文摘

肉瘤患者,转移性疾病仍然很难治愈,结果仍然低于最优。治疗方案基本上没有改变,尽管一些有前途的收益已经由单一的代理在特定亚型与靶向制剂的使用。在这里,我们开发了一个系统调查的针对性和细胞毒性药物组合的协同小组肉瘤细胞系。代理独自进行调查,结合不同剂量比率。剂量反应曲线分析了协同使用方法源于周和Talalay (1984)。一个有前途的组合,达沙替尼和triciribine探索使用A673细胞系小鼠模型,和被MRI和组织学评估肿瘤治疗效果。我们发现,组蛋白脱乙酰酶抑制剂和依托泊苷协同,达沙替尼和Akt抑制剂细胞系。索拉非尼和topotecan演示的反应不一。我们系统的药物筛选方法允许我们屏幕上大量的肉瘤代理的组合。这种方法可以很容易地修改以适应其他细胞系模型,验证性分析,如动物实验、临床试验可以提供优秀的临床前数据通知这些罕见的恶性肿瘤。

1。介绍

肉瘤占10%的儿科诊断,8%的癌症在青少年和年轻的成年人,和1%的成人癌症(1]。形形色色的恶性肿瘤通常是致命的手术不能切除,复发或转移性的设置。在不同年龄段不同亚型为主,横纹肌肉瘤,骨肉瘤,心态占据主导地位和尤因肉瘤在儿童和年轻成人和平滑肌肉瘤,脂肪肉瘤和其他软组织肉瘤老年人心态占据主导地位。化疗已经证明在晚期疾病患者临床效益;然而,对于晚期转移性软组织肉瘤患者,预后仍然贫穷,无病生存5年或不到25%;因此,新颖的治疗策略是必要的。

靶向治疗已经显示出承诺在肉瘤亚型,与c - kit突变胃肠道间质肿瘤表明迄今为止最临床疗效[2]。信号通路长期以来一直被认为是活跃在肉瘤,Src是第一个发现致癌基因。单药在胃肠道间质瘤靶向治疗的成功没有复制在其他肉瘤,尽管调查关于靶向治疗临床益处,特别是在组合,继续。单一代理或组合,展示了肉瘤临床活动模型是一个理性的选择进一步的临床调查。然而,单一代理测试在不同剂量水平多年来显示适度影响复发和耐火肉瘤。事实上,当前临床基准活动二线设置3个月无进展生存(40%3]。这个标志,证明至少承诺为靶向治疗软组织肉瘤患者,受到了目标代理舒尼替二期研究莫菲特癌症中心(4]。其他的有前途的肉瘤代理包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂,酪氨酸激酶抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。

尽管单所表现出的承诺在体外、临床调查表明,化疗往往需要可靠的组合诱导反应和改善肉瘤的生存。小儿恶性肿瘤传统上看到的组合化疗药物反应和治愈率,改善当前的医护标准的采用2 - 7日代理在前线设置实体肿瘤。为此,在这项研究中,我们研究了组合多个肉瘤细胞株的细胞毒性和靶向制剂,包括横纹肌肉瘤,骨肉瘤,尤因肉瘤。特别是,我们专注于拓扑异构酶抑制剂结合靶向制剂,观察协同在肉瘤细胞系结合选择的酪氨酸激酶抑制剂和HDAC抑制剂。我们试图建立一个平台,以便快速测定药物组合对肿瘤细胞死亡的影响和协同效应的评估,可加性,跨多个肉瘤组织学或对抗。

2。材料和方法

2.1。临床实验的代理

代理使用包括细胞毒性和靶向制剂。许多这些代理是通过美国国家癌症研究所癌症治疗评估程序(见表1)。结构的所有代理都是公开的。调查药剂的组合都是根据材料转让协议执行。所有可能的组合允许测试代理。请求关注酪氨酸激酶抑制剂,HDAC抑制剂,尽管其他代理的原理被认为是通过案件的基础上。

2.2。细胞培养

从写明ATCC肉瘤细胞系得到(弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞被维护在RPMI或与10%胎牛血清的DMEM根据制造商的建议。细胞生长在37°C和5%的公司₂。所有的细胞系免费测试支原体与MycoAlert每3个月测试(Lonza大公司,大我)。细胞系的身份被确认使用StemElite ID系统(Promega Corp .)、麦迪逊、WI)使用制造商的指令并写明ATCC STR概要文件数据库。

2.3。细胞生存能力分析

药物单独和联合的活动水平由高通量CellTiter-Blue (Promega corp .)细胞的可行性分析。细胞(镀)在每一个384孔板的使用精度XS液体处理工作站(Bio-Tek仪器有限公司、Winooski VT)和孵化过夜。液体处理工作站用于连续稀释药物的媒体,和5μL是添加到四个复制井和额外的四个控制井获得了稀释剂控制没有药物。潜伏期的末尾用药物,5μL CellTiter-Blue试剂的添加到每个。可行的细胞的产物的荧光bioreduction, resorufin(579海里激发/ 584海里排放),测量与协同4标(Bio-Tek仪器,Inc .)。荧光数据被转移到Microsoft Excel来计算百分比生存能力。我们确定IC50值使用s形平衡模型回归和XLfit版本5.2 (ID业务解决方案有限公司)。IC50值从辨病细胞生存能力分析被用来设计后续实验药物组合。

2.4。添加剂和协同效应的分析

对药物组合实验,细胞生存能力分析进行如上所述,和协同的结果进行了分析,使用组合添加剂,或拮抗效应指数(CI)方法由周和Talalay [5]。这种方法的应用,在固定剂量药物浓度稀释使用摩尔比率根据每个药物从初步实验获得的IC50水平(例如,50:1、2:5和1:250)。短暂,量效曲线确定了每个药物单独使用median-effect原则,然后根据实验的观察比较两种药物的效果实现了结合获得CI值。这种方法涉及到策划量效曲线,为每个代理及其组合,使用median-effect方程:,在那里剂量的药物,是所需的剂量效应(相当于IC50) 50%,和分别是影响和影响分数(),是sigmoidicity指数表示的量效曲线。XLfit软件用于计算的值和。词用于药物组合的分析是由isobologram方程相互无排他性的药物有不同的行动模式:,在那里和分母中剂量(或浓度)D1(1)药物D2(2)药物单独出%抑制,而和在分子药物的剂量是1和药物2结合抑制%(即。,isoeffective).,,分别表示合作,添加剂的影响,和对抗。< 0.1的置信区间是表示为+ + + + +,该方法表明强有力的合作。其他CI的符号和描述组合效果如下:0.1 - -0.3,+ + + +,强大的合作;0.3 - -0.7,+ + +,合作;0.7 - -0.85,+ +,温和的合作;0.85 - -0.90,+,轻微的合作;±0.90 - -1.10,几乎添加剂;−1.10 - -1.20,轻微的对立;1.20 - -1.45,−−,温和的对立;1.45 - -3.3,−−−,对抗; 3.3–10, −−−−, strong antagonism; >10, −−−−−, very strong antagonism.

多余的最高单药(EOHSA)计算了使用MATLAB脚本提供了默克公司的布莱恩•罗伯茨。这种方法,计算分数的影响首先从使用Michaelis-Menten剂量反应数据模型与Hill-type动力学和不完整的抑制。特别是EOHSA计算实测面积之间的组合和HSA反应表面,在“最高单药”(HSA)仅仅是两单影响相应的浓度就越高。脚本用于回归最佳CI值一组抑制了由两个抑制剂,并预测剂量反应曲线对于一个给定的CI生成。最后,区域和一个值曲线之间的实际数据和HSA-predicted曲线计算和平均复制实验。

2.5。细胞凋亡检测

半胱天冬酶激活3/7使用384孔板测量基于Caspase-Glo 3/7 (Promega)发光测定。细胞治疗24小时连续稀释的每个化合物或两种药物的组合。

2.6。鼠标异种移植A673尤因肉瘤细胞系

动物实验进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。协议是南佛罗里达大学机构批准的动物保健和使用委员会2805年(应用程序)。

24、三个雄性Balb / cν/ν小鼠皮下注射10⁶细胞在右侧。解决方案中的细胞混合组成的50μL PBS和50μL基底膜基质。小鼠被分为4组:对照组,两组接受达沙替尼或triciribine,和一群接受达沙替尼和triciribine的组合。收到达沙替尼治疗鼠每天200毫克/公斤,口服药物在柠檬酸溶液,和/或triciribine每天2毫克/公斤,由腹腔内注射40% DMSO溶液与PBS等于100μl .代理都给每24小时从周一到周五,每周细胞注射后一周开始。所有小鼠体重日报毫克。卡尺测量两个方向的肿瘤被每日观察增长。肿瘤被允许长到1.5 - -2.0厘米直径在两个方向,用磁共振成像(MRI)定期执行,之后,动物被牺牲了。

肿瘤组织是福尔马林固定,石蜡包埋。肿瘤被切割到4μ米厚,苏木精和伊红染色())。我们评估治疗的效果通过光学显微镜下检查;观察结果是半定量的分析了测量的百分比可行的肿瘤细胞,坏死和纤维化。病理学家是治疗失明。

2.7。核磁共振方法

老鼠和1%异氟烷麻醉O₂并放在迅速插入管摇篮配有压敏呼吸垫下的动物。体温监测光纤直肠温度探头和维持在37°C时控制使用一个小动物监测系统(SA乐器,石溪纽约)。7点所有成像进行了特斯拉用一个水平孔安捷伦ASR 310核磁共振仪器(安捷伦科技,圣克拉拉,CA)配备主动屏蔽梯度强度梯度的能力400吨/米。使用35毫米内径Litzcage线圈(Doty科学,Inc .),我们获得T₂三在轴向飞机快速旋转回声图像,肿瘤的体积。这些图片是重复次成像参数选修回波时间回声间隔= 18女士,回波列车长度的视野一个矩阵的大小15片,切片厚度为1.25毫米,收购100千赫带宽。实现每个TR脂肪抑制期,10 ms的时间高斯饱和脉冲应用1004赫兹在前场的从水中翻转90°角。

中的数据进行了分析使用内部脚本编码Matlab (Mathworks, Inc .,纳蒂克,MA)。成交量从快速旋转回声获得多层图像基于地区感兴趣的每个片的肿瘤。

3所示。结果

3.1。演示的协同组合

许多组合的靶向制剂和针对性和细胞毒性药物的组合协同多个肉瘤细胞系。我们使用了EOHSA方法筛选药物组合效果,所述材料和方法。代表火山的协同作用,表示为EOHSA和日志值,如图1在所有的细胞系(平均补充任何材料网上所示http://dx.doi.org/10.1155/2013/365723图S1)。和有前途的协同作用(即组合。,更高的EOHSA和日志值)包括mTOR, HDAC抑制剂酪氨酸激酶抑制剂,特别是那些有Src和Akt活动。完整的组合效应数据集所有10个细胞系补充任何材料网上所示http://dx.doi.org/10.1155/2013/365723表(并行处理)(序贯治疗)。

3.2。组蛋白脱乙酰酶抑制剂和拓扑异构酶ⅱ抑制剂在各种肉瘤细胞系的协同

Zolinza Vorinostat(萨哈suberoylanilide异羟肟酸),一个hydroxamate HDAC抑制剂,尤其有效地抑制类I和II HDAC,更具体地说,HDAC1 HDAC2, HDAC3, HDAC6 [6]。我们发现vorinostat证明单活动所有10个肉瘤细胞系进行测试。在pediatric-type细胞系,范围从0.5 IC50结果μ4.3 M RD-ES细胞系中μM MNNG细胞系,平均值为1.9μM(表2)。成人型肉瘤细胞株,IC50结果最低sw - 872细胞系(2.5μ米)和高达3.4μ米SK-UT-1细胞,平均值为2.9μm .这些IC50水平是一个数量级内可实现的水平在儿科试验血清最大浓度是1μ米(7]。

拓扑异构酶ⅱ抑制剂如依托泊苷还演示了广泛的活动。pediatric-type细胞系,IC50结果范围从0.5μ6.8 M SK-ES-1细胞系中μM U2-OS细胞系。成人型肉瘤细胞株,IC50结果最低SK-UT-1细胞系为2.5μ米,高达7.4μ在ht - 1080细胞(表2)。细胞也不断与药物治疗72小时在一个常数2:1 vorinostat:依托泊苷摩尔比。使用这个组合,我们发现6 9细胞系表现出协同互动。儿科细胞系的CI值范围从0.6到1.0,平均值为0.8(表2)。成人型细胞系的CI值范围从0.2到0.7,平均值为0.5。vorinostat并发处理和topotecan 24小时导致超过添加剂增加半胱天冬酶激活3/7,表明影响生存能力至少部分介导细胞凋亡(数据2(一个)和2 (b)U2-OS细胞株),如图所示。

3.3。酪氨酸激酶有不同的协同与拓扑异构酶抑制剂

索拉非尼是一种multikinase影响具体目标参与肿瘤细胞增殖抑制剂(8]。Topotecan抑制拓扑异构酶I和目前正在研究在随机对照第三阶段研究在尤因肉瘤(ClinicalTrials.gov标识符NCT01231906),广泛使用在各种儿科肿瘤。

我们发现索拉非尼证明单5检测肿瘤细胞。pediatric-type细胞系,IC50范围从2.6μM - 204细胞系8.0μM MNNG细胞系,平均值为5.8μM(表2)。Topotecan还演示了活动在所有的细胞系,IC50值从6.8到310海里在儿科肉瘤细胞系和从73年到400海里成人肉瘤细胞系(表2)。细胞治疗也不断与索拉非尼和topotecan 72小时在500:1摩尔比,可实现基于最大血药浓度。这种组合的可加性,协同作用,甚至一些对立组合指数从0.53 U2-OS细胞1.7 SK-ES-1细胞整体平均为1.05(表2,数据2 (c)和2(d))。

3.4。达沙替尼和AKT抑制剂演示协同作用在许多肉瘤细胞系

达沙替尼是多个酪氨酸激酶抑制目标代理,包括Src, bcr - abl, c - kit, PDGFRβ,FGFR-1 submicromolar浓度(9- - - - - -11]。Triciribine (API2)是一个三环类核苷类似物,抑制AKT1 2和3通过干扰膜集成,已被证明能够抑制一种蛋白激酶在活的有机体内(12,13]。mk - 2206是一种蛋白激酶激酶的变构抑制剂家族的蛋白质(摩尔级别)256年小组没有额外的激酶抑制活性激酶(14]。

在这里,我们发现,达沙替尼在所有10个肉瘤细胞系证明单。pediatric-type细胞系,IC50结果范围从4.2μM - 204细胞系12μM RD-ES细胞系,平均值为7.6μM(表2)。成人型肉瘤,IC50结果sw - 872细胞系最低为4.6μ米,高达9.9μ米SK-UT-1细胞,平均值为7.7μm . mk - 2206也测试和演示了广泛的活动,与IC50结果从4.3μM SK-ES-1细胞系的11μM U2-0S细胞系,平均值为7.8μM(表2)。成人型肉瘤,IC50结果最低SK-LMS-1细胞系为6.9μM和高达11μ在ht - 1080细胞平均为8.4μm . Triciribine演示活动,IC50结果从6.3μ69 RD-ES细胞系中μ米在MNNG细胞系的24μM(表2)。成人型肉瘤,IC50 SK-LMS-1细胞系中最低为8.0μM和高达30μ米SK-UT-1细胞平均18μM。

细胞治疗也不断的达沙替尼和mk - 2206对72小时在一个常数1:1摩尔比率。所有10个细胞系表现出协同互动。儿科细胞系的CI值范围从0.011到0.46,平均值为0.19。成人型细胞系的CI值范围从0.12到0.57,平均值为0.39(表2)。

细胞治疗72小时连续达沙替尼和triciribine以恒定2:1摩尔比率。所有六个细胞系测试表明协同交互,儿科细胞系CI值从0.06到0.39,平均值为0.24(表2)。两平滑肌肉瘤细胞系的CI值分别为0.24和0.27。达沙替尼的并发处理与mk - 2206或triciribine导致添加剂多活动,和半胱天冬酶激活也容易检测到3/7,表明影响生存能力至少部分介导细胞凋亡(图3)。

3.5。达沙替尼和Triciribine在活的有机体内活动

因为健壮的协同作用的达沙替尼和Akt抑制剂研究在肉瘤细胞系,我们调查了达沙替尼和triciribine在活的有机体内使用A673细胞系。评估肿瘤的3周卡尺测量和核磁共振。

以核磁共振成像、肿瘤体积的相对变化对所有动物的生存都展示了类似肿瘤的增长速度(图4 (b))。6天,未经治疗的对照组和triciribine-treated老鼠显示显著增加肿瘤的生长与达沙替尼和组合组(图中所示4(一)- - - - - -4 (c))。事实上,第四次治疗后2天,达沙替尼证明在所有时间点检测肿瘤体积明显小于triciribine整个实验过程。结合集团同样也显示6天治疗后显著降低肿瘤体积与triciribine和对照组所示。到了13天,达沙替尼组似乎显示肿瘤体积最小,而triciribine似乎没有影响肿瘤的生长。这些结果也同意MRI体积的结果(图4 (b)(图)和组织学)污渍4 (c))。

半定量的组织学分析肿瘤组织沾)演示了整个组合的坏死,达沙替尼组比任何其他组(图4 (c))。同时,未经处理的控制和triciribine只治疗肿瘤显示整体较低数量的坏死,达到统计学意义而达沙替尼和组合组。确凿的体积数据,我们也观察到明显高于未经处理的细胞生存能力和组合。

4所示。讨论

在这项研究中,我们系统地研究了大量的代理和组合来自许多类相对高通量的方式确定为肉瘤化疗的协同组合。由于肉瘤罕见,临床试验很难进行,增加了强劲的临床前数据需要通知临床试验。此外,临床尝试修改在肉瘤化疗和开发新代理已经放缓。

儿科临床前测试程序(PPTP)、多机构研究工作由国家癌症研究所使用标准化的评估新代理在小儿恶性肿瘤在体外和在活的有机体内化验,也测试了特工在60岁以上各种细胞系和异种移植15,16]。通过PPTP,达沙替尼,mk - 2206年topotecan,索拉非尼,和vorinostat已经测试了17- - - - - -21),结果帮助告知单,第一阶段儿科研究。我们的肉瘤细胞系和PPTP结果相似在体外发现,IC50 > 1μ米达沙替尼,0.5 -10人μM vorinostat, 10左右μM mk - 2206,在10μ索拉非尼[M范围17,18,20.,21]。这些微摩尔的IC50水平高于摩尔IC50特定蛋白质酪氨酸激酶抑制剂的目标。因为各式各样的更高的浓度导致细胞反应,PPTP心态占据主导地位表明脱靶效应(21]。PPTP表明主要是低到中间在活的有机体内这些化合物的活性单代理,尽管有显著的肿瘤生长延迟与索拉非尼(4/5检测骨肉瘤细胞18]。Topotecan最重要在活的有机体内上述化合物的活动(19]。重要的是,尽管PPTP调查的组合药物,这一过程是资源密集型22]。

fda唯一批准的代理在前线软组织肉瘤患者使用阿霉素通过抑制拓扑异构酶2和放线菌素d都有活动以及额外的细胞毒性机制。在这项研究中,我们测试了额外的拓扑异构酶I和II抑制剂,可以在选择肉瘤和评估与多元化协同靶向制剂的集合。我们还测试了靶向制剂的组合,发现多个组合证明协同测试细胞系。

hdac的抗肿瘤效应在很大程度上被认为是相关影响DNA的三维结构和影响表观遗传修饰的基因;然而,hdac其他重要角色在细胞中,微管功能包括角色,泛素化,调节热休克蛋白90 (6]。结果从HDAC抑制剂和依托泊苷临床前研究结合促成了当前打开的儿童阶段我学习(ClinicalTrials.gov标识符NCI01294670)与vorinostat(萨哈)和依托泊苷。这些数据已经生成以来,越来越多的证据表明hdac在儿童和成人患者的耐受性。然而,尽管显示承诺作为一个代理,它并没有导致二期开发,从而进一步验证的方法寻找协同组合(7,23- - - - - -25]。

其他承诺类化合物与协同是酪氨酸激酶抑制剂和拓扑异构酶抑制剂。作为一个类,酪氨酸激酶抑制剂有一个巨大的各种目标特异性;因此是不适当的把它们看作一个实体的反应。在我们的研究中,达沙替尼证明了协同效应在我们的大多数肉瘤模型。之前的细胞系实验表明,Src被激活在许多肿瘤细胞行达沙替尼可以诱导细胞凋亡,减少细胞迁移(26,27]。达沙替尼单IC50水平超过一个数量级以上儿科试验,可实现水平的最大浓度的最大耐受剂量为0.3μ米(28]。其他有针对性的通路筛选,PTEN / PI3K / AKT抑制剂/ mTOR通路与达沙替尼展示了一个强烈的信号的协同作用。这个途径中扮演一个重要的角色在肿瘤的生长和生存,在许多人类癌症突变,包括平滑肌肉瘤,骨肉瘤的一个子集29日- - - - - -31日]。表达水平的磷酸化Akt已被证明有预后意义在一个小系列的肢体软组织肉瘤(32]。在我们的鼠标A673尤因肉瘤细胞系的异种移植研究,我们发现在活的有机体内协同作用是不引人注目的达沙替尼和triciribine组合组;然而,这种方法可以用来评估其他有前途的药物组合。

索拉非尼的目标包括丝氨酸/苏氨酸激酶c-Raf和b - raf,受体酪氨酸激酶RET, flt3,和c - kit,在肿瘤血管生成和受体酪氨酸激酶重要,包括血管内皮生长因子受体家族(VEGFR1 2和3)和血小板源生长因子(8]。索拉非尼的抗肿瘤活性在活的有机体内是由其直接影响肿瘤的生长通过其抑制Raf MEK / ERK通路和反血管增生活性的化合物。因为索拉非尼通过VEGF抑制基质的作用机制,这是出乎意料的,这种分析反映了所有可能的抗肿瘤机制活动的组合。Topotecan建立了有效性作为一个代理或作为组合的一部分,在各种小儿恶性肿瘤,包括生殖细胞肿瘤的肿瘤,神经母细胞瘤,急性淋巴细胞白血病、中枢神经系统恶性肿瘤,肉瘤(33- - - - - -41]。它已在多个组合与传统化疗药物,包括alkylators、拓扑异构酶ⅱ抑制剂、拓扑异构酶抑制剂,微管抑制剂(34,39,42,43]。

我们正在探索索拉非尼和topotecan在小儿实体瘤患者中,认识到索拉非尼函数也作为血管生成抑制剂(ClinicalTrials.gov标识符NCT01683149)。承诺活动,无进展生存20周和7周的安慰剂控制的另一个angiogenesis-inhibiting酪氨酸激酶,pazopanib,最近被证明在选定的软组织肉瘤亚型,导致FDA批准该代理的肉瘤,只有第三剂这种疾病迹象(44]。功效通过血管生成或基质机制不能很容易在我们的评估在体外化验。最近的一项研究显示pazopanib和topotecan更引人注目的活动在活的有机体内比在体外在几个肉瘤模型(45]。

我们还发现,达沙替尼结合Akt抑制剂mk - 2206或triciribine证明显著的协同效应在我们的细胞系,尽管水平高于那些易于做到病人血清(13,46]。我们调查了结合在活的有机体内测试通过我们的异种移植模型。尽管肿瘤测量并未大幅减少,我们调查这个肉瘤模型成像的变化通过核磁共振成像和观察治疗后肿瘤病理变化。虽然这个特定的组合可能很难转化为临床益处,它可以探索建立一种转化方法,与其他有前途的组合。

虽然我们现在许多数据组合,对翻译存在一些固有的困难和局限性。最近被发表,索拉非尼严重蛋白质绑定在活的有机体内和vorinostat有一个短暂的生命,不会导致持续24小时在活的有机体内剂量水平(47]。我们也报告肉瘤亚型之间的影响和在组织学亚型的变化。我们认为这很可能是由于固有的肿瘤病人和肿瘤异质性之间的变异在患者样本中描述目前测序的努力(48]。我们的重点是描述组合的影响,迄今为止,我们没有探索阻力或敏感性的标志物。这些见解被更充分地探索,并将这种方法,因为它前进的焦点。

5。结论

这里介绍的方法展示一个全面的,可再生的,和高通量方法探索抗肿瘤效应的组合疗法。组合的、有针对性的、针对性和细胞毒性或多个细胞毒性药物可以用这种方法探索。结合以上两个代理也是可能的,但需要不同的方法在评估协同作用。这个重要的早期临床前数据可以作为确认分析的基础,异种移植研究,最终临床试验。这些努力的结果是导致临床前数据通知两个活跃在儿科临床试验。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究被慷慨地支持的儿童癌症基金会(http://fastercure.org/)。这项工作也一直支持部分由临床试验实验室核心和小动物成像部中心实验室和研究所,NCI指定综合癌症中心(P30-CA76292)。作者感谢拉莎汉密尔顿(莫菲特癌症中心)编辑援助,Shumin张(莫菲特癌症中心)与数据分析,协助和布莱恩·罗伯茨(Merck & Co。)提供MatLab脚本计算EoHSA (VHSA)。作者还要感谢劳拉·霍尔(莫菲特分子基因组学核心)执行细胞系Jarret房子协助博士身份测试和组织学评估肿瘤坏死。

补充材料