文摘

异常的DNA甲基化在尤因肉瘤并不完全理解。503个基因的甲基化状态在52 formalin-fixed石蜡包埋EWS肿瘤和3 EWS细胞系与人类间充质干细胞主要文化(hMSCs)使用珠芯片甲基化分析。相对甲基化基因的表达在5-Aza-2-deoxycytidine评估——(5-AZA)治疗EWS细胞系和一群主EWS样品和hMSCs基因表达和定量rt - pcr。129个基因表现出显著甲基EWS肿瘤hMSCs相比。36个基因在EWS和unmethylated hMSCs深刻的甲基化。5-AZA治疗EWS细胞系导致upregulation成千上万基因的正常表达,其中包括162例至少增加了2倍。19 36候选人hypermethylated基因的表达增加5-AZA。分析基因表达的一个独立的肿瘤确诊减少六19 hypermethylated基因的表达(妳的COL1A1 CYP1B1,林恩,SERPINE1),VCAN。比较基因表达和DNA甲基化分析被证明是一个有效的方法来识别基因epigenetically EWS的监管。进一步的调查还在继续,阐明这些表观遗传改变在EWS发病机制中的作用。

1。介绍

尤因肉瘤(EWS)的骨与软组织恶性肿瘤最常见的影响青少年和年轻人。EWS可以从组织学上类似的区分肿瘤的存在特征染色体易位,创建一个异常融合产品链接域从春节和ETS蛋白质家族。最常见的染色体易位,存在于所有EWS的85%,t (11;22)(抓起;12)导致的形成EWSR1-FLI1融合基因(1]。EWS-Fli1和其他TET-ETS融合蛋白功能异常转录因子和致癌作用[至关重要2]。然而,EWS-Fli1融合蛋白本身是不够的,促进肿瘤的形成。在许多肿瘤一样,需要额外的基因影响,包括突变或基因改变CDKN1A,TP53,或CDKN2A影响表达式或蛋白质功能(2- - - - - -4]。然而,大多数ews不包含这些改变。因此,我们假设无特征变异和表观遗传改变EWS的发展起着关键的作用。

异常的DNA甲基化的作用在人类恶性肿瘤已是不争的致癌作用和已被证明有助于小儿肿瘤的发病机制以及作为这些肿瘤的分子生物标志物与临床行为(5,6]。然而,甲基化和EWS的发病机制之间的联系还没有被广泛地研究过了。全基因组甲基化分析EWS的障碍之一是,需要大量的高质量的DNA的大多数全球评估表观基因组的方法,这可能会产生问题,在罕见的肿瘤。为了克服这个技术问题,我们使用了一个珠阵列平台描述超过500个基因DNA的甲基化状态从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)主要EWS。我们的研究表明,表观遗传失活的特定基因扮演了一个角色,至少部分的发病机理和这些变化可能导致的调查导致恶性肿瘤的关键路径的识别。

2。材料和方法

2.1。细胞培养、hMSC代和EWS肿瘤样本

EWS细胞系A673、SK-ES-1 SK-N-MC买来写明ATCC(马纳萨斯,弗吉尼亚州)和培养每个供应商的协议。人类骨髓基质主要文化,代表人类的间充质干细胞(hMSCs),生成8个成年女性患者和DNA分离所述[7]。FFPE EWS从范德比尔特大学获得的肿瘤标本病理档案、隔离病人,从1993年到2009年。范德比尔特大学的批准机构审查委员会被授予前组织收购或医疗记录审核。样本选择的描述(请参见图S1补充网上http://dx.doi.org/10.1155/2012/498472)。每个组织样本独立消息来源的证实由一位经验丰富的病理学家EWS (J.B.)的作者之一本文或K.W.(参见确认部分),发现含有50% - -90%的肿瘤。

2.2。DNA隔离

EWS主要组织是提供20μ部分(1.5×1.5厘米)或者是清白的幻灯片包含5μM组织从FFPE组织块。基因组DNA提取使用Instagene矩阵(生物Rad, CA)或RecoverAll总核酸隔离设备(CA),使用制造商的指示和核酸酶的筛选了自由液。

2.3。珠片甲基化分析

DNA分离细胞系,hMSCs FFPE EWS肿瘤样本量化使用PicoGreen荧光测定法(生活技术,卡尔斯巴德,CA),重亚硫酸盐处理使用EZ DNA甲基化工具包(Zymo研究,橙色,CA)和筛选了实现prebisulfite 50 ng / DNA的浓度μl . Bisulfite-treated DNA (100 - 250 ng)标记和调查使用甲基化癌症面板我珠珠芯片阵列和数据收集使用BeadArray读者(Illumina公司,圣地亚哥,CA) [8]。FHCRC基因组学中的每个样本运行共享资源核心,和数据分析使用基因组工作室软件(版本3.2,Illumina公司,圣地亚哥,CA)。37 52主要ES肿瘤和4 8 hMSC样本在重复运行。减少假阳性、性别偏见和识别生物活性hypermethylated基因,并不是所有的调查网站被用于我们的分析。1505年设置的CpG网站代表珠阵列,探测位于CpG岛,而不是X或Y染色体,并在基因的启动子区域(定义为300−700 bp + bp)都包括在内,总计820论文认定503个基因。原始数据补充表所示S2,确定138年论文认定129个基因(罗斯福< 0.05,),证明增加甲基化在初级EWS肿瘤。

2.4。统计方法

珠片甲基化分析、数据质量控制和规范化进行在Bioconductor包中methylumi(http://www.bioconductor.org/)。的主持t统计中实现BioconductorLIMMA包是用来检测不同甲基化网站的细胞系比较。这个数据有相同的解释作为标准t统计;然而,标准误差计算收缩朝着一个共同的价值经验贝叶斯模型借用信息在所有基因(9]。的值从主持t测试被Benjamini调整和业务相关的错误发现的方法来控制多个样本(10]。

Illumina公司基因表达数据,原始数据过滤和分位数正常化进行使用Bioconductor包光民珠array-specific软件包,Illumina公司微阵列数据。的LIMMA包和主持t以及也用于检测差异表达基因。生P值调整为错误发现上面的控制。

2.5。5-AZA治疗

A673、SK-ES-1 SK-N-MC细胞系通道和镀在日志的阶段。最初的24小时后,媒体改变了包含2.5μ米(A673和SK-ES-1)或100海里(SK-N-MC) 5-AZA(原液2毫米在DMSO)。媒体改变了每24小时总药物暴露120小时。这些细胞被然后用无毒媒体24小时内恢复。RNA被孤立使用试剂盒(生活技术,卡尔斯巴德,CA)和RNeasy(试剂盒,瓦伦西亚,CA)制造商的指示。最佳5-AZA剂量确定实验以减少细胞死亡,同时导致大于2倍增加RASSF1A基因和CALCA表达每TaqMan试验(测定nos。Hs00200394 HS01100741, resp)。(补充图)。

2.6。5-AZA表情微阵列分析

RNA从模拟治疗和5-AZA对待EWS细胞系标签使用Illumina公司TotalPrep RNA扩增试剂盒(生活技术,卡尔斯巴德,CA)和分析在重复Illumina公司HT-12全基因组表达珠芯片(Illumina公司,圣地亚哥,CA) FHCRC基因组学共享资源核心。数据分析统计方法如前所述。探针罗斯福< 0.05和≥2倍表达增加5-AZA对待样本包括在分析中。补充表中找到原始数据。

2.7。Methylation-Specific PCR

MSP的引物对CALCA设计使用MethPrimer甲基化(F: 5′GAGAGTAAGATTGGAGTTCGTAGTC 3′;R: 5′AAATAATCTCTATTAATCCGCGAT 3′)和unmethylated (F: 5′GAGTAAGATTGGAGTTTGTAGTTGA 3′;R: 5′CAAATAATCTCTATTAATCCACAAT基因3′)(11)和执行bisulfite-treated基因组DNA的退火温度55°C 40周期产生115和114个基点扩增子甲基化和unmethylated成绩单。酶甲基化DNA是生产使用拟建甲基化酶(新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA)和作为一个积极的控制。

2.8。酸性亚硫酸盐测序

Bisulfite-treated DNA PCR扩增林恩和CYP1B1与MethPrimer重亚硫酸盐测序引物设计:林恩(F 5′TTTTTTAATAATATTTTGGGGATGG 3′;R: 5′AACTTTAAAAACACAAAAACCTAAC 3′, 191个基点扩增子);CYP1B1(F 5′TTTGTAATAATTTATTTGAAGAGGT 3′;R 5′ATAAAAACAACAAATATCCAAACC 3′, 179个基点扩增子)。PCR条件如下:;(;;)×35周期;。PCR扩增子被克隆到一个助教向量(生活技术,卡尔斯巴德,CA),转换,进行DNA提取和测序。测序数据分析使用BiQ软件(12]。

2.9。基因表达的分析主要EWS肿瘤

总RNA分离出32原发肿瘤EWS活检获得儿童肿瘤协会和洛杉矶儿童医院肿瘤库和从3成人原发性骨骨髓来源hMSC文化(d . Prockop)博士提供的请使用试剂盒microrna的工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。所有标本都获得符合HIPAA法规和协议的机构审查委员会的审查。RNA加工的全基因组表达分析使用Affymetrix GeneChip人类外显子1.0寡核苷酸微阵列根据Affymetrix协议。原始数据(.cel)文件从10 EWS细胞系样本请提供的t . Triche博士(CHLA)。正常成人组织的玻璃纸文件从Affymetrix下载网站(http://www.netaffx.com/)。数据核心probeset地区所有数组都分位数规范化使用健壮的多片平均Partek基因组学套件软件平台(Partek,圣路易斯,密苏里州)。转录水平数据来源于使用中值规范化的外显子数据总结,和比较基因表达进行transcript-summarized数据用方差分析多个测试修正。

2.10。定量rt - pcr

RNA是隔绝5-AZA——或者mock-treated EWS细胞系使用试剂盒(生活技术,卡尔斯巴德,CA)和RNeasy净化(试剂盒,CA)遵循制造商的指示。互补的DNA(互补)合成使用SSII逆转录酶(每个试剂生活技术,卡尔斯巴德,CA)协议。TaqMan化验(生活技术,卡尔斯巴德,CA)林恩(没有。Hs00176719)和CYP1B1(没有。Hs00164383)进行步骤1 +(生活技术,卡尔斯巴德,CA)或内髓2 thermocycler (Bio-Rad大力神,CA)一式三份和规范化使用GUSB表达式(化验。Hs99999908)。相对使用比较C表达式计算_T方法(ΔΔC_T)。每个实验重复了三次,计算产生的误差是平均数标准误差。

3所示。结果

3.1。EWS细胞系和初级肿瘤显示DNA甲基化

甲基化配置文件的三个EWS细胞系和52原发性肿瘤特征使用珠芯片甲基化数组。肿瘤样本从范德比尔特大学获得病理档案从1993年到2009年。DNA适合珠芯片分析成功地从52存档中提取样本。百分之六十二的患者是男性,平均年龄为19.5岁(范围3-51年,平均16年)。有趣的是,46%的人在诊断转移性。38(73%)获得的样本在诊断、6(11.5%)时切除,8例(15%)复发(补充表和图)。评估EWS的甲基化变化,这些主要的肿瘤的甲基化模式比较八骨髓基质主要文化。我们选择这些细胞作为控制人口,因为他们是准确的在体外表示hMSCs [7]。从每个肿瘤DNA样本进行了分析使用Illumina公司癌症甲基化面板1数组,和大多数运行在复制(37 52主要ES肿瘤和4 8 hMSC样本)。从获得的数据复制样品高度可再生的细胞系(相关范围0.98 - -0.99,0.99)和FFPE肿瘤样本(相关范围0.67 - -0.99,平均0.90,平均0.94)。探针的珠阵列被过滤只包含CpG二核苷酸位于CpG岛,在已知基因的启动子区域(定义为−700 + 300 bp的转录启动网站)和排除在X和Y染色体,防止假阳性结果继发于性别差异(图1)。

一百三十八年论文认定129个基因被确定为差异甲基化,定义为拥有一个错误发现率(罗斯福)< 0.05增加了甲基化在初选EWS肿瘤,相比hMSCs(补充表)。为强烈hypermethylated基因丰富我们的数据集,我们进一步评估如果多个基因甲基化特征与密度β得分。发现的候选基因β分数从0.10到0.99在EWS原发肿瘤样本,EWS细胞系或hMSC主要细胞培养和细胞系受到重亚硫酸盐测序(补充图)。和样品β稀疏甲基化分数小于0.40,样品β分数超过0.9被高度甲基化。我们也观察到,EWS主要肿瘤常常表现出异质人口完全甲基化和unmethylated记录。我们假设这些结果是由于正常组织的肿瘤样本污染,DNA hemimethylation或异构克隆人口的主要肿瘤。鉴于这些结果,我们进一步过滤数据集,这样CpG探测器被定义为甲基化如果β得分大于0.9 EWS细胞系和大于0.5的主要肿瘤。在hMSC CpG被认为是unmethylated如果样品β分数低于0.4。这种分析策略取得了37的36个基因探针hypermethylated EWS大于30%的肿瘤细胞系和初级unmethylated hMSCs(如图2和表1)。

3.2。珠芯片结果的验证

广泛的珠芯片验证甲基化数据都使用传统的甲基化分析方法。作为一个例子,MSP引物设计CALCA,已被证明是一个基因甲基化在成人和小儿肿瘤(13,14]。CALCA是由珠阵列分析表明在大多数EWS hypermethylated主要肿瘤和EWS细胞系。MSP检测13日进行初级EWS肿瘤样本,和优秀的相关性观察珠芯片相比,甲基化β值(图3 (b))。只有肿瘤EWS8,这有一个值为0.48(低于0.5的截断值),显示差异MSP和珠芯片结果。EWS细胞系表明甲基化和unmethylated等位基因的存在,这可能代表的hemimethylationCALCA在细胞系基因或细胞间变异性。许多其他基因在类似的方式进行了分析和验证的准确性甲基化珠芯片阵列(补充图、S5和图5)。

3.3。表观遗传揭露揭示基因调节5-AZA EWS细胞治疗

为了识别基因epigenetically由DNA甲基化沉默,EWS细胞系培养5-AZA的存在,一种脱甲基的药物,抑制DNA甲基转移酶,5天,然后被允许恢复24小时(补充图)。最优浓度诱导甲基化基因的表达,减少非特异性毒性5-AZA实验定义为,导致表达增加2倍RASSF1A基因或CALCA在EWS细胞系(补充图)。5-AZA治疗三个EWS细胞系(A673 SK-ES-1和SK-N-MC)导致了1447年的鉴定,证明有2倍的484和391个基因表达增加与mock-treated细胞(补充图和表)。重要的是,一百六十二个基因显著诱导通过在所有三个细胞株5-AZA表明这些基因被DNA甲基化或自己epigenetically沉默,其次调制通过5-AZA响应基因表达它们。比较5-AZA-responsive基因的列表我们36个候选基因的甲基化分析显示19(53%)调节下游5-AZA至少在一个EWS细胞系(表处理1)。

3.4。原发肿瘤基因微阵列分析表明在EWS Epigenetically压抑

为了确定候选人也hypermethylated基因表达下调EWS hMSC或其他正常组织相比,我们分析了基因表达微阵列数据从一个独立的队列的32个原发性肿瘤,10 EWS细胞系,11个正常成人组织(各一式三份),和3主要hMSC文化。hypermethylated基因的相对表达水平比较在不同的细胞/组织类型。表达数据可供34 36个候选基因和绝大多数(34)29日显示差异表达在四个不同的细胞/组织类型(罗斯福< 0.05,图4)。值得注意的是,12基因的表达是专门表达下调()在初级EWS hMSCs(标有星号图4)和一半的(妳,COL1A1 CYP1B1,林恩,SERPINE1 VCAN)呈现出增加的趋势表现在至少一个EWS 5-AZA治疗后细胞线(表1)。亚硫酸氢两种基因的测序,林恩和CYP1B1,确认密度两个基因的启动子区域甲基化周围肿瘤珠芯片高甲基化分数和稀疏的甲基化在unmethylated肿瘤(图5)。定量rt - pcr分析5-AZA-treated EWS细胞系证明药物治疗后表达增加,支持假设这些基因epigenetically沉默EWS肿瘤(数字5(d)和5(h))。最后,尽管相对基因表达水平在初级EWS和EWS细胞株往往是相对于hMSC可比和正常组织,这并非总是如此(例如,妳,DDB2 CALCA, EPHA3,和RYK在图4)。这些发现符合我们观察到显著差异甲基化模式之间存在EWS肿瘤细胞株(图2)。

4所示。讨论

有相当多的证据表明,表观遗传机制参与EWS的发病机制。首先,EWS-Fli1融合蛋白,功能作为一个转录因子,上调的基因NKX2.2这被认为导致转录镇压EWS肿瘤框架通过招募辅阻遏物,通过组蛋白修饰蛋白质抑制转录(15,16]。第二,polycomb蛋白质BMI-1 EZH2 EWS中高度表达,基因的差别被认为是参与对这些涉及分化(17,18]。Polycomb阻遏蛋白质和许多因素相互作用,调节DNA甲基化和组蛋白修饰,他们似乎发挥重要作用在维护胚胎干细胞的未分化表型的基因通过转录镇压分化(19]。第三,发表研究已经证明敏感性EWS细胞系5-AZA和HDAC抑制剂(20.,21]。这些研究表明,表观遗传机制有助于EWS发病机理。

在这项研究中,EWS的甲基化模式主要肿瘤细胞系和hMSCs相比,这被认为是EWS起源的细胞,使用方法描述超过500个基因的甲基化模式。我们选择一个甲基化珠阵列平台,因为它在技术上是可靠的、需要少量的基因组DNA (100 ng),因为可以并行运行多个样本,从而使识别的基因通常hypermethylated EWS FFPE有限的肿瘤组织中是可用的22]。据我们所知,本研究是第一个nonbiased标识hypermethylated基因异常甲基化分析发表在评述。36个基因被发现hypermethylated面板的52 EWS肿瘤和unmethylated hMSCs。然而,曾有一些报道说,表明DNA甲基化就不会导致基因镇压[23- - - - - -25]。因此,我们也评估了甲基化的基因表达水平的基因在5-AZA -治疗EWS细胞系(表观遗传暴露实验)和原发性肿瘤和hMSCs的一个独立的群体。使用这种多方面的方法,我们能够成功地识别一个小群体的基因是由DNA甲基化在肿瘤EWS epigenetically沉默。这些基因参与许多通路与肿瘤抑制,生长信号网络、细胞分化、细胞凋亡、肿瘤侵犯,和其他必要的途径。特别是,我们确定了六个有趣的基因,保证额外的调查,以评估他们的潜在贡献EWS的发病机理。SERPINE1是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂,涉及一种蛋白激酶和JAK / STAT信号通路增长也已被证明是一个监管机构的细胞凋亡26]。Versican (VCAN)编码的细胞外蛋白多糖参与间充质上皮转变(27]。妳受体酪氨酸激酶参与PI3 K信号通路(28]。COL1A1编码一种胶原蛋白家族蛋白参与细胞外基质。这个基因已被证明是epigenetically监管在诱导多能干细胞(29日]。CYP1B1是细胞色素P450超家族的一员参与药物和毒素代谢的酶(30.]。林恩是Src酪氨酸激酶家族的一员,有趣的是,是一种已知的致癌基因,涉及EWS发病机理(31日]。EWS进一步研究这些基因的功能是保证了解表观遗传失调导致肿瘤的变化,促进EWS的恶性肿瘤。

一个有趣的观察在这个分析是一个重要的差异甲基化模式在初选EWS肿瘤和EWS细胞系。我们发现更多的甲基化事件EWS比原发性肿瘤细胞系(图2),已观察到以前在其他癌症(32]。调查这个观察,甲基化的变化RASSF1A基因,一个已知的肿瘤抑制基因特征。MSP和亚硫酸氢盐测序揭示致密启动子甲基化在2 3 EWS细胞系,但是RASSF1A基因主要是unmethylated(8 11%,每个珠芯片探针)EWS原发肿瘤(补充图吗)。这些结果和原田等人在2002年的一份报告中,没有说明RASSF1A基因甲基化在8 EWS肿瘤(33]。然而,我们的研究结果与最近的报告,Avigad et al。34]。这种差异的一个可能的解释是甲基化MSP引物用于调查所使用的地位大大Avigad等人所在的更远的下游转录起始站点(+ 220 + 300)相比,我们的MSP底漆和珠芯片分析(−76 + 96,+ 116,职责)。无论如何,这些发现表明,表征的甲基化模式于原发性肿瘤是至关重要的理解这种表观遗传机制如何影响EWS最好。

这项研究有一些局限性。首先,甲基化珠阵列分析每个基因只调查1 - 2 CpG二核苷酸,所以这可能是基因决定由珠甲基化芯片甲基化分析实际上并没有展示完整的启动子甲基化。其他全基因组的方法,如Methyl-CpG-binding域蛋白质测序(MBD-Seq),人口优先识别基因甲基化和可能是一个免费的方法为研究全球甲基化模式在EWS [35]。然而,我们发现高的基因亚硫酸氢甲基化分数相关密度与甲基化通过传统的测序分析,所以我们相信错误发现率会很低基于我们验证的研究发现基因甲基化的一个子集用珠芯片阵列(图5和补充图S2)。第二,FFPE原发肿瘤样品确实包含了一些正常组织。技术,如激光捕获显微解剖丰富肿瘤的数量在每个示例没有使用,因为需要至少100 ng的组织样本。激光捕获显微解剖限制数量的主要肿瘤研究由于缺乏组织的数量。第三,珠片甲基化分析只调查800个基因的甲基化状态和我们的过滤算法来减少误报,和性别偏见化验基因的数量减少到500。这有限的分析了一个全面的信号通路分析(如基因个体发生,智慧系统途径,京都基因和基因组的百科全书,等等)来识别潜在的治疗靶点。其他的全基因组甲基化等方法CpG岛放大(MCA)或全面的大规模阵列相对甲基化(魅力)有可能描述更多的基因组的甲基化资料,包括定义启动子区域以外的区域,如CpG海岸,它已被证明发挥重要作用在基因的表观遗传调控36]。然而,这些方法的局限性包括要求大量的高质量的基因组DNA (1 - 10μg),需要大量统计分析数组结果的支持,和高成本分析样品在这些阵列相比珠芯片阵列(24,37,38]。在未来的研究中,使用英飞纳姆甲基化450 K化验(Illumina公司,圣地亚哥,CA),负责调查> 485000 CpG甲基化状态的网站会解决其中的一些局限性。这些更全面的实验将允许更好地理解表观遗传变化,导致肿瘤的形成,还可能会导致治疗新靶点的识别。

总之,我们已经识别出基因异常hypermethylated ews和一群是原发肿瘤中表达下调。进一步研究这些基因的功能现在EWS的了解调节异常的DNA甲基化导致肿瘤的变化,促进EWS的恶性肿瘤。

确认

这个工作是通过赠款支持亚历克斯的柠檬水站基础,圣Baldrick基础,现代希望车轮上,阳光基金会美国肉瘤基金会(S.C.B)。提供了额外的支持(e .软件)r01-ca134604 SU2C-AACR-IRG1309和1。美国Borinstein以前由儿科血液学/肿瘤学训练2 t32ca009351格兰特。作者承认Joachim Deeg博士和达尔文Procktop hMSC小学文化,贝弗利Torok-Storb博士的收购HS-27a hMSC细胞系,蒂姆Triche博士细胞系微阵列数据,谢丽尔棺材和玫琳凯华盛顿的援助在检索和肿瘤病理评价、技术援助和珍妮弗•哈维。他们也感谢儿童肿瘤协会和洛杉矶儿童医院(CHLA)提供主要EWS肿瘤和CHLA基因组的RNA样本Affymetrix阵列的核心员工进行处理。这里介绍的一些实验进行了范德比尔特的创新转化研究共享资源支持的Vanderbilt-Ingram癌症中心和TJ马爹利基金会。

补充材料