文摘
虽然骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤在儿童和青少年,其细胞的起源和遗传改变尚不清楚。先前的研究已经表明,连续介绍hTERT SV40大标签,和h -转换人类间充质干细胞成两个截然不同的肉瘤细胞的数量,但他们并不会形成类骨质。在这项研究中,β连环蛋白被引入间充质干细胞已经包含hTERT和SV40大标记分析如果这导致模型更接近完成骨肉瘤。结果。不管诱导的水平β稳定转染子连环蛋白表达,没有显著差异引起的表型或入侵和迁移能力。或许更重要的是,他们都没有形成肿瘤,当注入小鼠免疫功能不全的。此外,生成的转化细胞可以诱导成骨的和chondrogenic分化而不是脂肪形成的分化。结论。β连环蛋白,虽然培养成骨分化,不诱发恶性特征由致癌和致瘤性转达了h -当引入部分改变了间充质干细胞。这可能影响的作用β连环蛋白在骨肉瘤的发病机理。它还可以表明脂肪形成早期分支点比正常的间叶细胞分化成骨和软骨形成。
1。介绍
骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤在儿童和年轻人1,2]。缺乏前驱病变结合骨肉瘤基因的复杂性限制了理解这种疾病的病因。显微镜下,骨肉瘤被定义为恶性梭形细胞肿瘤,产生类骨质。这个骨矩阵的存在导致了肿瘤的传统观点是源自于成骨细胞。然而,根据主要的类型的矩阵,组织学亚型的骨肉瘤包括chondroblastic,成纤维细胞的,成骨细胞的子类型定义(3,4]。这些组织学亚型的存在表明,肿瘤有multilineage细胞分化能力,表明原产地比一个多能成骨细胞(5]。到目前为止,相关的因素一个特定骨肉瘤组织学外观知之甚少。就会引起骨肉瘤细胞在成骨细胞的间充质干细胞(MSC)和来自各种细胞池中存在骨髓,生长板或骨膜(6]。识别来源的细胞和骨肉瘤的分子基础可能是重要的临床重要性7]。
极其复杂的Wnt通路编码高度保守的基因和分泌蛋白,调节细胞命运和细胞增殖在胚胎发育和致癌作用通过激活受体介导的信号通路8- - - - - -10]。最知名的和高度保守的规范化Wnt通路,Wnt触发受体激活的级联的存在导致GSK3胞内酶的失活和肿瘤抑制基因APC,关键因素促进降解的胞质池β连环蛋白,wnt信号通路的下游关键调解人,允许的易位β连环蛋白细胞核导致转录激活下游目标,其中许多涉及在胚胎发育和肿瘤形成。Wnt通路的激活β连环蛋白已被卷入的发病和进展越来越多的人类恶性肿瘤,包括结直肠癌,黑色素瘤,骨髓瘤,肺癌11- - - - - -13]。据报道,在骨肉瘤,有过度的众多Wnt组件(14,15以及表观遗传沉默的Wnt抑制因子1和卷曲的相关蛋白3 (16,17]。此外,β连环蛋白突变和高浓度的核β连环蛋白在骨肉瘤还指出,与肺转移相关(18- - - - - -21),突出Wnt -之间的潜在关联β连环蛋白信号在骨肉瘤的开发和发展。
为了更好地理解骨肉瘤基因的复杂性,我们的努力都是针对开发肿瘤骨肉瘤立在表型通过引入遗传元素定义为人类间充质干细胞(hMSCs)。最初,hMSCs被连环引入hTERT,转换SV40标签和h -前面描述了其他正常细胞类型的变换(22,23]。结果细胞致癌,能够产生肿瘤的老鼠,但组织学检查恶性梭形细胞肿瘤没有产生骨样的,因此他们没有骨肉瘤(23]。这是假设引入遗传改变诱导成骨分化可能导致所需的表型。基于上述的参与β连环蛋白在肿瘤发展和成骨分化,β连环蛋白被引入hMSC已经改变了hTERT和SV40标记。摘要创建这些细胞连同他们的鉴定报告,提供见解的潜在作用β连环蛋白在骨肉瘤的发病机理。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
hMSCs及其转化衍生品和hTERT转染SV40标签命名,MSC-TS,获得,生产,和培养如前所述23在MSC介质(Lonza Walkersville,医学博士,美国)在37 C′有限公司为5%2。细胞形态观察和图片拍摄使用尼康倒置显微镜ECLIPSE TE200连着一个电荷耦合装置冷却(美国诊断仪器,英镑的高度,MI)。HT1080、累积量和NIH 3 t3细胞从美国购买组织文化类型集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养按照他们的指示。
2.2。病毒转染,创建稳定转染细胞系和免疫印迹
全长cDNA克隆β连环蛋白在pCMV6-XL5向量构造从OriGene购买(罗克维尔市,医学博士,美国)。慢病毒质粒pLenti -β-catenin-blast被subcloning上述构造β连环蛋白进入克隆使用pLenti6.2 / V5-DEST网关向量工具包和ViralPower慢病毒表达系统(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。PLenti -β-catenin-blast是暂时性的转染到293英尺包装细胞系(表达载体、钙、美国)。病毒的股票在30小时收获,MSC-TS细胞感染6μg / mL聚凝胺融合时为50%。coculture 24小时后,药物的选择使用3执行感染细胞μg / mL杀稻瘟菌素。十个耐药殖民地拿起6周后,分别亚文化。的表达β通过免疫印迹15连环蛋白测定μg总蛋白β连环蛋白单克隆抗体,6 b3(细胞信号技术,贝弗利,妈,美国),根据制造商的指示。克隆的最高、最低和中间β连环蛋白水平选择进行进一步分析。
2.3。采用免疫分析
采用免疫染色的β连环蛋白在培养细胞进行了使用免疫荧光染色方法。细胞被镀和培养30 - 40%融合四级室幻灯片。细胞然后用PBS,固定在冰冷的甲醇为5分钟,水洗,permeabilized PBS 0.25% Triton x - 100,并再次清洗。正常血清特异性的网站被封锁,10% 1% BSA在PBS 1 h rt,细胞培养2 ug /毫升兔多克隆抗β连环蛋白抗体(美国微孔,Billerica的)或纯化免疫球蛋白为同形像一夜之间控制在4′。第二天,细胞被孵化1:250稀释的山羊anti-rabbit免疫球蛋白二次抗体共轭alexa - 488绿色荧光(美国纽约生活技术,大岛屿)为1 h rt,细胞被洗和延长黄金不变色复染色试剂与DAPI(生活技术,大岛,纽约)。疣是由蔡司可视化Axio观察者倒置显微镜放大63倍。
2.4。皮下和原位肿瘤发生学化验
Six-to-eight-week-old CB-17 SCID小鼠(美国泰康利,日耳曼敦,纽约)注射MSC-TS现在还转染β连环蛋白,名叫MSC-TSB,像前面描述的那样23]。并行皮下注射MSC-TS亚系的MSC-TS转染活性h和以前叫MSC-TSR6进行正面和负面的控制,分别。十二个老鼠用于每个细胞株,为肿瘤形成定期检查,所有实验都是按照协议执行机构批准的动物保健和使用委员会爱因斯坦医学院的。
2.5。运动性/迁移和入侵检测
运动性(随机迁移)测量了伤口愈合试验(如前所述)(23]。细胞无血清培养系统在媒体前一夜之间创造伤口。照片每12个小时到72小时在同一地区。抓痕的宽度在图像测量软件,和相对变化抓伤口宽度为0和12小时计算。迁移(钎性)是衡量使用Chemicon药物定量细胞迁移试验(美国微孔,Billerica的)。再次,细胞serum-starved前一夜之间被播种到Boyden腔。细胞迁移到外室于300年染色并提取μL(提取缓冲。吸光度在562纳米测量使用标仪(美国Bio-Rad大力神,CA)。
测量使用Chemicon入侵细胞入侵检测(美国微孔,Billerica的)。Serum-starved入侵的细胞被镀室8μ米孔隙大小聚碳酸酯膜,一层薄薄的细胞外基质(ECM)。入侵细胞迁移通过矩阵层结缘聚碳酸酯膜的底部,然后染色并提取。
2.6。分化分析
成骨、脂肪形成的和chondrogenic分化能力测量根据制造商的指示使用MSC骨生成工具,间充质脂肪生成工具,chondrogenic分化与转化生长因子(TGF -媒体β3)(Lonza Walkersville医学博士,美国),分别。在分化诱导培养基培养细胞4 - 8周。分化细胞与茜素红染色,油红O染色及免疫组织化学使用抗体II型胶原的胶原蛋白II型003 - 02(圣克鲁斯,圣克鲁斯、钙、美国),可染色钙、脂肪,和II型胶原蛋白,分别验证形成骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞,分别。软骨形成也执行使用StemPro软骨形成分化工具包(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和随后与阿尔新蓝染色(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)蛋白聚糖由软骨细胞。照片拍摄使用尼康倒置显微镜ECLIPSE TE200连着一个CCD(美国诊断仪器,英镑的高度,MI)。
2.7。统计分析
学生的测试是用来比较不同的意思。被认为是具有统计学意义。所有的数据进行了分析使用统计软件包(SPSS 20.0,芝加哥,美国)。
3所示。结果
3.1。代稳定转变人类的间充质干细胞系
稳定转换MSC-TS细胞系之前已经开发使用新霉素和嘌呤霉素作为选择标记(23]。β连环蛋白被引入MSC-TS细胞使用杀稻瘟菌素作为可选的标记。这个新的稳定转染MSC派生系被任命为代表hTERT MSC-TSB和T, S代表SV40标签,和B代表β分别连环蛋白。的水平β经免疫印迹(图连环蛋白表达1)。β连环蛋白表达在不同程度在转染后的十个克隆选择,也在某种程度上,在父母的细胞系,MSC, MSC-TS。克隆的最高水平β连环蛋白,MSC-TSB-H1 MSC-TSB-H2,最低或nullβ连环蛋白水平,MSC-TSB-L3 MSC-TSB-L7,中级,MSC-TSB-I9 MSC-TSB-I10,被选为进一步分析的影响β连环蛋白在他们的行为。
没有区分细胞定位的变化β连环蛋白(图2),形态学、增长率和增长模式之间的观察这些不同的殖民地。扩散率明显增加β连环蛋白转染,而MSC-TS人口倍增时间不到24小时。与MSC-TSR细胞系的行为一致,MSC-TSB细胞系还显示不灭与细胞增殖超出50通道文化。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.2。能动性和入侵
两种不同的活性测定:随机迁移到伤口愈合实验(图3(一个))和趋触性、细胞运动对固定化基质蛋白梯度Boyden室的测量系统(图3 (b))。在这些实验中,没有重大差异与不同的克隆β和父母MSC-TS连环蛋白水平值> 0.05,未予重视。
(一)
(b)
在测量细胞侵袭性到ECM,同样,MSC-TSB克隆克隆之间的不同并没有显示出多少变化β连环蛋白水平与程度的入侵与MSC-TS相似,值> 0.05。他们的入侵能力远远低于HT1080作为阳性对照。使用非侵入性细胞系3 t3 -控制(图4)。MSC-TSB-L3排除由于技术错误。
(一)
(b)
3.3。肿瘤的形成CB-17 SCID小鼠
在致瘤性试验,没有发现明显的肿瘤的任何MSC-TSB克隆小鼠皮下和orthotopic-injected植入后4 - 6周。作为一个积极的控制中,我们使用MSC-TSR6形成肿瘤7 8小鼠皮下注射,和4 4 orthotopically。父母的MSC-TS也没有形成肿瘤。
3.4。Multilineage分化能力的变化改变了hMSCs
成骨分化能力更快速MSC-TSB细胞系,再次独立β连环蛋白表达水平,如MSC-TS相比。强大的强度与茜素红染色可以检测到在媒体分化早在3周(图5)。通过引入β连环蛋白,细胞失去了能力去证明缺乏油红O染色后在媒体分化8周(图6)。chondrogenic差异化分析,一些MSC-TSB克隆被发现染色弱文化的胶原蛋白II型8周后chondrogenic感应媒体(图7),而他们被阿尔新蓝染色不利于蛋白多糖(数据没有显示)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
总之,β连环蛋白被成功引入MSC-TS细胞产生的细胞增殖和无限增殖,但没有明显的变化运动性或入侵,无法产生在免疫缺陷小鼠原位或异位肿瘤。另外这些细胞更快做过成骨分化,但是无法接受脂肪形成的分化。尽管这些实验并未产生骨肉瘤的实验模型,一些洞察的作用β连环蛋白在间充质干细胞分化可能推断。此外,一些影响可能存在MSC分化的中间阶段。
曾有一些报道说表明小鼠间充质干细胞可以转化成恶性表型在文化许多段落之后,由于自发突变,因此MSC可能是一个潜在的起源的肉瘤细胞(24- - - - - -26]。另外,我们之前的研究已经报道,由连续引入hTERT hMSCs的恶性转化,SV40标签,和h -生产高档梭形细胞肉瘤23]。这使得当前的研究可以确定一个骨肉瘤表型可能产生的引入β连环蛋白代替h MSC-TS细胞。一些克隆的结果显示较低的水平β比父母MSC-TS连环蛋白免疫印迹。在这种背景下,研究人员不清楚为什么这些克隆蛋白质含量较低;然而,可能的解释包括转译后的修改或负反馈调节β连环蛋白/ Tcf增加的途径β连环蛋白信号诱导Tcf-dependentβTrCP蛋白表达导致野生型的快速退化β连环蛋白(27]。的存在和后续使用多个克隆使随机事件,如插入突变的可能性。由此产生的细胞没有产生肿瘤在小鼠体内,这些努力没有成功生产一个骨肉瘤模型系统。创建一个模型系统旨在解决问题的细胞起源以及关键基因在骨肉瘤发展步骤。在这些实验中,它是不可能解决这些问题,未能产生骨肉瘤可能反映了再次hMSC作为起点的不当使用或不恰当的选择基因细胞转换。
使用的基本原理β连环蛋白将这些细胞已经被前面讨论但Wnt通路参与骨肉瘤发病机制和进展有些争议28]。大量研究表明Wnt通路的参与,包括彻底表达LRP5参与骨肉瘤疾病进展(16,18,19,29日,30.]。更具体地说,之前的研究表明,表达下调的Wnt通路使转染Dkk-3和显性负LRP5为骨肉瘤细胞显著减少入侵能力和细胞活性可能通过招募β连环蛋白促进信息的细胞表面粘附[20.]。这是由其他研究Wnt通路是由基因表达下调或毒品治疗方法在骨肉瘤细胞,因此观察入侵和活性的降低,与相关的临床观察作为一个抗肿瘤和antimetastasis效应(18,29日,31日,32]。此外,Wnt通路和增加核的激活β发现连环蛋白定位在大多数骨肉瘤,可能与转移(14,33]。这是一再犬骨肉瘤中非常类似于人类疾病(34]。有趣的是,另一方面,一群表现表达分析高档骨肉瘤、msc、同样的msc分化为成骨细胞,成骨细胞瘤和Wnt信号的差别表明,对这些基因的一个重要的角色在骨肉瘤发病机理35]。相同的组织还报道Wnt /的损失β连环蛋白在骨肉瘤细胞通过测量核通路活动β使用GSK3连环蛋白水平,β抑制剂(36]。尽管作者讨论了与其他报道的研究中,这些结果是矛盾的因素在发病机制和发展通常是不一样的。在这项研究中,使转染后βMSC-TS连环蛋白,克隆有不同β连环蛋白水平是故意选择检测的影响β连环蛋白在发病机理。未发现重大变化中克隆的表型和功能。此外,没有观察到小鼠肿瘤形成。这些发现支持观点的表达β连环蛋白本身并不参与骨肉瘤发病机制无论wnt信号通路的活性。频繁的β连环蛋白在骨肉瘤可能积累与大多数情况下变得临床上明显的阶段而非反射事件在发病早期(14]。另一种可能性可以生成一个模型与积极规范Wnt信号,例如,转染与LRP5/6持续活跃。额外的解释,需要考虑测试遗传操作和肿瘤特异性改变使用和测试不同的组件的复杂的信号通路,这些复杂的解释结果。作为一个例子,操纵Dkk-3可能是上下文相关的或可能产生一些影响独立的β连环蛋白或其他Wnt通路选择组件17,32]。
一个潜在的重要的观察是,在β连环蛋白转染MSC-TS细胞系,完整的multilineage分化能力的父母失去了msc。当MSC-TSBs诱导成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞通过各自的感应媒体,骨是青睐。没有去观察和软骨形成推迟了。这一发现也由先前的研究在LRP-5灭活突变,Wnt coreceptor与骨量减少,因此减少的成骨细胞分化,反之亦然(37- - - - - -40]。失去adipogenicity MSC-TSB细胞在诱导值得注意的是,因为骨肉瘤没有adipocytic亚型变异,而成骨细胞的chondroblastic,成纤维细胞的骨肉瘤亚型做出口3,4]。骨肉瘤可能因此源自这样一个差异化的msc的中间阶段。目前间充质干细胞的描述并不描述中间阶段分化的细胞已成为致力于限制的最后的血统。与造血作用,很可能的中间阶段分化存在。这些结果表明,脂肪生成可能是一个早期分支点间叶细胞分化。可以在正常的间充质干细胞分化的干细胞具有分化成chondrogenic和成骨的能力但不可能存在脂肪形成的血统。这个建议的警告,这些结果与转化细胞和可能不反映发生在正常的间充质干细胞分化。
总之,这项研究证明了的β连环蛋白MSC-TS细胞并没有导致细胞与肿瘤发生的属性。这表明,β连环蛋白在骨肉瘤发病机理可能没有作用;然而,这并不排除其可能参与骨肉瘤进展。一代的细胞能够分化成选择但并不是所有的间充质干细胞谱系表明中间阶段可能存在。进一步的研究将需要澄清的作用的其他组件wnt信号通路在骨肉瘤发病机理和发展。
缩写
| 硕士: | 间充质干细胞 |
| hMSC: | 人类间充质干细胞 |
| MSC-TS: | 人类间充质干细胞与hTERT转染SV40大T抗原 |
| MSC-TSB: | MSC-TS转染与β连环蛋白 |
| MSC-TSR6: | 一个MSC-TS亚系转染与激活h |
| ECM: | 细胞外基质。 |
利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者感谢爱因斯坦医学院的组织病理学核心设备和分析成像设备协助执行组织准备/解释和图片。这项工作是由美国游过Inc .和培育基础。