文摘

转移是骨肉瘤患者的主要死因及其诊断仍然是困难的。在临床前研究中,然而,强制报告基因的表达在骨肉瘤细胞显著提高了检测的结果,因此,研究的质量。我们最近表明,邓恩细胞配备了lacZ报告基因传播于原发肿瘤皮下尽量高转移性亚系LM8,但只有macrometastases LM8细胞增长。在目前的时间进程研究,tail-vein-injected邓恩和LM8细胞定居在24 h在同一频率在肺,肝脏和肾脏的老鼠。此外,邓恩细胞也增长macrometastases,但是,LM8相比,推迟两个星期在肺癌和一个星期在肝脏和肾脏组织,符合延长小鼠的生存。邓恩,LM8-cell-derived卵巢和脊柱转移发生的频率更低。在体外邓恩细胞显示,减少侵袭性更强比LM8细胞接触抑制,细胞间粘附和一些癌症,dormancy-related基因差异表达。总之,邓恩细胞,LM8相比,有一个相似的功能,但更长的延迟形成macrometastases并提供一个有趣的新实验系统研究肿瘤细胞休眠。

1。介绍

小鼠肿瘤模型,利用道肿瘤细胞是有价值的工具,用于临床前研究在许多类型的癌症。肿瘤表型变化的反应道肿瘤细胞的遗传操作提供洞察的复杂机制肿瘤发病和转移。小鼠肿瘤模型也使新药的临床试验和治疗策略旨在提高癌症治疗。

鼠标毒株特异性免疫缺陷小鼠同源的或异种移植模型也已建立了骨肉瘤(OS),最常见的原发性骨肿瘤在儿童和年轻人1]。常用同源的OS小鼠模型利用小鼠邓恩OS细胞系被孤立的近50年前由邓恩和Andervont自发发展中OS原发肿瘤影响鼠标(2]。皮下(南)回注这些细胞的小鼠同源的影响显示快速增长的主要肿瘤,但随后的自发转移到肺,人类疾病的主要转移性网站,没有观察到。在90年代末,Asai和建筑师成功地建立一个高度转移邓恩亚系名叫LM8 [3]。这是选择在活的有机体内根据邮局的程序和费德勒连续回注的细胞分离从最初罕见的肺转移4]。邓恩LM8细胞,与原始细胞,可再生产地传播于原发肿瘤皮下肺,形成多个肺转移发生率100% (3]。因此,LM8模型进化到一个最常用的同源的OS小鼠模型的临床前药物测试(1]。

我们最近重新评估,在活的有机体内邓恩转移性质的原始细胞,比较它与高转移性LM8亚系利用转基因细胞持续表达的细菌lacZ基因(5]。跟踪遥远的组织和器官的肿瘤细胞转移的半乳糖苷染色的单细胞水平首次证明邓恩细胞自发转移从南卡罗来纳州初选肿瘤肺和肝脏发病率一样LM8细胞。然而,邓恩细胞,不同于LM8细胞,没有长到macrometastatic焦点仍在肺和肝脏内微小细胞组成的集群或单个细胞,直到研究结束的25天。仍然察觉这些结果与标准组织染色技术,如苏木精和伊红染色。这些发现解释了为什么邓恩细胞被视为nonmetastatic迄今为止。

转移是一个复杂的多步骤过程和多个基因和因素调节各个步骤(6- - - - - -8]。不同的细胞过程沿着转移级联也受到时间变量调节包括转移的时间延迟(9]。最近的研究结果,比较了转移的效能和属性LM8和父母的邓恩在影响小鼠细胞的实验周期25天提出了质疑,邓恩细胞缺乏macrometastases生长和发育所需的细胞机制转移利基或他们是否经过更长一段比LM8细胞转移延迟到达靶器官。

这里,邓恩和LM8细胞的转移特性进行了进一步的分析在体外,两个后续研究在活的有机体内回答这个问题提出的最新报告(5]。在第一次在活的有机体内时间进程的研究,LacZ转导邓恩和LM8细胞静脉注射(注射)注入到小鼠尾静脉的影响和个体动物在两组的老鼠被随机选择和牺牲在不同时间点后25天肿瘤细胞注入。在第二个生存的一项研究中,影响小鼠静脉输液注射lacZ转导邓恩和LM8细胞检查,直到他们变得奄奄一息,不得不牺牲。在时间进程的研究中,肺、肝、肾和生存的研究,此外,尿道和一些动物的分析了脊髓微,macrometastases半乳糖苷染色的牺牲各自的器官和组织。有趣的是,邓恩细胞形成macrometastases在肺和肝脏和肾脏的推迟一两周,分别比LM8细胞。延迟macrometastases的发展也反映在邓恩的大大延长中位生存——而LM8-cell-injected老鼠。总之,邓恩的细胞,就像LM8细胞,配备所需的所有细胞机制传播小鼠不同器官的影响,但是,不同于LM8细胞,邓恩细胞似乎经过一段时间的转移延迟到达在这些器官。

2。材料和方法

2.1。细胞系

鼠标操作系统细胞系邓恩和LM8是逆转录病毒转导lacZ基因(描述5)和培养在火腿DMEM / F12 37°C(1: 1)介质(表达载体,卡尔斯巴德,CA)补充heat-inactivated FCS为10%与5%的调湿大气孵化器有限公司₂。

2.2。RNA提取和微阵列分析

RNA隔离、准备和阵列杂交进行描述(10]。短暂,总RNA从邓恩和LM8细胞分离是量化通过测量吸收在260和280 nm和RNA完整被琼脂糖凝胶电泳进行评估。互补的RNA制备阵列杂交进行功能基因组学中心(瑞士苏黎世)使用Affymetrix老鼠基因组430 2.0(45101探针集)数组。原始数据标准化并使用比赛进行统计分析(http://race.unil.ch/)。获得的数据集被过滤通过设置一个叠化截止> 2(两个方向)。结果数据被分为两组,一个包含调节基因LM8邓恩相比,另一个包含表达下调的基因。这两组数据进行分析显著富集某些京都百科全书的基因和基因组注释(KEGG)通路通过数据库,可视化和综合发现(大卫)生物信息学资源(11]。

2.3。互补脱氧核糖核酸合成和实时PCR分析

1μ克总RNA是reverse-transcribed cDNA使用高容量RNA-to-cDNA工具包(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)根据协议由制造商提供。三个独立的RNA提取个人细胞系reverse-transcribed 10在最后一卷μl .实时PCR在StepOnePlus进行实时PCR系统(美国应用生物系统公司)96 -孔板。Mmp2引物(FP: CGCTCAGATCCGTGGTGA;记者:CGCCAAATAAACCGGTCCTT)、Bhlhb9 (FP: CCAGCCAGAGGGAAGAATAGC;记者:AAAGGCAGCAGAACACAAAGC)、Fn1 (FP: CGAAGCCGGGAAGAGCAAG;记者:CGTTCCCACTGCTGATTTATCTG)、Src (FP: TACCACTCCTCAGCCTGGAT;记者:ACACGAGGAAGGTGGATGTC)和Gapdh (FP: TGCAGTGGCAAAGTGGAGAT;记者:TTTGCCGTGAGTGGAGTCATA)爆炸与NCBI引物设计软件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)。从个体RT pcr反应进行了一式三份。互补脱氧核糖核酸相当于50 ng的RNA和合适的引物被添加到电力SYBR绿色PCR大师(美国应用生物系统公司)和混合样本pre-incubated 50°C 2分钟和95°C 10分钟,然后接受40孵化周期在95°C为15秒和60°C 1分钟。Ct值的阈值设置为0.325。验证单个产品的扩增的PCR反应,融化曲线每次运行后生成和分析。相对表达水平比较计算的周期阈值(ΔΔCT)方法和被GAPDH表达规范化。

2.4。西方墨点法

细胞融合在正常中增长到80%。上层清液(SN)制备细胞饥饿/晚2毫升的无血清培养基。第二天,SN收集,漂浮细胞被离心分离去除,SN的体积以及细胞的数量决定。为西方墨点法SN的音量调整细胞的总数。SN样本孵化与Laemmli样品缓冲5分钟在95°C,然后由sds - page分离,随后转移到硝化纤维膜。MMP2在4°C在一夜之间被孵化的兔多克隆anti-MMP2主要抗体(Abcam)其次是孵化的RT 1 h和二级辣根过氧化物酶共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(圣克鲁斯生物技术有限公司)。蛋白质被可视化与止动剂化学发光底物(微孔)和量化VersaDoc成像系统(Bio-Rad实验室)。

2.5。评估细胞间粘附和接触抑制

评估细胞间粘附细胞集群的品位是决定第一次试验。Subconfluent邓恩和LM8细胞分离1毫升Accutase(σ),计入血细胞计数器,调整到每毫升250000个粒子(单个细胞> 90%)。两毫升然后播种到6-well超低附件板(10厘米²;合演)和四个图片/ 4 x的随机领域被客观(3.6毫米²)和一个蔡司的观察者。播种后立刻Z1显微镜,在不同的时间点。使用ImageJ粒子数的图片进行分析。聚类结果在减少粒子数。25 h集群被移液分离20倍上下1毫升Gilson吸管。集群的百分比> 1000像素的总粒子(> 20像素)计算。在第二个测定细胞间粘附估计通过计算单个细胞的数量和两个或三个细胞悬浊液的集群使胰蛋白酶化subconfluent和融合性的细胞。单个细胞的百分比计算的单个细胞的数量和细胞集群中观察到三个随机选择的字段的血细胞计数器。单个细胞或细胞群的总数统计在个别实验不同的100年和150年之间。估计的力量细胞间粘附,细胞被播种在24-well板在30%和40%之间的融合和允许形成一个支流单层。 Six wounds per cell line and experiment were then generated with a sterile pen with a tip diameter below 1 mm. The wound widths were then measured using a Nikon Diaphot TMD microscope with a 10x objective and a 10x ocular with a graded 1 mm scale. Contact inhibition was assessed by counting the total number of cells grown to subconfluence or visual confluence in 25 cm²组织培养瓶。细胞悬浊液的细胞使胰蛋白酶化和整除数血细胞计数器。

2.6。三维人工基底膜降解和迁移试验

Subconfluent细胞使胰蛋白酶化和resuspended没有FCS在冰冷的细胞培养基。细胞密度估计hamocytometer和调整到500个细胞μl .相同数量的冰冷的细胞悬液和人工基底膜(10毫克/毫升)涨跌互现,25岁μL是应用于6-well板一式三份的中心。30分钟后胶凝在37°C, 2毫升的细胞培养基补充10% FCS补充道。逃避焦点之外的基底膜基质寄宿生,造成人工基底膜的迁移和退化矩阵相结合,在显微镜下计数。逃税事件每下降是与细胞的数量成比例下降,和逃税早些时候发生在更高的细胞植入细胞的密度(没有显示)。

2.7。时间的邓恩和LM8实验转移

八周大女性影响HeNCrl(摘要)老鼠从查尔斯河实验室(Sulzfeld、德国)前至少10天的开始实验。住房条件和实验协议按照指南的“瑞士Bundesamt毛皮Veterinarwesen”和苏黎世的当局批准。0天的实验中,10⁶lacZ在200年被转导邓恩或LM8细胞μL PBS的尾静脉注入小鼠。健康的老鼠每天监测。天1、4、7、14、21日和25个肿瘤细胞注射后4每组小鼠随机选择牺牲了和分析了选择的组织和器官的存在转移最近描述(5]。短暂,血液从肺部被灌注与PBS根据与氯胺酮麻醉,甲苯噻嗪、乙酰丙嗪。肺被固定原位下10分钟的通货膨胀为3%多聚甲醛(PFA)。随后,肺部、肝脏和肾脏被移除,与2% PFA和0.2%戊二醛固定PBS在室温下30分钟,然后用PBS沾半乳糖苷溶液(Lausen恩佐生命科学公司,瑞士)在37°C至少3个小时。的照片全肺和肝脏被E620 SZX 10双目显微镜下单反相机(奥林巴斯公司(日本东京)和JPEG文件导入到PowerPoint软件。特写镜头的器官表面被Kappa PS 20 C数码相机(Gleichen, Kappa光电GmbH德国)连接到一个Eclipse E600显微镜(尼康公司(日本东京)和TIFF文件导入到PowerPoint软件。由于肾脏的凸性和强烈的色彩,特写镜头表面的结果不能。

2.8。生存实验邓恩和LM8实验性转移模型

鼠标应变和源,住房条件,肿瘤细胞的数量,和肿瘤细胞注射的路线是那些上面描述。在这个实验中,metastases-bearing老鼠每组(8)尽可能保持活着,牺牲个人当他们成为垂死挣扎。肺、肝脏和肾脏以及其他选择器官(卵巢、脊柱)当时也准备和分析描述。

2.9。统计分析

的在体外数据统计分析与双尾成对的学生的以及和统计分析kaplan - meier生存曲线日志等级(Mantel-Cox)测试和Gehan-Breslow-Wilcoxon测试。数据被认为是明显不同的。

3所示。结果

3.1。邓恩和LM8细胞之间的差异在细胞间粘附,接触抑制,侵袭性在体外

细胞间粘附和接触抑制的损失以及通过细胞外基质降解和迁移能力的先决条件转移的肿瘤细胞在远隔器官。在目前的研究中,我们发现,播种后相同数量的单独细胞> 90%超低附件盘子邓恩细胞(上部面板图1(一))聚合速度远远超过LM8细胞(较低的面板图1(一))集群导致显著提高(前两个小时内)聚合速率(图1 (b))。后1天两个细胞系形成圆形的集群领域的意思μ米²邓恩和μ米²LM8进一步显著增加,直到第三天μ米²(),μ米²()。有趣的是,1和3天后邓恩细胞形成的集群更定期(圆球体)比由LM8细胞(图1(一))。分离的一天(最后一张照片后的集群面板图1(一))显示一个较低的金额()大集群相比,LM8邓恩(图1 (c))。此外,当单个细胞的百分比在使胰蛋白酶化评估人口来自汇合的邓恩和LM8细胞,它被发现高17% (;)在LM8邓恩文化(数据未显示)。这些观察表明,在融合性的文化中,邓恩细胞之间的细胞间粘附强于LM8细胞之间。这些观察结果也符合那些在化验受伤。那里,伤口应用LM8细胞单层膜的宽度是32% (;)小于那些伤口邓恩细胞层(图中找到1 (d)),再次表明显著降低细胞间粘附强度邓恩相比LM8细胞之间。此外,在视觉融合LM8细胞的细胞密度为70%高于邓恩细胞(;)暗示重大损失邓恩相比LM8细胞的接触抑制(图1 (e))。

邓恩的能力和LM8细胞降解和迁移一个三维矩阵评估人工基底膜试验。立即和24 h后播种细胞细胞迁移的基底膜基质下降(图中没有观察到1 (f))。在稍后时间点,避疫源地是人工基底膜的表面可见下降,表明OS细胞降解基底膜基质,并迁移到本地,略有下降(图的表面1 (g))。避疫源地的数量不断地增加了96 h(图1 (h))。更长的潜伏期后,相邻的焦点开始融合,不再是可以量化的。两天后细胞播种LM8逃税疫源地的数量增加速度远远超过邓恩的细胞和最大的区别是观察到72 h当LM8细胞形成了6倍数量的逃税疫源地比邓恩细胞(;图1(我))。结果表明高流动性和矩阵退化邓恩相比LM8细胞的能力。

3.2。邓恩和LM8细胞株基因表达分析显示不同调控基因“癌症通路”(KEGG通路)和休眠基因之一

有充分的证据表明,肿瘤细胞传播,获得所有必要的属性成熟macrometastatic焦点转移性小众的遥远的器官,可能保留这些属性时分离和培养在体外(9,12]。基于这个假设,我们执行的微阵列分析邓恩和LM8细胞株,随后分析了他们的基因表达谱的差异。总共1257个基因集规范有差异(> 2倍变化;在邓恩和LM8细胞。大卫的程序检测到的这些调节基因集富集17 KEGG通路(表1)。最高的基因浓缩被发现“癌症通路”(3.78%),其次是“粘着斑”(2.68%)、“Cytokine-Cytokine受体相互作用”(2.31%),和“肌动蛋白细胞骨架调节”(1.95%)。从31日与癌症通路相关的基因集,19明显下降,12显著调节高度转移LM8细胞low-metastatic邓恩相比(表2)。有趣的是,表达下调基因不仅在数量上占主导地位的,而且对褶皱的变化。虽然upregulation LM8细胞最高矩阵metallopeptidase 2 (Mmp2)基因转录(~ 7倍),(~ 24倍)差别最明显对这些被发现的设备配体(Kitl)基因转录。褶皱的变化表达下调基因的前5名(Kitl, Pparg, Vegfc、Ptgs2 Pdgfb)范围从24.57到5.95,在前5的调节基因(Mmp2、Dapk2 Tcf7, Wnt1,和Birc3)从6.91到3.18。

第二个我们检查我们的微阵列数据分析的微分调节的基因可能参与肿瘤细胞休眠(13- - - - - -15]。44位调查基因(7中描述(13- - - - - -15])的表达式是邓恩和LM8细胞之间明显不同(> 2倍变化;;表3)。在这些基因中,结缔组织生长因子(Ctgf)基因是唯一一个发现调节(2.72倍),邓恩相比LM8细胞。基本helix-loop-helix域包含类B9 (Bhlhb9) 61倍减少是最严重之一在邓恩相比LM8细胞表达下调基因。纤连蛋白1 (Fn1),劳斯肉瘤癌基因(Src),转化生长因子β2 (Tgfb2),转化生长因子β受体1 (Tgfbr1)和原肌球蛋白1α(Tpm1)基因,另一方面,是表达下调邓恩相比只有2-3-fold LM8细胞。

选择基因(Mmp2 Bhlhb9、Fn1和Src)微阵列的数据经中存在(图2(一个))。Bhlhb9, Mmp2和Fn1之间的单个基因的差异表达邓恩和LM8细胞比在微阵列分析更加明显。此外分析了MMP2蛋白表达的条件培养基。免疫印迹分析显示8番MMP2高水平FCS-free上层清液LM8细胞比上层的邓恩细胞(数字2 (b)和2 (c))。

3.3。延迟的形成相比Macrometastases邓恩LM8细胞影响老鼠与长期生存

潜在的差异结果邓恩,LM8-cell-derived肺转移调查在时间进程的一项研究中,监控微的形成和macrometastases选择器官的影响老鼠在输液注射1×10⁶LacZ邓恩转导或LM8细胞。微转移细胞株,单个细胞或细胞群组成的直径小于0.1毫米,已经观测到一天后静脉输液注射肿瘤细胞(TCI)在肺部(图3(一个)第一组特写图片在上、下面板)和肝脏(图3 (b))和肾脏(图3 (c))表面。在肿瘤细胞注射后4天的器官的转移模式,邓恩和LM8-cell-injected老鼠,出现不变。然而,一周后TCI第一转移焦点大于0.1毫米,视为macrometastases成为可见的小鼠的肺中注入LM8细胞(图3(一个)较低的面板)。Macrometastases LM8-injected小鼠肝脏和肾脏的首次检测到的动物牺牲两周后TCI(较低的面板数据3 (b)和3 (c))。邓恩在老鼠身上注射细胞,另一方面,分析器官仍然只包含微转移的周1和2的实验(上面板数据3(一个)- - - - - -3 (c))。但是,有趣的是,三个星期邓恩细胞注射后,肺部(图3(一个),上面板),肝脏和肾脏(上面板数据3 (b)和3 (c))的老鼠显示第一次提前macrometastases。然而,这些Dunn-cell-derived macrometastases大大小于其在肺,同时观察到肝脏,肾脏LM8-injected老鼠。显然与持续增长的各自macrometastases保持观察到的差异大小,直到研究结束的25天。有趣的是,在这两个,邓恩和LM8-cell-injected影响老鼠,最后各自的肝脏和肾脏的大小macrometastases大于各自的肺macrometastases。LM8-injected老鼠,这是一个意想不到的观察,因为,正如之前提到的,在肝脏和肾脏macrometastases开发延迟一周相比在肺部。图3 (d)计划性地总结了在这个时间进程研究中获得的结果。

执行额外的生存研究调查延迟的影响结果的Dunn-compared LM8-cell-derived macrometastases各自生存的老鼠。摘要:小鼠静脉输液注射相同数量的肿瘤细胞在时间进程研究和牺牲当他们成为垂死挣扎。图4(一)显示相应的kaplan meier曲线。组的小鼠注射LM8细胞,前3个动物不得不牺牲TCI后25天,和这组平均生存时间是26天。这一组的最后两只老鼠变得奄奄一息的33天。第一组中的小鼠的动物注射邓恩细胞,另一方面,必须杀了32天,中位生存时间为40天。最后老鼠这组是牺牲了85天。总的来说,这些结果显示一个统计上的显著差异(在两组老鼠的生存。分析的内部器官垂死的邓恩,LM8-injected老鼠证实了更快的增长macrometastases两个细胞系的肝脏(图4 (b)(iii iv))和肾(图4 (b)(第5))比肺(图4 (b)(i ii))。此外,大规模的转移也发现在几个卵巢的邓恩LacZ——(图4 (b)(v))和LM8 -LacZ又老鼠(图4 (b)(vi))。此外,几两组的老鼠显示后肢骨骼的瘫痪。后期的分析他们的脊髓列显示椎体(图中转移4 (b)(vii-viii))。这些转移是如此之大,他们已经渗透到脊椎的腔导致脊髓的压缩,这是最有可能的原因瘫痪。

4所示。讨论

转移在OS死亡的主要原因。更好的理解细胞机制参与了多步转移过程和转移性疾病的早期诊断的重要性因此足够的治疗时间和可能导致改善患者的生存。不幸的是,尽管所有传播肿瘤类型采用多级过程中很大程度上类似的机制的局部组织入侵,内渗,生存在循环,溢出,和殖民遥远的器官,其传播活动频率明显不同,方向,和时间。即使在相同类型的癌症这些特征可以根据不同基因变化被肿瘤细胞转移过程中(9,12]。

最近,我们已经能够证明,不同于最初报道,南卡罗莱纳州注入老鼠邓恩OS细胞传播到肺和肝脏与相同的频率高转移性衍生品LM8,但是,不同于LM8细胞,邓恩细胞没有进一步发展在实验期间macrometastases 25天(5]。根据这部小说迄今为止没有报告传播邓恩OS细胞的表型,我们在本研究进行实验在体外和在活的有机体内进一步描述LM8细胞相比邓恩的转移功能。转移性属性如接触抑制、细胞间粘附和侵袭性检查在体外。在活的有机体内时间进程和生存研究旨在回答这个问题是否邓恩细胞渗入肺或肝组织永远不会成长macrometastases甚至消失或只有潜伏一段时间作为单个细胞或小细胞集群之前重启过度增殖,形成明显的转移,因为它被描述,例如,乳腺癌细胞(16,17]。

的结果在体外的确研究显示一个假定的温和邓恩转移表型的细胞,例如,减少侵袭性更强的接触抑制,细胞间粘附,比观察LM8细胞。有趣的是,在这里观察到显著提高聚合速率和更快的形成球体的邓恩LM8细胞相比,超低附件板块好按照软琼脂实验化验在前面的研究表明更快锚地邓恩LM8细胞相比,独立成长5]。这些研究结果综合表明,非扩散率可能会决定因素的转移性增长两个细胞系。这是在协议与另一研究LM8细胞overexpressing不同钙粘着蛋白显示与野生型相比LM8大大减少肺转移瘤的形成在活的有机体内但是相似的扩散率在体外(18]。邓恩在侵袭性的差异和LM8细胞中观察到目前的研究在基底膜基质下降试验协议Asai等人的研究结果表明高MMP-2比邓恩LM8细胞表达和活动(3),我们能够确认与我们的芯片,目前的研究中存在,免疫印迹数据。可想而知,邓恩的不同功能和LM8细胞降解和穿透细胞外基质对渗透和殖民的目标可能更重要比逃离原发肿瘤的器官。原发肿瘤部位,癌细胞通常很好支持招募基质和免疫细胞,显著贡献,例如,当地表达一些蛋白酶(ECM的降解19,20.]。在遥远的器官,他们可能更依赖自身能力入侵健康组织。然而,传播肿瘤细胞入侵的能力远处器官的组织只是一个先决条件但不充分的形成明显的转移。众所周知,甚至某些癌变前的细胞谱系有能力传播、渗透遥远的器官,在组织生存不同的从他们的起源21]。肿瘤细胞因此获得额外的属性来实现完整的转移能力(9]。我们的微阵列数据表明下在体外培养条件31个与癌症相关的基因通路和7基因参与肿瘤细胞休眠中不同监管low-metastatic邓恩相比高转移性LM8细胞。有趣的是,几乎2/3的癌症基因通路和6 7 dormancy-related基因表达在低水平高度比low-metastatic邓恩转移LM8细胞,某些基因的差别表明对这些平等的重要性甚至高于别人的upregulation。这是进一步支持的观察,许多表达下调基因的褶皱减少是远远高于大多数调节基因的成倍增加。Bhlhb9是7最严格监管的基因在这微阵列分析。其产品属于基本helix-loop的转录因子家族,这是参与tumorigenesis-associated基因调控(22]。这个家庭的成员,例如BHLHB3,诱导生长逮捕传播肿瘤细胞没有抑制原发肿瘤增长(23)和BHLHB9本身可能发挥关键作用在凋亡细胞死亡24]。PPARG,也强烈LM8细胞中表达下调,属于核激素受体超家族,作为一个肿瘤抑制因子基因沉默或突变的肿瘤发生过程中,例如,零星的结肠直肠癌和其下调/失活明显的攻击性相关疾病(25]。有趣的是,相当多的表达血管生成和metastasis-related基因,特别是生长因子,还发现在邓恩相比LM8细胞表达下调。众所周知,许多癌症相关的基因产物在肿瘤进展和转移双官能团的角色,例如,TGFβ2和TGFβR1。TGFβ常突出表现在旁边的肿瘤微环境,促进肿瘤的生长转移诱导基因的表达重要的传播肿瘤细胞(26]。在遥远的器官,另一方面,其自分泌/旁分泌信号可能要参与在传播肿瘤细胞休眠的诱导和维护14]。

的结果在活的有机体内实验性转移的研究是在良好的协议与这些芯片结果和获得的结果在体外因为他们表明,邓恩的细胞,就像LM8细胞,能够增长macrometastases在肺、肝脏、肾脏和一些老鼠甚至在卵巢和脊柱椎体,但有相当大的延迟相比LM8细胞。因此,邓恩OS细胞不仅能够传播于原发性肿瘤远处器官在前面的报道研究[5),但也长到macrometastases,但在休眠阶段,他们需要获得一些额外的属性在新的组织微环境。在这种情况下,同样重要的是要注意,在LM8-cell-injected小鼠肺macrometastases发生一个星期早些时候比公认的肝脏和肾脏,尽管所有这些器官中微转移早在一天后静脉输液注射LM8细胞。这表明LM8细胞最初选择了高肺转移潜力显然需要一些额外的时间来适应肝脏或肾脏微环境在他们开始之前长到macrometastases在这些器官。他们可能已经获得了lung-specific取向在他们生成的几个周期在活的有机体内选择Dunn-cell-derived肺转移。如瀑特异性转移表型已报告,也可以稳定维持体外(12]。然而,详细的分子机制,提供一个lung-specific取向仍有待调查。令人惊讶的是,在研究结束时,肝脏和肾脏macrometastases邓恩和LM8-cell-injected老鼠的规模远大于各自的肺转移。这些肝脏和肾脏macrometastases,除了偶尔的卵巢和脊柱转移,也有可能危及生命的转移的小鼠生存调查研究。

总之,的结果在活的有机体内研究明确表明,邓恩OS细胞也能够增长macrometastases在不同的组织环境中,但由于一些延迟LM8细胞相比,导致长时间生存。结果进一步表明,收购可能瀑特异的殖民能力后,邓恩和LM8 OS细胞数量不受限制的在不同的器官。

总之,本研究结果提供的证据更快适应高转移性的老鼠LM8 OS细胞比父母邓恩OS细胞后殖民遥远的要求组织传播的主要肿瘤。除此之外,邓恩和LM8 OS细胞表现出类似的转移表型小鼠同源的影响。因此,邓恩OS细胞系可以不再被视为非或转移性低,它提供了一个有趣的新实验系统研究肿瘤休眠。

利益冲突

作者没有利益冲突。

作者的贡献

马提亚j·j·e·Arlt和Ingo陡崖的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持由苏黎世的Krebsliga,沃尔特·l·和Johanna狼基金会,莉迪亚Hochstrasser基金会,苏黎世,苏黎世瑞士国家科学基金会SNF,瑞士,瑞士联盟Balgrist,苏黎世大学。