文摘

骨肉瘤是最常见的原发恶性肿瘤的骨在儿童,青少年和成年人。尽管广泛手术和辅助侵略性高剂量全身化疗可能严重的旁观者的副作用,治疗是在大约70%的患者局部疾病,只有20%的患者有-30%的转移性疾病。靶向治疗显然是必要的在改善我们的治疗青少年的杀手。然而,缺乏osteosarcoma-associated /特定标记阻碍了靶向治疗的发展。我们描述一个小说osteosarcoma-associated细胞表面抗原,ALCAM。然后,我们创建一个工程anti-ALCAM-hybrid聚合脂质体纳米颗粒immunoconjugate (-AL-HPLN)专门针对骨肉瘤细胞和细胞毒性化学治疗剂,阿霉素。我们已经表明,-AL-HPLNs大大增强细胞毒性,没有针对性HPLNs传统脂质体阿霉素配方。通过这种方式,-AL-HPLNs是一种很有前途的新战略,专门提供细胞毒性药物在骨肉瘤。

1。介绍

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤在儿童和青少年的特点是不受监管的原始osteoid-producing扩散间充质细胞(<一个href="#B1">1]。1970年之前,骨肉瘤患者的预后治疗手术仅是一个惨淡的整体存活率10% - -20%。尽管积极的手术将使大多数病人严重患肿瘤,绝大多数会在两年内逐步发展致命的转移性疾病。这表明他们最初的临床诊断的时候无法觉察的肿瘤已经扩散到其他器官的大多数病人,需要有效的系统性抗癌疗法(<一个href="#B2">2]。

新辅助细胞毒性化疗方案的发展在过去的三十年里已经有了极大的提高骨肉瘤患者的命运。的可替换主体方案+细化在手术切除导致65% - -75%患者的长期存活率呈现局部疾病(<一个href="#B3">3]。虽然这是一个重大的改进,目前的多峰性疗法仍然有重大的缺点。首先,前景依然贫困患者的放射学检测在诊断或转移的癌症反复出现。第二,尽管目前对骨肉瘤化疗方案是有效利用,他们还在正常细胞造成严重破坏,会导致严重的和潜在的威胁生命的并发症。现在也欣赏儿童癌症患者暴露在细胞毒性化疗会导致继发性恶性肿瘤和其他医学疾病,几十年后他们的肿瘤已经被根除<一个href="#B4">4]。

的长期目标能够优先提供抗癌治疗肿瘤的同时,仍能保留正常细胞可以产生重大影响当前骨肉瘤治疗方案的缺陷。在这方面,纳米粒子作为运载工具的使用似乎很有希望。脂质体,单膜囊泡由自然和/或合成脂质,是一个特别深入研究系统[<一个href="#B5">5]。容器的问题和控制释放抗癌药物脂质体药物输送一直是一个挑战。一方面,脂质体需要,以便制定有效的治疗药物和包装药品在正常细胞外环境的稳定控制。另一方面,脂质体有局部肿瘤需要能够释放载荷以有治疗效果。后一种属性一直特别困难的程序标准的脂质体配方(<一个href="#B6">6,<一个href="#B7">7]。

许多纳米抗癌靶向策略需要识别的标记表示表面的肿瘤细胞。特别是,肿瘤相关分子表达水平高于正常组织寻求,因为纳米颗粒涂有抗体识别这些标记可以优先与肿瘤细胞结合。终于从一个潜在的治疗提供的角度来看,最好是当候选肿瘤标志物内化受配体或蛋白质在细胞表面(<一个href="#B8">8]。利用这种交互,有针对性的纳米粒子可以提供治疗的有效载荷为肿瘤细胞通过受体介导的内吞作用。

记住这些标准,细胞表面受体激活白细胞粘附分子(ALCAM CD166)是一个有吸引力的候选人针对骨肉瘤。这糖蛋白是免疫球蛋白超家族的一员,认为调解重要信息交互参与细胞迁移、神经发生,造血和免疫反应<一个href="#B9">9]。最近,增加ALCAM表达与多种癌症,包括胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、大肠癌癌和黑色素瘤(<一个href="#B10">10- - - - - -<一个href="#B12">12]。此外,其他人发现immunoliposomes涂上重组anti-ALCAM单克隆抗体是由前列腺癌细胞系表达这种抗原(<一个href="#B13">13]。

在这篇文章中,我们证明ALCAM是过表达在骨肉瘤tumor-derived细胞系和初级活检标本。我们表明,该细胞表面分子可以利用增强绑定和纳米颗粒的骨肉瘤细胞。提出了一种新的聚合脂质体配方组成的脂质饱和和丁二炔的混合物含有酰基链,当负载阿霉素显示骨肉瘤细胞增强细胞毒性。最后,我们发现涂层这些混合脂质体与重组anti-ALCAM抗体进一步提高骨肉瘤细胞株的细胞毒性杀死。

2。方法

2.1。材料

常规和聚合脂质体纳米颗粒(pln和HPLNs)从NanoValent获得药品,Inc .(美国太勃兹曼)。组件由传统的L -脂质体卵磷脂氢化大豆(氢化大豆PC),胆固醇和1,2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -(甲氧基(聚乙二醇)-2000](m-PEG_2000年-DSPE),(两代情极性脂质、雪花石膏,美国)。(5′的pln由-hydroxy-3′-oxypentyl) 10-12-pentacosadiynamide (h-PEG₁-PCDA), (5′-sulfo-3′-oxypentyl) 10-12-pentacosadiynamide (sulfo-PEG₁-PCDA)、N -[(甲氧基聚乙二醇-750]10-12-pentacosadiynamide (m-PEG_750年-PCDA)和N -[(马来酰亚胺(聚乙二醇)-1500]10-12-pentacosadiynamide (mal-PEG_1500年-PCDA)(美国太NanoValent制药公司勃兹曼)和HPLNs h-PEG组成₁-PCDA,氢化大豆PC, m-PEG_2000年-DSPE 1 2-distearoyl -sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N -[马来酰亚胺(聚乙二醇)-2000](mal-PEG_2000年-DSPE)(两代情极性脂质、雪花石膏,美国),和胆固醇。

2.2。传统脂质体和HPLNs做准备

传统脂质体是准备从氢化大豆PC,胆固醇,和m-PEG_2000年-DSPE摩尔比例为57.5:37.5:5,nontargetable HPLNs h-PEG准备₁PCDA,氢化大豆PC,胆固醇,和m-PEG_2000年的摩尔比例-DSPE 15: 47: 32: 6,通道从h-PEG HPLNs准备₁PCDA,氢化大豆PC,胆固醇,mal-PEG_2000年-DSPE, m-PEG_2000年的摩尔比例-DSPE 15: 47: 32: 4.5: 1.5,从h-PEG pln准备₁-PCDA, m-PEG_750年-PCDA, sulfo-PEG₁-PCDA和mal-PEG_1500年-PCDA摩尔比例为65:25:5:5,根据前文所述的方法<一个href="#B14">14]。简单地说,脂质是混合和蒸发在真空中,一个电影。去离子水或300毫米硫酸铵添加到电影,给25毫米(总脂和胆固醇)。暂停被加热通过声波降解法70和80°C之间探头尖端超声发生器(费舍尔声波dismembrator型号300)5分钟。由此产生的解决方案是会通过一个堆叠聚碳酸酯膜(100海里),11次,有双重注射器挤出机(LiposoFast-Basic Avestin, Inc .,渥太华,加拿大),加热到65°C。近明显脂质体溶液冷却到5°C的12小时。变暖环境温度后,包含PCDA的水脂质体脂质被紫外线辐照聚合与Spectrolinker xl - 1000(254海里)紫外线交联剂(液体corp .) 10分钟。由此产生的蓝色pln和HPLNs加热到65°C 5分钟将它们转换为红色(荧光)的形式。彩色的注射器透过0.2解决方案μm醋酸纤维素过滤器,以消除痕迹不溶性污染物。

2.3。阿霉素加载

sulfate-containing常规和polymerizable铵(HPLN)脂质体通过了G50交联葡聚糖列(洗20毫米玫瑰)交换外部缓冲。与盐酸阿霉素脂质体被孵化(山东天宇精细化工有限公司)的浓度1μ3.2米的阿霉素μ米的脂质,同时为20分钟加热到65°C。未密封的阿霉素是被震动与阴离子交换树脂(70年Bio-Rex Bio-Rad Inc)的比7μ克阿霉素为1μL包装树脂,5分钟。脂质体被过滤分离树脂皮尔斯旋杯。的平均粒径测量得到Zetasizer Nano(莫尔文本月),在10毫米氯化钠溶液。

2.4。制备ALCAM-Antibody-Conjugated pln HPLNs

以前改造成一个cys-diabody anti-ALCAM抗体(cross-paired二聚体的单链抗体片段,c端半胱氨酸残基)所描述的(<一个href="#B19">19]。pln non-crossslinked, dox-loaded HPLNs,孵化与anti-ALCAM cys-diabody共轭粒子表面。TCEP(500毫米),添加到cys-diabody (1 - 4μ克/μL)解决方案最终10毫米的浓度和孵化在室温下30分钟减少diabody半胱氨酸残基的终端。减少-ALCAM cys-diabody被添加到混合脂质体(2.5 -10μ克/μL脂质)的diabody /脂质比1μg diabody: 7.5μg总脂质和孵化在室温下2小时,以便结合PLN或HPLNs马来酰亚胺残留。的马来酰亚胺残留熄灭了20毫米半胱氨酸溶液30分钟。释放diabody、免费的半胱氨酸和TCEP被使用过滤通过Amicon超100 K - 0.5毫升离心过滤器(微孔)。样本稀释1:2 HEPES-buffered盐水和离心机在6000转10分钟集中ALCAM diabody共轭样本。非交联型HPLNs专用dox-loaded antibody-conjugated净化后,被紫外线照射photopolymerized节中描述<一个href="#sec2.1">2.1。没有针对性的pln准备所控制淬火20毫米半胱氨酸的马来酰亚胺残留。

2.5。裹入脂质体阿霉素的量化

阿霉素是量化spectrophotometrically基于12500年的摩尔消光系数。未密封的阿霉素被使用Bio-Rex 70。Dox-loaded粒子中断使用稀释1:20和0.075盐酸异丙醇溶液然后涡至少30秒,以确保完整的膜破裂。吸光度是读贝克曼库尔特DU800分光光度计在480海里。

2.6。量化的总脂质

HPLN样本的总脂含量测定用比色测定。一个4μL整除HPLN样本真空干燥和resuspended ferrothiocyanate铵/氯仿溶液组成的氯化铁和0.1米和0.4米硫氰酸铵和200 ul氯仿。吸光度在有机相的488海里就在贝克曼库尔特DU800分光光度计测量。OD488样本比较的一个标准曲线已知的脂质浓度的值。

2.7。脂质体阿霉素的稳定控制

纳米粒子的能力(包括HPLN和传统脂质体配方)坚持裹入阿霉素测定使用postload时间课程学习。纳米粒子负载阿霉素使用前面描述的过程。加载后,几个纳米存储条件被改变来模拟细胞内的pH值中性环境和早期和晚期内体细胞隔间。纳米粒子被储存在pH值为4.5,6或7.4和4°C或温度37°C共有六种不同的储存条件。阿霉素在纳米粒子的浓度测定在0人力资源,0.5小时,4小时,24小时、48小时和144小时使用前面描述的方法。每次测量前,任何extraliposomal阿霉素是被孵化BioRex 70树脂(Bio-Rad, Inc .)。每个测量是规范化的时刻0测量各自的样本获得“percent-contained”阿霉素测量为了评估粒子的稳定性。方差分析使用日志转换数据和阻断实验一天被用于评估车辆的影响,pH值、温度对阿霉素泄漏,测试因素之间的交互,为几何平均褶皱构造95%置信区间的变化泄漏。

2.8。MTT试验

骨肉瘤细胞系许思义240年代,居屋或MNNG-HOS生长在杜尔贝科的鹰介质(HyClone猫没有修改。SH30022.01)与10%胎牛血清(双子座Bioproducts)。细胞被播种在96格式的浓度5×10³100细胞/在一个卷μL媒体与青霉素、链霉素和孵化过夜。第二天,井服用doxorubicin-loaded HPLNs目标,没有针对性HPLNs,传统脂质体,或免费阿霉素四小时一段然后用新鲜的媒体洗。剂量添加基于阿霉素浓度对数尺度范围从0.01到100μM和(0)纳米。0纳米是HEPES-buffered盐水处理。每个治疗进行了一式三份。细胞在标准孵化有限公司₂72小时37°C条件。在72小时,所有井处理10μL(噻唑基溴化四唑蓝(σ)解决方案的初始浓度为5μ克/μL在磷酸缓冲盐和孵化4小时。通过添加100反应是停止和细胞细胞溶解μL 15%的十二烷基硫酸钠/ 15毫米HCl溶液在室温下,一夜之间在黑暗中孵化。板吸光度是阅读使用Bio-Rad标在570海里。算术平均吸光度为背景,空白的OD570井从OD570读数减去所有的井。每个板的算术平均值计算,生存能力视为100%。剩下的井被除以这意味着获得名义生存能力在每一个百分比。生存能力对日志的药物浓度,绘制和使用未加权的非线性回归估计日志(IC50)为每个治疗使用的四个参数乙状结肠剂量反应模型(棱镜软件,GraphPad)。底部固定参数为零了剩余模式和更稳定的希尔斜率估计比分析允许一个变量。对于每一个细胞系实验,比较四个处理车辆运行在不同的日子重复3至7倍。在每个细胞株中,线性混合效应模型揭示日常变化作为一个更大的变异来源日志(IC50)比批可变性,并阻止实验治疗提高估计的精度差异。在评估IC50结果在细胞系,一个重要的细胞系,治疗交互检测,可以完全由建模转变传统脂质体占效力(相对于其他治疗3)只是在MNNG-HOS细胞系。

2.9。荧光显微镜测定PLN绑定

骨肉瘤细胞系被播种到4 Lab-Tek二室的幻灯片(热科学)在一夜之间达到80%融合。细胞治疗anti-ALCAM diabody共轭PLN 50岁μg / mL /。细胞培养4小时37°C。媒体被移除,井用1毫升新鲜的媒体。细胞用3.7%甲醛固定在磷酸缓冲盐15分钟在4°C。细胞被安装使用与DAPI VECTASHIELD安装介质(向量实验室)。积极的和消极的控制细胞系胰腺癌细胞系HPAF MiaPaca,分别。细胞被认为使用卡尔蔡司Axio成像仪D1荧光显微镜。细胞被认为在20 x放大。DAPI可视化通过蓝色和青色过滤器。结合纳米粒子是可视化使用罗丹明过滤器1秒曝光。

2.10。西方免疫印迹

用于免疫印迹是单克隆抗体鼠标anti-CD166(向量实验室,猫没有。VP-C375)的浓度1:400和anti-Actin C-11(圣克鲁斯生物技术,猫没有。sc - 1615)的浓度1:3000。

2.11。免疫组织化学

鉴定人类骨肉瘤患者石蜡包埋组织样本从加州大学洛杉矶分校获得采购核心实验室(IRB豁免)。Four-micrometer部分是削减并放入幻灯片。样本然后deparaffinized,水化,并受燥热引起抗原决定基检索。幻灯片是孵化1:50稀释anti-CD166鼠单克隆抗体(向量)在室温下2小时,和信号检测使用鼠标想象+ System-HRP (DAB)工具包(Dako)。部分与苏木精复染色。图像浏览,并获得使用蔡司AxioImager 20 x放大。

3所示。结果

3.1。ALCAM高度表达的原发性骨肉瘤标本和Tumor-Derived细胞系

骨肉瘤细胞系的分子调查U2-OS证明这些细胞表面表达ALCAM [<一个href="#B15">15]。这些观察促使人类骨肉瘤ALCAM表达的更深入的调查。评价ALCAM表达一组6 tumor-derived细胞系作为最初的平台。细胞溶解产物出产subconfluent附着生长在文化组织培养和免疫印迹分析了使用anti-ALCAM抗血清。胰腺癌细胞株(HPAF)和不高(MiaPaCa) ALCAM表达式被用作控制。所有6骨肉瘤细胞系表达ALCAM 5 6演示表达水平的升高HPAF控制(图<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig1/" target="_blank">1)。ALCAM表达的质量进一步证实荧光免疫组织化学显示主要是膜,表面组件ALCAM表达在骨肉瘤细胞株(图<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig2/" target="_blank">2)。

虽然是一个高频ALCAM表达的细胞系集合,总有一种担心,这可能是由于一个选择过程的内在创造tumor-derived细胞系。此外,不同的生长条件之间的骨肉瘤患者的体内和体外组织培养可以负责ALCAM表达的变化。

为了解决这些问题,人类骨肉瘤肿瘤样本从小学和转移性网站被免疫细胞化学ALCAM表达的化验。倾斜匿名病人标本固定、切片和孵化与anti-ALCAM抗血清。洗后,发现原位ALCAM表现使用光学显微镜的比色测定和评价。组织被分级为强阳性(+ + +),中度阳性(+ +),弱阳性(+)、负(−)。所有操作系统肿瘤样本染色ALCAM积极。10本地化和转移操作系统样本,5本地化操作系统的组织染色弱强阳性ALCAM和5转移操作系统的样本也有温和的强劲包含IHC染色。骨肉瘤细胞显示细胞质和膜ALCAM表达式(代表包含IHC图像如图<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig3/" target="_blank">3)。

3.2。Anti-ALCAM耦合聚合脂质体纳米颗粒贪婪地绑定到骨肉瘤细胞系

聚合脂质体和混合聚合脂质体纳米颗粒(pln和HPLNs)进行评估作为一个潜在的治疗运载工具可以针对骨肉瘤细胞表达ALCAM。pln HPLNs分享许多传统脂质体的结构属性。他们自组装单膜球体的表面可以修改使用相同的化学耦合策略用于脂质体。与脂质体、pln和HPLNs可以生产本质上荧光。紫外线照射会导致丁二炔残留在酰基链交联,导致高度蓝色颗粒,pln的热处理和HPLN囊泡导致变色和荧光团的形成<一个href="#B16">16,<一个href="#B17">17]。荧光发射光谱集中在635 nm广泛而复杂的激发光谱从480到580纳米。因此,pln和HPLNs转化成荧光的形式很容易追踪从它们绑定到目标细胞,直到沉积和分成亚细胞结构。

有针对性的pln和HPLNs是由化学耦合表面anti-ALCAM重组抗体片段。pln和HPLNs含有马来酰亚胺合成活性末端的表面聚乙二醇(PEG)的分子。一个二价anti-ALCAM diabody,来自先前描述scFv [<一个href="#B18">18),是基因工程包含c端半胱氨酸(<一个href="#B19">19]。结果cys-diabody二价、紧凑(三分之一大小的一个完整抗体),使面向特定站点的抗体变量的耦合区域表面的纳米颗粒(<一个href="#B20">20.]。混合这两个组件之间的缩合反应诱导硫醇的半胱氨酸和马来酰亚胺基,导致anti-ALCAM diabody共价耦合PLN或HPLN表面。作为一个消极的控制,没有针对性HPLNs准备没有马来酰亚胺脂质和非针对性pln免费半胱氨酸纳米粒子是由耦合。

绑定的研究进行比较的相对亲和力anti-ALCAM耦合pln (对骨肉瘤细胞株-AL-PLN)与非针对性pln。4小时孵化后,细胞被洗了,(-AL-PLN)绑定被荧光显微镜检测。 -AL-PLNs绑定到所有的骨肉瘤细胞系在我们的小组中,效率远远高于没有针对性-控制(图<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig4/" target="_blank">4)。这种交互依赖于细胞ALCAM表达式。目标和没有针对性pln绑定同样MiaPaCa细胞不表达细胞表面ALCAM。

来衡量之间的交互的速度-AL-PLNs和骨肉瘤细胞,每次课程进行学习。骨肉瘤细胞被孵化-AL-PLNs不同时间4小时,洗净,然后通过荧光显微镜评估。

-AL-PLNs绑定检测早在30分钟,4小时(图达到最大<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig5/" target="_blank">5)。拥有一个强大的细胞核周围的荧光信号表明目标纳米颗粒迅速内化成细胞的核内体舱。进行进一步评估,结合研究在4°C,从而抑制细胞的内吞作用。在这些条件下,一个强大的膜荧光信号检测没有细胞核周围的核本地化一致-AL-PLNs被绑定到细胞表面而不是内化(图<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig6/" target="_blank">6)。

3.3。混合pln制定函数作为潜在的治疗运载工具

我们最初的PLN配方是完全由10,12-pentacosadiynoic酸(PCDA)衍生品和聚合形成一个荧光粒子很容易被探测到。然而,这些纳米颗粒被证明是有问题的,当试图适应他们交付的疗法。尝试有效的加载与细胞毒性化疗药物,通过封装在囊泡的形成或在离子梯度使用prepolymerized脂质体,失败在多个水平。出于这个原因,混合创建pln PCDA脂质组成的混合与饱和磷脂中发现许多脂质体配方。

解决这个问题,我们开始与一个标准的脂质体配方组成的氢化大豆PC(主要成分是distearoylphosphatidylcholine (DSPC)),胆固醇,和聚乙烯glycol-distearoylphosphatidyl乙醇胺(m-PEG_2000年-DSPE)的摩尔比例为57.5:37.5:5。越来越多的不饱和PCDA脂质被补充说。我们选择短链挂钩PCDA导数,h-PEG₁-PCDA,因为它是一个极其反应交联脂质,具有良好的水分散性能,当混合脂质,本身并无电荷的所以它不会改变整个表面电荷,和小极性头不会干扰目标代理的接合。声波降解法和挤压后,囊泡进行评估的大小动态光散射和形成荧光颗粒的能力当接受紫外线照射和加热。隔夜后冷却至5°C,我们发现包含15摩尔% h-PEG₁-PCDA导致明亮的蓝色颗粒,但这种颜色变得与减少h-PEG逐步衰减₁-PCDA比例。

考虑到我们的HPLNs异构两种截然不同的脂质酰基链结构,稳定的解决方案是一个主要问题。某些混合配方形成不溶性聚合物挤出后数小时内。隔夜冷挤压后立即在5°C,但聚合之前,创建稳定HPLNs被证明是至关重要的。颗粒治疗这种方式稳定数周冷藏或在室温下。混合pln的脂质成分构造没有这个冷却的步骤被挽回的不稳定。

从这些研究中,一个优化HPLN h-PEG组成的配方是经验₁DSPC -PCDA,氢化大豆卵磷脂,胆固醇,和m-PEG_2000年的摩尔比例-DSPE 15: 47: 32: 6。使用这个配方,HPLNs是捏造的,他们能够积极与阿霉素通过加载代离子梯度评估(<一个href="#B21">21]。使用这种方法,可以加载到HPLNs阿霉素平均最终药物/脂质摩尔比为0.15(范围0.13 - -0.18)相比传统PEG-liposomes缺乏PCDA脂质可以加载到平均摩尔比率为0.44(范围0.35 - 0.49)。

容器的研究加载HPLNs和传统PEG-liposomes显示泄漏显著增加与时间(),以几何方式4小时,1天,6天,分别为0.9%,4.6%,3.1%,常规doxorubicin-loaded PEG-liposomes和1.2%,3.2%,5.9%,HPLN(图<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig7/" target="_blank">7)。脂质体车辆之间没有显著差异或pH值或温度的影响可以发现或1天4小时。然而,在6天在37度HPLN整体泄漏大于1.9倍阿霉素脂质体在4或37度(;95% C.I. 1.6——2.4倍)。此外,降低pH值从7.4到4.5增加了药物释放HPLN 1.5倍(;95% C.I. 1.1——2.1倍),证据表明,这种效应在37度增强而4度()。

3.4。没有针对性Doxorubicin-Loaded HPLNs比脂质体阿霉素制剂骨肉瘤细胞的细胞毒性

因为阿霉素是一种主要在当前治疗骨肉瘤,被选为我们的初始负载测试HPLNs能否作为治疗运载工具。HPLNs和传统脂质体是相同的水合过程制造的,脂质干电影通过简短的声波降解法其次是挤压100海里聚碳酸酯过滤器。HPLNs和脂质体的大小大约同一批次的变化从90年到110海里,一个典型的多分散性指数约为0.1。粒子都含有阿霉素使用硫酸铵梯度。剂量细胞之前,装载纳米颗粒被孵化短暂的阴离子交换树脂(70年BioRex BioRad Inc)清除任何nonencapsulated阿霉素(免费)。这确保细胞不暴露于免费的药物,可能泄露当粒子在存储。Nonconfluent骨肉瘤细胞系被孵化与不同浓度的4小时doxorubicin-loaded HPLNs或脂质体一式三份。细胞暴露于自由阿霉素(阿霉素)担任积极控制。剂量后,细胞被洗用新鲜的媒体和孵化72小时。MTT测定细胞生存能力被量化,50%抑制浓度(IC50s)估计。 For each osteosarcoma cell line, this experiment was performed 3–7 times using at least two different batches of HPLNs and liposomes.

每个阿霉素制备绝对IC50值根据骨肉瘤细胞系(图不同<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig8/" target="_blank">8)。然而,这一趋势反映出这些准备的相对效力测试所有的细胞系是相一致的。正如前面已经在其他细胞模型,免费阿霉素是大约38 - 82倍更有效比传统脂质体阿霉素(<一个href="#B22">22]。加载HPLNs没有目标(HPLN /阿霉素)显示中间力量大约6倍大于传统的聚乙二醇脂质体的制备。

后续实验确定增加的增长抑制由加载HPLN /阿霉素与PCDA脂质在这个配方。HPLN /阿霉素与减少PCDA捏造,加载,和孵化KHOS240S骨肉瘤细胞系。虽然这些变体HPLN /阿霉素制剂与阿霉素类似同样大小和加载,减少PCDA脂质成分导致纳米颗粒与降低生长抑制能力(数据没有显示)。

3.5。ALCAM目标增强的生长抑制作用Doxorubicin-Loaded pln

我们已经表明,耦合anti-ALCAM diabodies pln表面增加对骨肉瘤细胞株(图的亲和力<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig4/" target="_blank">4)。被发现使用这个相同的效果-AL-HPLNs(数据没有显示)。实验被执行来确定这个目标函数改进的能力doxorubicin-loaded HPLNs抑制骨肉瘤细胞株的生长。通道使用h-PEG HPLNs是捏造的₁-PCDA、氢化大豆卵磷脂、胆固醇、Mal-PEG_2000年-DSPE, m-PEG_2000年的摩尔比率-DSPE 15: 47: 32: 4.5: 1.5。马来酰亚胺的比例DSPE经验确定的最低数量,当耦合anti-ALCAM diabody会增强约束力的骨肉瘤细胞(数据未显示)。与阿霉素加载后,HPLNs耦合anti-ALCAM diabody之前-AL-HPLN /阿霉素。骨肉瘤细胞培养-AL-HPLN /阿霉素(如前所述)。

看到没有针对性混合动力车,绝对灵敏度-AL-HPLN /阿霉素在不同的骨肉瘤细胞株(表不同<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/tab1/" target="_blank">1)。然而,在所有情况下,目标HPLNs演示了额外增长的抑制效力没有针对性HPLN同行所有细胞系(图的约2倍<一个href="//www.newsama.com/journals/sarcoma/2012/126906/fig8/" target="_blank">8)。综上所述,-AL-HPLN /阿霉素有日志顺序(12)在细胞毒性增加传统没有针对性PEG-liposomal阿霉素配方在KHOS240s和居屋细胞系同时增加了23倍chemoresistant MNNG-HOS细胞系。这意味着-AL-HPLN /阿霉素可以专门结合细胞和交付阿霉素达到传统的非针对性脂质体纳米颗粒配方上有更大的细胞毒性。

4所示。讨论

我们的数据明显证明增加ALCAM表达在骨肉瘤的生物后果难以衡量。ALCAM仍未来的正常生理作用,但其分子结构和集群紧密连接表明它可能参与细胞粘附和迁移<一个href="#B23">23]。在这种背景下,人们很容易认为调制ALCAM表达式可以加强的侵袭性和转移性行为中发现高档骨肉瘤等恶性肿瘤。然而,并没有一致的相关性ALCAM表达水平并在所有癌症病人的存活率。例如,增加ALCAM表达式中发现高分期更激进的恶性黑色素瘤(<一个href="#B24">24]。相比之下,高ALCAM与低档不那么咄咄逼人的前列腺癌(<一个href="#B11">11]。考虑高频率的升高ALCAM表达甚至我们小的骨肉瘤,它可能无法区分高和低风险患者这种疾病。

虽然ALCAM可能有限在骨肉瘤预后的生物标志物,它有可能作为治疗目标这个肿瘤分子。荧光纳米颗粒涂anti-ALCAM diabodies优先结合骨肉瘤细胞株,即使是那些表达ALCAM在相对较低的水平。在前列腺癌细胞,ALCAM-targeted纳米颗粒迅速内化骨肉瘤细胞表明细胞内交付抗癌剂的策略。

使用含有脂类创建的丁二炔polymerizable电影和囊泡已经深入研究了用于创建生物传感器(<一个href="#B25">25),一直在探索癌症诊断和运载工具(<一个href="#B26">26]。当这些膜用紫外线照射治疗结果intralipid交叉连接形成一个强烈的蓝色的发色团。当暴露在生化的扰动,如热、剪切、或pH值压力,这些膜从蓝色nonfluorescent状态转变到一个红色荧光状态(<一个href="#B17">17]。HPLN荧光的明显的优势是,很少或根本没有发生光漂白。利用这些特性,我们可以跟踪绑定和内化的红色,荧光ALCAM-targeted pln (-AL-PLN),接受紫外线照射和热量。有趣的是,我们使用类似的制备获得相同的结果-AL-PLN只接受紫外线照射,因此在溶液中蓝色和nonfluorescent(数据没有显示)。看来之间的交互耦合diabody分子和细胞表面蛋白质ALCAM施加足够的压力来改变-AL-PLN荧光状态。

虽然泡完全由丁二炔含有脂质有良好的检测性能,他们能力有限治疗运载工具。我们无法稳定加载这些与阿霉素脂质体通过被动封装在囊泡的形成或积极在离子梯度形成囊泡。其他人已经能够被动加载混合组成的脂质体1:1磷脂酰胆碱衍生物的混合物dichain丁二炔脂和磷脂(<一个href="#B27">27]。然而,装载效率很低,这个策略可能局限于疏水的有效载荷。我们发现阿霉素等两亲性分子,在HPLNs单链,中性PCDA脂质polymerizable脂质浓度需要20摩尔百分数或少有效载荷发生(数据未显示)。

虽然我们HPLNs最初制定的药物加载特性稳定,他们也意外被证明是更多的治疗有效的体外测试。没有针对性的IC50浓度doxorubicin-loaded混合pln在三个独立的骨肉瘤tumor-derived细胞系至少6倍低于传统脂质体阿霉素聚乙二醇饱和磷脂组成。这增加力量似乎取决于PCDA脂质含量,因为它是逐渐失去了PCDA浓度滴定从15 - 20的最佳摩尔百分数(数据没有显示)。从这个角度,我们HPLNs PCDA脂质浓度越低,越高IC50成为骨肉瘤模型。最近,其他人使用的混合物丁二炔油脂和磷脂脂质体可以选择性地稳定通过光化学方法或热冲击(<一个href="#B28">28,<一个href="#B29">29日]。这里的目标是创建一个将释放其治疗车辆载荷时间空间控制的方式。

我们发现,即使没有应用外部不稳定的刺激,HPLNs可以更有效的治疗比标准脂质体配方运载工具。这种效应的机制尚不清楚,需要进一步调查。PCDA的存在在我们的混合配方可以在多个步骤产生了影响从(i)在体外测定纳米颗粒结合细胞(2)细胞吸收(3)细胞内释放细胞毒性的有效载荷。尤其是这最后一步可能速度限制。约50倍的差异之间的IC50自由阿霉素和传统脂质体阿霉素在我们的骨肉瘤细胞系在先前发表的模型是一致的发现系统(<一个href="#B22">22]。其他人已经表明,这主要是由于延迟发布的免费药物从细胞的内吞作用的隔间了脂质体阿霉素(<一个href="#B30">30.]。

在HPLN评价阿霉素药物控制的稳定性和传统PEG-liposomes表明有统计上显著的增加从HPLN阿霉素的释放。此外,这种增强药物释放是在酸性条件下强调模仿受体介导内吞作用的环境条件的核内体和溶酶体。人们很容易假设PCDA脂质可以增强阿霉素的释放已经被从HPLNs骨肉瘤细胞。鉴于其分子结构上的差异,很可能之间的显微偏析发生PCDA HPLNs表面的油脂和磷脂分子。证据发表研究发现具有相似混合物的长链丁二炔脂质和短链磷脂酰胆碱脂质表明之间的相分离发生脂质类型(<一个href="#B31">31日]。可能这些岛屿PCDA脂质可以作为不稳定点,可以提高药物释放暴露在细胞内环境。

创建一个osteosarcoma-targeted阿霉素加载HPLN (-AL-HPLN /阿霉素)在细胞毒性导致增加2倍的诸多HPLN /阿霉素和细胞毒性在传统的12倍PEG-liposomal居屋计划制定和KHOS240s骨肉瘤细胞系。这些结果表明ALCAM针对骨肉瘤中添加了一个增量的治疗效果。有趣的是,在MNNG-HOS细胞系-AL-HPLN /阿霉素有更大的提高在PEG-liposomal配方(23倍)的细胞毒性。MNNG-HOS细胞系具有较高的表达水平的耐药蛋白1(凋亡)授予化疗耐阿霉素(<一个href="#B32">32]。增加的敏感性的MNNG-HOS chemoresistant细胞系-AL-HPLN /阿霉素在传统配方配方指向可能克服多药耐药性的治疗效果。我们可以假设目标和改善持续药物释放特性-AL-HPLN /阿霉素配方可以绕过或压倒药物流出蛋白质调节药物抗性从而提高细胞毒性。

总之,我们发现小说表面标记在人类骨肉瘤,ALCAM,我们使用与小说专门针对骨肉瘤细胞工程药物混合PLN配方anti-ALCAM immunoconjugate。这些-AL-HPLN /阿霉素颗粒显示改善细胞毒性在传统没有针对性PEG-liposomal阿霉素配方和展示承诺作为一个潜在的治疗骨肉瘤的交付平台。这个新脂质体纳米颗粒配方是特别有吸引力的潜在的治疗应用耐药,耐火材料,转移性骨肉瘤,现有标准系统没有针对性化疗通常是不有效和预后是惨淡的。此外,旁观者和dose-limiting全身化疗的副作用是实质性的。到目前为止这个配方只有在基于组织培养的化验检测,所以进一步评估致瘤的动物模型是一个至关重要的下一步验证这些发现。这些实验正在进行。

确认

n博士Federman支持圣Baldrick职业发展奖和阻止癌症研究开发奖。c·t·丹尼博士和n Federman支持现代希望车轮上的资助。国家卫生研究院的基金提供的资金也U54 CA19367, P50 CA092131, P30 CA016042。j·伊博士由国家科学基金会支持SBIR第一阶段格兰特iip - 1143342。