文摘
骨肉瘤(OS)是一种罕见的骨肿瘤主要影响青少年。它是与不良预后相关的转移的形成。寻找转移预测标记为病人因此必须优化治疗策略风险和重要的寻找新的药物治疗这种毁灭性的疾病。在这里,我们分析了微阵列基因差异表达的四个人类和两个鼠标OS细胞系系统组成的父母细胞系低转移潜能及其衍生品增加转移性的潜力。使用两个成骨细胞的细胞系系统中,最常见的操作系统表型,我们已经确定了48个常见基因差异表达与父母相比,转移细胞株细胞。转移相关基因的识别子集成骨细胞的操作系统的差异表达基因重叠只有最低限度的其他四个preosteoblast或nonosteoblastic细胞系系统。结果暗示一个操作系统表型具体转移调节蛋白质的表达模式和形式的基础进一步调查病人的样本的基因表达谱与生存分析相结合,目的是优化治疗策略开发新药物,从而提高患者的生存最常见的成骨细胞的操作系统。
1。介绍
骨肉瘤(OS)是一种罕见的但高度恶性骨肿瘤,影响主要是年轻患者的第二个十年中他们的生活。局部疾病患者的生存已经提高了细化的手术技术和引入新辅助化疗。然而,开发转移的病人的存活率仍然很低。操作系统识别的蛋白质参与进展和转移因此直接重要的开发新产品和改进治疗策略。
分析差异表达基因微阵列,比较转移OS细胞系父母细胞系较低的转移潜力,应有助于确定共同的途径,甚至一组蛋白质调节系统肿瘤进展和转移。据我们所知,四人,两个鼠标操作系统系统开发,满足这一要求。人类转移LM5 M132细胞来自父母的巴西和HUO9细胞,分别在活的有机体内选择在老鼠身上进行的重复尾静脉注射的细胞分离从肺转移1,2]。人类的k - ras基因转移获得的143 b细胞被转换居屋计划(3)细胞和人类转移M8细胞在体外subcloning父母MG63细胞的描述(4]。鼠标转移LM8 K7M2细胞也被选中在活的有机体内分别从父母的邓恩和K12的细胞(5,6]。比较微阵列分析与HUO9 / M132 [7),K12 / K7M2 [8),以及最近与巴西/ LM7和居屋/ 143 b细胞(9]。这些研究的结果表明,不同的蛋白质差异表达在每个系统,不同的信号通路参与操作系统肿瘤恶化。这些研究发现ezrin作为一个重要的球员在OS发病机理8,10]。
操作系统是一种异构的疾病。不同类型的细胞来源于间充质干细胞可能会影响到基因组不稳定性在分化的不同阶段(11,12]。组织学检查大多数患者表现为肿瘤与成骨细胞的表型(60 - 70%),其次是chondroblastic和成纤维细胞的操作系统(大约10%)(13]。尽管没有证据表明一种细胞类型依赖倾向转移在操作系统(13不同途径参与肿瘤恶化),这些不同的细胞类型出现的可能性。巴西和邓恩细胞被认为是osteoblast-like细胞或早期成骨细胞表达高碱性磷酸酶(ALPL)活动,拥有甲状旁腺激素(甲状旁腺素)反应,并产生矿化成骨诱导细胞外基质在体外([5,14),而这项研究)。HUO9也描述了成骨细胞的(2),但相对较低的ALPL活动在这个研究表明它们preosteoblastic观察。MG63和K12的被认为是成纤维细胞的15,16],居屋计划有一个混合的成纤维细胞的类型和epithelial-like形态。
在这项研究中,我们分析了差异表达基因微阵列分析的四个人类OS细胞系系统圣/ LM5 HUO9 / M132居屋/ 143 b, MG63 / M8和两个鼠标细胞系系统邓恩/ LM8和K12 / K7M2。基于不同调节基因的浓缩常见基因本体论(去)而言,我们确定了48(17 - 31日下调)一般监管两个成骨细胞的基因操作系统转移系统(圣/ LM5和邓恩/ LM8),共享只在有限数量的其他四个细胞系系统。的可能作用的一些发现基因在成骨细胞的肿瘤进展进行了探讨。
2。材料和方法
2.1。细胞系和文化
圣(htb - 85),居屋(crl - 1543), 143 b (crl - 8303)细胞获得写明ATCC(罗克维尔市,医学博士,美国)。LM5细胞请提供静电的Kleinerman(安德森癌症中心,休斯顿,德克萨斯州,美国),HUO9和HUO9-M132 (M132)细胞m·塔尼语(国立癌症中心医院、东京、日本),邓恩和LM8细胞,t .建筑师(日本大阪,大阪大学医学院毕业,),MG63细胞g . Sarkar(美国罗彻斯特市梅奥诊所),和MG63-M8 (M8)细胞w·t·朱(同济医院、华中科技大学、武汉,中国)。K12 K7M2细胞获得c·卡纳(美国马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所),前者与许可j·施密特(确定,国家环境与健康研究中心,Neuherberg,德国)建立了K12的细胞(16]。细胞在DMEM培养(4.5 g / L葡萄糖)/ F12(1: 1)中补充10% heat-inactivated FCS在湿润的气氛中5%的有限公司2。Subconfluent细胞分离与胰蛋白酶/ EDTA、离心机和细胞球立即在液态氮冷冻,并存储在−80°C到RNA提取。
2.2。阵列杂交,RNA提取和分析
从冷冻细胞总RNA分离颗粒的个人细胞系与TriReagent (Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)作为描述(17]。RNA被量化测量吸收UV-spectrophotometer在260和280海里。RNA的完整性评估了标准的琼脂糖凝胶电泳和使用生物分析仪2100。互补的RNA制备阵列杂交进行功能基因组学中心(瑞士苏黎世)使用Affymetrix人类基因组U133 + 2.0(54675探针集)和Affymetrix老鼠基因组430 2.0(45101探针集)数组。基因表达的信号范围从5 - 22000和6 - 31000的四人,两个鼠标系统,分别。基因表达水平的分布()是相似的两个数组类型作为例证圣/ LM5和邓恩/ LM8系统(补充图1提供的补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2012/937506)。基因表达水平任意设置为低,中间,和高值时< 50岁,50 - 300,和300年>,分别。符合这一标准的约有60%的在低水平表达的基因,20%的人表示在中间,剩下的20%在两种类型的数组的高水平。质量控制,RMA正常化的原始数据,并使用比赛进行统计分析(http://race.unil.ch/)。基因本体论(去)分析使用GOEAST (http://omicslab.genetics.ac.cn/GOEAST/)。我们用智慧路径分析(IPA)版本12710793,建造于162830年。在所谓的岩心分析的第一步,基因(分子)属于监管探针集识别。接下来,截止叠化于800年左右调整选择调节分子(减少噪音,独创性建议约800分子,或更少,分析)。这些分子有资格获得生成网络,(在)直接和分子之间的关系基于文献发现所示。网络被限制在35分子每个为了保持他们可用的大小。
2.3。互补脱氧核糖核酸合成和实时PCR分析
互补脱氧核糖核酸是反向转录从1μ克总RNA与高容量RNA-to-cDNA工具包(应用生物系统公司,培育城市,CA)和制造商提供的协议。三个独立的从个人细胞系反向转录RNA提取最后一卷20μ在StepOnePlus l .实时PCR进行实时PCR系统(应用生物系统公司)96 -孔板。爆炸与NCBI Intron-spanning引物设计引物(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)软件(补充表1)放大的cDNA序列来自选定的基因。五个基因被发现调节和五个基因表达下调被发现通过微阵列分析相比,LM5圣细胞和GAPDH作为参考基因进行了分析。从个体RT PCR反应进行了一式三份。互补脱氧核糖核酸相当于30 ng的RNA和合适的引物被添加到电力SYBR绿色PCR大师(应用生物系统公司)和混合样品preincubated 50°C 2分钟和95°C 10分钟,然后接受40孵化周期在95°C为15秒和60°C 1分钟。Ct值的阈值设置为0.325和获得的价值进行了分析与三角洲Ct(ΔCt)方法。平均Ct值计算一式三份PCR的归一化平均Ct值确定GAPDH基因转录作为衡量cDNA输入。产品出现非特异性扩增的PCR反应被检查排除最终融化曲线的PCR产物。补充图2中给出的数据证实了upregulation四个五个基因的差别,对这些发现的微阵列分析。
2.4。碱性磷酸酶活性、营地刺激和茜素红染色
细胞碱性磷酸酶的提取和测量(ALPL)活动,营生产刺激鸡甲状旁腺与荷尔蒙相关的肽,细胞外基质矿化诱导,其可视化的茜素红S染色进行描述(14]。
3所示。结果
3.1。基因表达分析显示不同细胞系之间的异质性系统和微分基因表达在低和高转移细胞株
四个人类和两个老鼠骨肉瘤细胞系较低的转移潜力相比他们high-metastatic衍生品通过微阵列基因差异表达分析。四个较低的人力系统和调节转移活动包括圣/ LM5 HUO9 / M132居屋/ 143 b, MG63细胞/ M8。的两个鼠标系统由邓恩/ LM8和K12的/ K7M2细胞。比较基因表达水平在四个人类系统中显示每个系统集中在一起,虽然明显不同的表达水平在低和高转移细胞株(图1(一))。有趣的是,这两个细胞系进行的系统在活的有机体内细胞系的选择增加转移性潜力(圣/ LM5和HUO9 / M132)显然是不同的集群的居屋/ 143 b (Ki-ras转换的累积量系统和MG63 / M8系统获得的在体外选择从MG63 M8。聚类的两个鼠标系统不同的基因表达水平低和高转移细胞株也观察(图1 (b))。不同表达基因的数量(即。,up- or downregulated >2-fold with a false discovery rate (fdr) of <0.01) in low versus high metastatic cell lines was highest in HOS/143B and K12/K7M2, lower in SAOS/LM5, HUO9/M132, and Dunn/LM8, and lowest in MG63/M8. Only 1% of total probe sets were differentially regulated in MG63/M8 whereas 2.5–3.6% (SAOS/LM5, HUO9/M132, and Dunn/LM8) and 6.7–8.3% were differentially regulated in the HOS/143B and K12/K7M2 systems, respectively. These findings are summarized in Table1。综上所述,不同的操作系统之间的结果显示显著的异质性细胞系系统和同样数量的变化基因在恶性肿瘤进展可能涉及不同的细胞系。
(一)
(b)
3.2。质膜和细胞外基质蛋白参与绑定,细胞迁移、血管生成和细胞凋亡在肿瘤进展差异表达
基因本体论(去)分析metastasis-regulated(> 2倍;罗斯福< 0.01)基因在所有六个电池系统披露一个浓缩(罗斯福< 0.00001)在最一般的级别1(表2)。这里,5个18“蜂窝组件,”5个20“分子功能”,和18 32“生物过程”的条款明显丰富,又有一个很大的变化在不同的细胞系统。术语“蜂窝组件,”基因属于“细胞”和“细胞外区域”在所有细胞系统丰富,其次是“细胞外基质”(4/6)和“膜”(3/6)。基因仅供“分子功能”一词属于术语“绑定”在所有细胞系统丰富。最大的变化是观察到的术语“生物过程。“这里,浓缩是在所有细胞系统的“生物调控,”“多细胞有机体的过程”、“发展过程,”和“生物粘附,“其次是“细胞过程”(5/6),“回应刺激”(4/6),和“信号”(4/6)。在十一个附加条款浓缩观察不同程度的6个细胞系系统。尽管观测到的异质性,结果表明等离子体膜结合蛋白表达异常,细胞外基质控制发育过程的调控和细胞粘附在老鼠和人类参与肿瘤恶化。
更高和更具体的层面去分析,和重要节点之间的水平和级别1,显示不同的生物过程的异常调节不同的细胞系统(补充表2)。在圣/ LM5细胞系系统,基因在心血管神经发生和发展的异常表达。HUO9 / M132系统、心脏发展也影响与输尿管的花蕾形态发生和基因参与血管生成和细胞迁移是高度管制。居屋计划/ 143 b系统,血管生成和细胞迁移也被解除。此外,细胞凋亡和integrin-mediated信息粘附受到影响。基因参与ERK1和2激酶,MAP激酶,SMAD, TGFβ信号在输尿管的芽,前列腺,血管和肺肺泡发育,神经发生,凝血也大大丰富了各自的条款。MG63 / M8系统只在轴突再生相关基因、细胞表面受体信号传导,细胞内蛋白质激酶活性差别监管。邓恩/ LM8系统,基因参与调控细胞迁移和细胞凋亡和细胞外基质组织上皮细胞,神经元、血管、软骨细胞分化被浓缩在各自的条件。迁移和血管生成在K12的影响/ K7M2系统一起改变卵巢卵泡,乳腺导管和唾腺形态发生,axonogenesis。综上所述,虽然没有共同的生物过程六个细胞系中显示系统,放松管制的细胞迁移(4/6),血管生成(3/6)和细胞凋亡(2/6)可能导致肿瘤的进展。受影响的发展过程主要是神经发生(5/6),心血管(4/6),生殖系统的发展。
此外,我们还分析了这些数据通过使用创新路径分析(异丙醇;智慧系统,http://www.ingenuity.com)。分析确认所有细胞系统与癌变有关流程(列为nr。1生物功能的疾病和疾病细胞系统)(补充表3)。也途径参与细胞运动(排名nr。1在所有细胞系统,LM5除外)和心血管发育和功能(排名nr。1在5 6细胞系统,在LM5排名nr。3),与血管生成/血管通路显著激活,被发现。因此这些结果证实的结果去分析。
3.3。圣/ LM5和邓恩/ LM8细胞线系统代表成骨细胞的操作系统
在人类中,大约有三分之二的操作系统肿瘤患者存在一个成骨细胞的表型。因此我们寻找成骨细胞的标志在我们的微阵列基因表达数据(表3)(审查[18])。转录因子SOX9,成骨细胞祖细胞的标志但不成熟的成骨细胞,表达在低到中级水平在所有的细胞系,除了143 b,这是调节20倍相比,HOS细胞。RUNX2 (Runt-related转录因子2,也称为CBAF1),早期成骨细胞分化转录因子也需要成熟的成骨细胞功能在较低水平的,在高水平表达邓恩/ LM8圣/ LM5 HUO9 / M132和K12 / K7M2系统也在中级水平的居屋/ 143 b系统。在MG63 / M8系统调节4倍从低到中级水平M8 MG63相比。OSX (osterix),一个行为RUNX2的下游的转录因子,在邓恩表示在中间高度/ LM8圣/ LM5, HUO9 / M132细胞。低表达在K12 / K7M2居屋/ 143 b和MG63 / M8细胞。COL1A1(胶原蛋白1),SPP1(骨桥蛋白,骨涎蛋白1),和IBSP(骨涎蛋白2)是由成熟和成熟的成骨细胞。COL1A1在高水平表达细胞系除了143 b,在那里表达下调145倍而累积量。SPP1表达高水平的邓恩/ LM8 HUO9 / M132和K12 / K7M2系统也在低水平的圣/ LM5和MG63 / M8系统。居屋计划/ 143 b是143年从低到中级水平调节统计b相比,HOS细胞。 IBSP was only expressed at high levels in the Dunn/LM8 and SAOS/LM5 systems and was low in all other cell line systems. ALPL (liver/bone/kidney alkaline phosphatase) and PTH1R (parathyroid hormone receptor 1) are expressed by late osteoblast-like cells and mature osteoblasts. ALPL was expressed at high levels only in the Dunn/LM8 and SAOS/LM5 systems and was low in all other cell lines, except in the HOS/143B system where it was upregulated 10-fold from low to intermediate levels in HOS compared to 143B cells. PTH1R was expressed at intermediate to high levels in the Dunn/LM8, SAOS/LM5, and HUO9/M132 cell lines and at low levels in the K12/K7M2 and MG63/M8 cell lines. Similar to ALPL, PTH1R was upregulated 3-fold from low to intermediate levels in HOS compared to 143B. In summary, only the Dunn/LM8 and SAOS/LM5 cell lines exhibited gene expression characteristics of osteoblast-like cells. HUO9/M132 and K12/K7M2 cell lines appear to be osteoblastic precursors that were stalled in the osteoblastic differentiation process at an intermediate step, whereas the HOS/143B and MG63/M8 lines were stalled at an early stage.
邓恩的高ALPL基因表达/ LM8和圣/ LM5证实了通过测量酶活性在细胞提取(图2)。HUO9虽然最小的酶活性检测,M132, HOS细胞,这是25倍低于邓恩/ LM8和圣/ LM5,而没有酶活性可衡量的细胞系。osteoblast-like表型圣/ LM5细胞,包括甲状旁腺素(甲状旁腺激素)刺激营地生产和矿化细胞外基质的形成已经描述(14]。在目前的研究中,甲状旁腺素刺激营地生产在邓恩(倍;,)和LM8细胞(倍;,)和矿化的细胞外基质诱导抗坏血酸,beta-glycerophosphate,地塞米松也观察到(没有显示)。总之,邓恩的酶活性概要/ LM8和圣/ LM5细胞系的表达谱获得的基因表达分析,确认其osteoblast-like属性功能层面。
(一)
(b)
3.4。在场的成骨细胞的OS细胞系系统一般以一组丰富的调控基因作为操作系统治疗的潜在目标
面对同样数量的监管metastasis-related基因在邓恩/ LM8和圣/ LM5细胞系系统(表1)和类似的条款(表中富集模式2),我们调查了如果两个系统一般监管基因可能导致肿瘤进展和转移具体为成骨细胞的操作系统。首先,监管(> 2倍;罗斯福< 0.01)探测器设置列表在这两个系统分离和表达下调探头设置列表中转移性与父母的细胞系。第二,分离,和表达下调探针组列表分析了一般去丰富走在补充表4的水平表示。调节探针集被浓缩在这两个系统在四个术语和表达下调探测器设置在七个方面。去调查集列表通常监管基因进行分析(平均约为1.4探针集/基因)在两个细胞系系统和结果总结在表4。使用这种策略,我们发现48基因是单向监管在邓恩/ LM8和圣/ LM5细胞系系统,其中的17个基因调节和31个基因表达下调。实时PCR分析证实了upregulation 4中的5个5个中的5个基因的差别和对这些结果的基础上选定的微阵列分析圣/ LM5细胞系系统(补充图2),这是在我们以前观察到PCR和/或免疫印迹分析其它基因产物和其他细胞系系统(没有显示)。
从相对频率给定表1,我们可以计算数量,或表达下调的基因在两个系统之间的机会4到6,在分析数据集。我们限制我们的分析基因只在一些常见术语丰富在这两种细胞系系统,通常监管基因(48)的数量远远超过基因的数量将被选择的机会。因此,这些基因在成骨细胞的操作系统可以被认为是相关的转移。在剩下的四个细胞系系统中,我们发现17调节基因的成骨细胞的基因面板1,4,4和0基因也在M132调节,K7M2, 143 b,和M8,分别,但类似数量的基因被发现在相反的方向。同样,发现的31个基因表达下调3、5、9和0基因也在M132表达下调,K7M2, 143 b,和M8,分别,但类似数量的基因调控在相反的方向。考虑到143年b, K7M2调控基因的总数在M132发现数量翻一番,M8相比LM5和LM8细胞,而细胞总数只有一半(表1),很有可能,这些基因可能是通常由机会,在这些preosteoblast不一定导致肿瘤恶化或nonosteoblastic系统。
我们接下来看音标,如果48基因在我们选定的成骨细胞的面板属于一个特定的路径。这一分析显示,一半的选择相关基因(24的48)抑制细胞死亡,使其分子和细胞功能。通路与细胞生长和增殖也刺激,与细胞的增殖和功能“肿瘤细胞系增殖”极大地丰富。函数”(肿瘤)细胞的集落形成抑制。令人惊讶的是,我们还发现函数迁移的细胞“抑制,尤其是SERPINE2的抑制,虽然PAX3的表达(包括在相同的功能和增加迁移)被发现增加,说明这个函数的一些变化。
三个网络被发现显著监管,其中“细胞形态、细胞组装和组织,细胞功能和维护”获得了最高分21调节分子的共有35(补充图3),其次是“细胞死亡,细胞形态、细胞间信号和互动”(13监管35)和“自由基清除、小分子生物化学、神经系统发育和功能”(12监管35)。最后这两个网络是重叠的。
异丙醇的一个有趣特性是确定上游监管机构,如转录因子,可能不会显示一个表情的变化(,因此不包括在分析基因列表),但仍然可能被激活基于目标基因表达的变化。使用这种方法,RUNX2被确认为前激活转录因子之一,因为其直接目标COL24A1 TPM1 HAPLN1, ACTA2在场,其中常见的调节基因。同样,我们确定了MEIS2(目标ETV1, PAX3 PAX6)明显活跃。这个没有相关转录因子的操作系统转移,但在肺癌早期发现监管(29日],卵巢癌[30.),甲状腺癌(31日),和前列腺癌32]。
4所示。讨论
Metastasis-related微阵列分析使用父母低转移性HUO9执行,K12的;累积量和圣细胞及其衍生品转移(7- - - - - -9]。七metastasis-related基因HUO9 / M132系统描述,我们也发现这些基因不同监管方向相同数组。从描述的11个基因转移相关的K12 / K7M2系统我们发现70%的重叠。这也是见过十前调节基因的累积量/ 143 b细胞系系统。50%重叠也观察到当我们相比与圣圣/ LM5系统/ LM7系统(9]。一般来说,高重叠在观察不同监管基因微阵列分析比较不同。
一些生物过程参与肿瘤恶化,如增殖,能动性,入侵,免疫监视,附着力,血管生成,已确定在K12 / K7M2系统(8]。我们还发现浓缩的术语“扩散”,“能动性”,“粘连”,和“血管生成”虽然下级比补充表2中列出。这再次证实了一个高重叠的两个独立的分析系统。前研究发现ezrin最突出的蛋白质参与操作系统进程。因此我们寻找ezrin表达在我们六个细胞系系统。事实上,ezrin过表达70倍相比,K7M2 K12的细胞。然而,在LM8和143 b细胞,ezrin表达下调1.8——2.7倍相比,各自的父母和MG63细胞/ M8系统不规范。在LM5和M132细胞发现,只有最低限度调节(< 2折)相比,水平相应的亲代细胞。因此,基于这些在体外基因表达分析,ezrin只能在操作系统进程中发挥作用的子群系统肿瘤。
在6细胞株基因表达水平的比较系统显示高异质性,说明了超过7倍的区别差异表达探针集的总数。常见的术语也低的浓缩。这表明该细胞机制参与肿瘤恶化系统有所不同。这是符合假设基因组不稳定性(chromothripsis)出现在不同步骤的成骨细胞的承诺是一个操作系统肿瘤形成的原因(12]。在圣/ LM5和邓恩/ LM8细胞线系统,我们证实了osteoblast-like自然,仍然很高RUNX2表达式,使得chromothripsis有可能发生在一个early-osteoblast阶段(11]。此外,这两个osteoblast-like细胞系系统重叠最高监管转移相关基因的数量和浓缩。分析差异表达基因的一个子集,丰富的共同点方面透露的48基因共同调控成骨细胞的细胞系系统,基因数量超过了预期的概率计算。因此,这些基因可能会导致肿瘤进展或chromothripsis生存在成骨细胞的操作系统。根据chromothripsis假设,不同的蛋白质可能导致生存在不同的癌细胞类型或osteoprogenitor细胞在不同发育阶段在本研究中观测到的。
一般17基因调节的两个转移性成骨细胞的细胞系LM5和相应LM8比父母的细胞系。这些基因的相关性正在讨论关于发表文献癌症一般和特定的操作系统。
SERPINE2(蛋白酶nexin 1)是一种分泌丝氨酸蛋白酶抑制剂,抑制凝血因子Xa和夏、凝血酶、tPA和uPA [33]。这里,SERPINE2在转移调节四个六个细胞系的系统,在一个系统显著下调。增加表达蛋白酶抑制剂宁愿会减少侵袭性,从而恶性发展,这也可以看出,我们的异丙醇的分析。事实上,过度SERPINE2在前列腺癌细胞可以减少他们的入侵能力34,在实验操作系统,抑制uPAR途径导致减少肺转移(19]。在胰腺肿瘤,另一方面,SERPINE2促进细胞外基质生产和当地的入侵在活的有机体内(35]。SERPINE2表达式是在结直肠癌,升高与肿瘤级别及其沉默降低anchorage-independent增长,移民,和肿瘤形成36,37]。SERPINE2表达也增加了乳腺癌[38]。SERPINE2促进睾丸癌的淋巴结转移39)和SERPINE2表达也与选择性在乳腺癌肺转移(40)和口腔鳞状细胞癌的淋巴结转移(41]。转移的肺癌细胞对骨也增加SERPINE2表达式(42]。因此,SERPINE2有双重角色在癌症的发展过程中在操作系统的发展及其作用,可能uPA / uPAR独立,可能进一步调查。
FHOD3(甲酸精同族体在脾脏2)是一个家庭的成员参与了肌动蛋白的蛋白质的组装和位于细胞质中。FHOD3主要是表现在心脏和调节肌节在横纹肌组织(43]。虽然没有证据的作用FHOD3在其他癌症,以上的差别,对这些FHOD1 (Swiss-Prot Q9Y613),另一个家庭成员,减少乳腺癌细胞的迁移和入侵在体外(44]。有趣的是,在目前的研究中,发现FHOD3调节四个转移性细胞系。
PAX3(配对盒蛋白质Pax-3)和PAX6(配对盒蛋白Pax-6)核转录因子参与的发展许多组织和角色的讨论PAX3横纹肌肉瘤和恶性黑色素瘤(45,46]。PAX3尤文氏肉瘤也表达了在大多数样品(47]。PAX3只发现在目前的研究在转移性成骨细胞的操作系统,而PAX6在四个细胞系系统中。在圣PAX3过度在体外诱发mesenchymal-epithelial过渡(满足)和增加细胞活性(IPA LM5-LM8共同调控基因和分析(21,22),因此PAX3表达分析在成骨细胞的肿瘤进展在活的有机体内值得进一步检查。
DLX4(同源框蛋白DLX-4)是核转录因子过表达在多种癌症类型(48- - - - - -51]。DLX4抑制的抗增殖作用TGF -β(52),凋亡功能(53]。Upregulation DLX4增加转移性的乳腺癌细胞的潜力在体外和在活的有机体内(49,54)和前列腺腺癌(51),其表达与卵巢癌(先进的疾病阶段50]。这里,DLX4还发现调节三个细胞系的系统,但它是在143年b细胞表达下调。DLX4与增加差别为此,对这些基因的转移潜能在体外和在活的有机体内在肺癌55]。
FOXQ1 (forkhead盒蛋白质问题19)是核转录因子参与乳腺上皮细胞分化和epithelial-mesenchymal过渡(EMT)在乳腺癌细胞56- - - - - -58]。它的表达与癌细胞侵犯在体外和肺转移在活的有机体内在老鼠身上。FOXQ1也在大肠癌中增加致瘤性的血管生成和凋亡的影响59]。在这里,FOXQ1还发现在转移性细胞成骨细胞的操作系统。有趣的是,控制EMT的因素,如FOXQ1和mesenchymal-epithelial过渡(遇到),如PAX3在操作系统中转移在体外。
液态氧(赖氨酰化氧;EC 1.4.3.13)是一种分泌的酶,参与细胞外基质(胶原蛋白和弹性蛋白)交联,也由成熟的成骨细胞(60]。这里,液态高在所有的细胞系进行调查在体外除了圣/ LM5细胞(没有显示)。以前我们显示增加液态MG63细胞相比,胎儿成骨细胞表明液态氧可能与操作系统形成(20.]。尽管LOX表达式没有关联的成骨细胞的表型,液态氧表达调节转移进程中两个成骨细胞的细胞系系统,但在四分之三的表达下调nonosteoblastic细胞系系统。肿瘤抑制以及转移促进LOX在多种癌症类型描述的函数(61年]。分析液态氧蛋白表达在OS患者应该回答这个问题是否LOX表达式有一个双重角色在OS进程取决于细胞背景。
PCBD1(蝶呤carbinolamine脱水酶或二聚代数余子式的肝细胞的核因子1α(食物);)参与回收四氢生物蝶呤辅因子用于氨基酸苯丙氨酸的降解。它调节转录活动(即。,homodimerization) of HNF and is located in the cytoplasm and inside the nucleus. It is overexpressed in colon cancer and in melanoma [62年,63年),但据我们所知目前没有被描述在肿瘤进展。PCBD1是专门在成骨细胞的转移OS细胞。
EHF (epithelium-specific Ets转录因子3)核转录因子参与乳腺癌肿瘤发生[64年),是一个贫穷的生存在卵巢癌的标志(65年]。这里,EHF只在两个成骨细胞的转移性细胞系。
一般31个基因表达下调在转移性成骨细胞的OS细胞系。的一些基因的相关性在操作系统发展进行了讨论。
CCDC80(由癌基因蛋白表达下调1)是一种分泌肿瘤抑制蛋白,促进凋亡级联(66年)和介导生长抑制结肠癌和胰腺癌(67年]。CCDC80是基因通常在所有细胞系统监管调查除了MG63 / M8。Downregulation这个肿瘤抑制基因值得进一步调查的操作系统。
DAB2(残疾同族体2),网格蛋白涂层坑的蛋白质,是一种消极监管机构Wnt /β连环蛋白通路,因此假定的肿瘤抑制(68年]。DAB2 underexpressed肿瘤与正常组织相比,与肺癌的恶性表型,移行细胞癌、鳞状细胞癌、鼻咽癌,食管鳞状细胞癌(69年- - - - - -73年]。在乳腺癌DAB2表达式也减少了,结果TGF老年病β2促进EMT过渡(74年,75年]。在卵巢癌DAB2水平低与贫穷的结果,但非常低的水平,抑制EMT与更好的预后(76年]。这里,DAB2在四个转移性OS细胞系表达下调。
TGFB2(转化生长因子β2)是一种分泌蛋白,可以作为肿瘤抑制肿瘤发生的早期或晚期癌症的转移促进因素(审查[77年])。在操作系统,高架TGFB3表达式与贫穷的生存(23]。在相同的研究只有25例TGFB2不是预测,但是低TGFB2显示趋势可怜的生存。的差别在这里观察到对这些TGFB2 4转移细胞株应该进一步调查。
SLC1A3(兴奋性氨基酸转运蛋白1)被发现在转移四个细胞系中表达下调系统包含在本研究中。这是发现操作系统的肿瘤患者相比,高表达SLC1A3与不良预后相关(24]。
OSMR (oncostatin-M-specific受体亚基β或interleukin-31受体亚基β)是一个制瘤素M受体(OSM;Swiss-Prot P13725)、白细胞介素- 6细胞因子家族的一员。OSM通过JAK / STAT通路抑制细胞增殖的肿瘤细胞(审查[78年),包括操作系统(15和软骨肉瘤79年]。在操作系统中,OSM糖分会让细胞凋亡(25),其过度被发现减少原发性肿瘤的生长和肺转移的形成在活的有机体内在老鼠26]。这些数据,OSMR损失转移细胞株作为本研究中观察到的四个六细胞系的系统分析,指出OSM的重要作用和抑制OSMR OS肿瘤恶化。另一方面,OSM增强在体外转移性活动的一个子集犬和人类OS细胞(80年]。为此,有趣的是,OSM不同影响成骨细胞的分化,这取决于成熟阶段(15]。
TPM1(原肌球蛋白alpha -链)是一种肌动蛋白filament-binding蛋白与不同的生物行为包括恶性转变(审查[81年),它被认为是一种肿瘤抑制基因。TPM1发现表达下调与正常组织相比,结肠直肠癌(82年]。在乳腺癌细胞,失去TPM1赋予女性电阻(83年TPM1抑制anchorage-independent增长)和超表达(84年]。在这项研究中,TPM1被发现在三个转移性OS细胞系表达下调。
DEPDC6 DEP domain-containing mTOR-interacting蛋白质或DEPTOR)是mTOR的负调节信号,因此将是一个肿瘤抑制(85年]。然而,高DEPDC6水平与预后不良相关在骨髓瘤和肝细胞癌(86年,87年),表示一个致癌作用。在三个差别在这里观察到对这些基因转移系统细胞系因此值得进一步检查。
PHLDA1 (pleckstrin homology-like域家庭成员1或凋亡和核内蛋白或TSSC3)是一种细胞凋亡。Downregulation这种蛋白质与转移的进展在乳腺癌和黑色素瘤(88年,89年]。在操作系统,超表达TSSC3诱导细胞凋亡在体外和减少肿瘤的生长在活的有机体内在老鼠27,28]。结果转移LM5 PHLDA1的差别是一致的对这些LM8细胞。
有趣的是,一些讨论蛋白质参与EMT (FOXQ1, PAX3和DAB2)会面,TGF / Wnt /β连环蛋白信号(DLX4 DAB2和TGFB2), JAK / STAT (OSMR)或mTOR (DEPDC6)通路。在另一个微阵列研究中,TGF / Wnt /β连环蛋白通路也增加操作系统转移性活动(9]。
总之,我们已经确定了大量的差异表达基因在低和高转移性成骨细胞的OS细胞系。这些基因为进一步评估应考虑肿瘤恶化的关键球员在成骨细胞的操作系统,主要疾病的表型。
利益冲突
作者没有利益冲突。
确认
作者感谢所有的人,给他们提供了细胞系中描述的部分2。他们也感谢贝蒂娜Langsam准备的总RNA。这项工作是由瑞士国家科学基金会(SNF批准号31003 - 120403年),消息的资助Krebsliga瑞士苏黎世,苏黎世大学和瑞士联盟Balgrist(瑞士苏黎世)沃尔特·l·和Johanna沃尔夫基金会(瑞士苏黎世)和高度专业化的医学项目(HSM)坎顿苏黎世瑞士。
补充材料
补充图S1: (a)的分布意味着日志2基因表达水平在圣/ LM5系统。(b)的分布意味着日志2基因表达水平在邓恩/ LM8系统。
补充图S2:基因表达的定量实时PCR在sao(开放酒吧)和LM5(黑条)细胞。(a)上调和(b)抑制基因在转移性LM5细胞相比non-metastatic父母圣细胞。GAPDH基因被用作参考。
补充图S3:顶级网络被智慧路径分析后分析48一般监管基因在圣/ LM5和邓恩/ LM8细胞系统。红色代表下调(褶皱变化> 2,罗斯福< 0.01)在两种细胞系统,绿色表示老年病的颜色强度指示的程度,或下调。
补充表S1: PCR引物用于微阵列数据的验证、补充图所示S2。
补充表S2:监管(> 2倍;罗斯福< 0.01)探针集丰富(罗斯福< 0.00001)在分析水平高于1,但在重要节点1级。
补充表S3:异丙醇后排名顶尖的生物功能分析。对于每个电池系统,选择一个截止后,分析了相当数量的分子(在MG63 / M8,低数量的探针集-521 -被发现显著监管,对应于一个较低的数-364 -识别分子)。前5名的生物功能,划分为子类“疾病和障碍”,“分子和细胞功能”和“生理系统发育和功能”比较细胞系统中显示的顺序。函数是最常见的观察显示第一个为每个子类。
补充表S4:去一般条款,或衰减在圣转移/ LM5和邓恩/ LM8细胞线系统。