2)。被迫表达FUS-DDIT3没有影响RB1表达在人类HT1080纤维肉瘤细胞系(图2)。
14 - 76%的肿瘤细胞异染色质蛋白(HP1呈阳性γ)(表1和图1)。一起口袋蛋白质的结果,这些数据表明,很大比例的美国/ RCLS在G1期细胞被逮捕,衰老细胞的肿瘤含有大量分数。
细胞衰老与不同的细胞因子和细胞因子受体表达已知签名和FUS-DDIT3诱导肿瘤细胞中白细胞介素6和IL8表达。包含IHC MLS / RCLS组织分析表明,衰老相关IL8受体β(也称为CXCR2)表示在50 - 91%的肿瘤细胞(表1和图1)。我们测试了MLS / RCLS肿瘤细胞株体外生长和存活白细胞介素6的依赖,但没有治疗效果与白细胞介素6、白细胞介素6阻止抗体检测(数据没有显示)。
4所示。讨论
我们之前的分析细胞周期调节表达在MLS / RCLS建议多数肿瘤细胞在细胞周期G1期的被捕(13]。只有几个百分点的细胞逃避逮捕检测到低Ki67的数量和细胞周期蛋白阳性细胞。支持这一结论在当前Ki67包含IHC 17毫升/ RCLS病例分析,流式细胞术分析两种情况。
Ki67和血细胞计数分析辅以一种包含IHC基于调查的口袋蛋白质RB1 RBL2(也称为施敏原著和P130)。RB1和RBL2是重要的细胞周期调控和控制中心扩散驾驶转录因子。RB1增殖细胞中表达和诱导衰老也是必要的,虽然RBL2休息和衰老细胞中表达。因此,RB1降低的水平和RBL2的水平增加,当细胞进入nonproliferative或衰老的细胞状态(23- - - - - -27]。我们包含IHC结果RB1和RBL2支持先前的结论,大亚种群的肿瘤细胞处于静息状态。
包含IHC染色的RB1 MLS / RCLS组织给一般弱信号要求进一步分析。六种不同RB1特定抗原抗体和各种染色/检索条件进行测试(数据没有显示)。相比,染色强度RBL2和HP1γ,发现弱信号总是在MLS肿瘤组织和RB1染色相比,美国职业足球大联盟组织也是弱引用的其他实体肿瘤组织。分析美国职业足球大联盟/ RCLS派生细胞系显示RB1蛋白表达水平与其他肿瘤细胞系和强于正常成纤维细胞培养(图的表达式2)。比较HT1080纤维肉瘤细胞有或没有FUS-DDIT3表明,融合蛋白没有直接影响RB1表达式(图2)。综上所述,我们的数据表明,美国职业足球大联盟/ RCLS细胞能够RB1的正常表达。衰落RB1表达式在MLS / RCLS与差别可能因此造成正常对这些基因的许多肿瘤细胞生长停止。
一些衰老细胞类型的特点是核异染色质焦点可以可视化DNA-stains和异染色质蛋白的表达增加1γ(HP1γ)[28,29日]。IHC HP1分析γ在MLS / RCLS组织显示异构模式与大量的强染色细胞。这表明,大亚种群的肿瘤细胞衰老与异染色质的形成,从而扩大他们可能永远排除在进一步扩散。
FUS-DDIT3结合的启动子区域IL8和白细胞介素6编码基因导致这些基因的表达(9,10]。白细胞介素6报告作为自分泌生长或生存因子在几种肿瘤类型(30.- - - - - -33]。然而,我们的研究结果表明,白细胞介素6不是增长/毫升/ RCLS细胞的生存因素。最近白细胞介素6和IL8被报道的部分细胞因子表达谱(白细胞介素6和IL8)是典型的衰老细胞(34- - - - - -36]。而不是作为生长因子,白细胞介素6一起IL8可能因此在MLS / RCLS衰老机制的一部分。我们的数据显示IL8受体表达的肿瘤细胞是符合这个解释。IL8受体β表达也可能表明衰老相关IL8自分泌活动的肿瘤细胞也产生IL8 [7]。示意图表示的研究衰老相关因素在MLS / RCLS如图3。
我们假设的主要亚种群MLS / RCLS细胞衰老似乎矛盾的最近的报告说,美国/ RCLS肿瘤携带叔启动子突变。这些突变可能表明一个叔活动增加和不灭的肿瘤细胞(11]。衰老细胞的大量MLS / RCLS肿瘤可能,然而,是由于癌基因诱导应激反应导致衰老。支持这个假设我们之前的体外实验FUS-DDIT3转染成各种细胞类型。迫使FUS-DDIT3表达导致细胞死亡和衰老在大多数细胞类型,只有极少数人宽容细胞系细胞保持增殖能力(18]。幸存FUS-DDIT3转染细胞也有较慢的体内和体外的增长率比野生型细胞(18]。致癌应力诱导衰老已经报道了许多致癌基因和被认为作为一个主要障碍在体内对肿瘤发展(14- - - - - -17]。这种机制也可以解释观察到的低增长率和大量的衰老细胞在MLS / RCLS肿瘤。
10毫升/ RCLS病例的百分之十五显示圆细胞形态,这是与提高增长率和不利预后有关。检查我们有限的情况下未能发现任何RCLS形态和表达数据之间的相关性分析的标记。可能联系RCLS衰老细胞的形态和数量更大的肿瘤中被测试材料。
辐照成纤维细胞表现出很强的表达相关联的所有研究衰老标记。在临床研究中,我们曾报道,辐照MLS / RCLS肿瘤导致转换的脂肪瘤和高度分化的脂肪细胞形态学像细胞(37]。进一步调查辐照MLS / RCLS肿瘤将显示如果这种治疗导致成熟衰老细胞向脂肪细胞的细胞。这种效应在其他肿瘤类型(已报告38]。
我们调查了17毫升/ RCLS肿瘤衰老相关蛋白的表达。结果表明,大亚种群的肿瘤细胞处于衰老细胞状态的特点是HP1的表情γ、RBL2和衰老相关的细胞因子和细胞因子受体。大量的衰老细胞的存在可以解释观察到的缓慢增长的肿瘤类型。
利益冲突
作者都没有任何经济或其他利益冲突方面的出版。
确认
这项工作是由瑞典癌症协会支持,瑞典研究理事会,LUA /阿尔夫资助,西Gotaland,国gabrielsson研究基金会,约翰简颂癌症研究基金会瑞典医学研究学会BioCARE哥德堡大学的国家战略研究计划和威廉和玛蒂娜·朗格的基础科学研究。