文摘
不朽的肿瘤细胞系是癌症研究的一个重要模型系统,然而,误认和细胞株是一个常见问题的交叉污染。七脊索瘤细胞系在文献中报道,但没有详细的特点。我们分析基因表达模式和基因组拷贝数变化五个假定的脊索瘤细胞系(U-CH1 CCL3,亚兰,GB60 CM319)。我们还创建了一个新的脊索瘤细胞系,U-CH2,为细胞系提供了基因型进行身份确认。我们的分析显示,CCL3、亚兰和GB60不是脊索瘤细胞系,CM319是癌症细胞系可能来自脊索瘤,但缺乏关键脊索瘤生物标志物的表达。U-CH1 U-CH2都有基因表达谱,拷贝数畸变,形态一致的脊索瘤肿瘤。这些细胞系基因变化,如失去p16、MTAP,或者PTEN,让他们潜在的有用模型脊索瘤发病机制研究及评价靶向治疗。
1。介绍
摘要脊索瘤是罕见的、增长缓慢和局部侵袭性骨肿瘤被认为是来自notochordal残余。这些肿瘤的解剖分布反映脊索残骸的位置,发生最常见的两端的中轴骨在骶骨斜坡(32%和29%)(1]。手术是脊索瘤的主要管理和辐射是常用的作为辅助治疗(2]。复发是普遍的,十年存活率仅为39% (1]。现有的化疗通常是无效的,使得管理复发具有挑战性的3]。需要改善系统性疗法;然而,有限的知识分子遗传学的脊索瘤,小患者人群,缺乏临床前数据阻碍了开发新的治疗方法。只有两个系统性疗法的临床试验发表在脊索瘤;第二阶段研究9-nitro-camptothecin [4和第二阶段研究伊马替尼5]。由于病人的挑战从这个小病人,临床前数据可能需要特别支持证明事业未来的临床试验。
不灭的肿瘤细胞株是一项重要的癌症生物学研究工具,他们可能是有用的在预测癌症药物的临床表现(6,7]。特别是,细胞系窝藏某些药物靶点在分子定义癌症亚型已被证明有价值的评估靶向制剂。最近,分子功能,可以显示的应用靶向治疗已确定在脊索瘤,包括mTOR / PI3K / Akt通路的激活(8),激活IGF1R的信号级联(9),损失methylthioadenosine磷酸化酶(9),和激活STAT3 (10]。脊索瘤细胞系具有相似的分子表型可能有用的治疗方法在临床前评价,利用这些潜在的治疗靶点。
有几个脊索瘤细胞系中描述文学,但没有完全具有最先进的分子技术评估的脊索瘤模型的适用性。此外,这些细胞系从未独立验证来确认他们的身份。众所周知,交叉污染和误认的细胞系是分子癌症研究的一个普遍的问题16,17]。多达三分之一的细胞系来自不同的组织或甚至比声称[物种18- - - - - -20.]。鉴于稀缺资源用于研究少见肿瘤,如脊索瘤、无效的细胞系的使用可能是灾难性的。因此,描述和验证现有的脊索瘤细胞系的重视转化脊索瘤的研究。在本文中,我们报告我们的系统描述细胞系在文献中报道,声称自己是脊索瘤的起源和建立新的脊索瘤细胞系。
2。方法
2.1。细胞系检索和传播
MEDLINE寻找所有引用脊索瘤细胞系使用搜索词“脊索瘤细胞系,”“脊索瘤细胞培养、”和“脊索瘤和体外和每个生成的文章读来确定它是否描述或报道使用脊索瘤细胞系。这些出版物的相应的作者联系,每个样品的脊索瘤细胞系被请求,是否发表或未发表的。此外,其他未发表的脊索瘤细胞系被征求与会者的第一(2007)和第二(2008)国际脊索瘤讲习班和通过个人通信(JS)研究人员发表在脊索瘤和临床医生在医疗中心和一个高容量的脊索瘤病例。
一旦收到邮件,细胞融合在75厘米增长到90%2组织培养瓶和通道根据各自的出版物中描述的方法或传达的细胞系的创造者。文化媒体、血清和基质用于每个细胞株在表表示1。所有其他行种植和通过使用方法和媒体作为推荐的供应商。原始人类文化由中间通道MRC-5(美国类型组织培养)来自人类胚胎肺或NHF1礼物m . Cordeiro-S 'tone,来源于新生儿包皮。
2.2。建立新的细胞系
2.2.1。U-CH2
肿瘤组织来自于一位72岁的女性患者复发性骶骨脊索瘤。建立细胞系在肿瘤组织获得最初的手术没有新辅助治疗。患者知情同意。临床病理学决定表达的肿瘤EMA(克隆E29, Dako、斯特鲁普、丹麦)、波形蛋白(克隆VIM3B4, Dako)、细胞角蛋白(克隆AE1 + AE2, Dako),一个小程度上S100蛋白(多克隆,Dako)。增殖率由一个反- ki - 67抗体(克隆MIB-1, Dako) 5至10%。肿瘤是剁碎,部分与胶原酶消化,并放置在collagen-coated Primaria烧瓶(猎鹰,正欲、海德堡、德国)包含Iscove修改的基本介质/ RPMI 1640介质(4:1)(Lonza, Verviers,比利时)与10%胎牛血清(Biochrom AG),柏林,德国),2毫米谷氨酰胺,抗生素(青霉素G 100 U /毫升、链霉素100毫克/毫升)。一旦细胞达到融合,保持酶的分离使用胰蛋白酶/ EDTA (0.25% / 0.02%, Lonza)。细胞群与微分灵敏度胰蛋白酶/ EDTA分离后收集细胞不同的潜伏期。顺序分离trypsin-sensitive trypsin-insensitive细胞导致浓缩trypsin-insensitive physaliferous细胞的人口。三个通道,5个月后physaliferous细胞的比例达到一个稳定状态约30 - 40%的细胞。 Initially, U-CH2 had a doubling time of about four weeks; after 11 passages, the cells maintained a doubling time of approximately 1 week.
2.2.2。k - 001
肿瘤组织来自于一位男性患者复发性骶骨脊索瘤和培养如上所述。患者知情同意下一个IRB-approved研究提供。
2.3。脊索瘤组织采购
RNA从四个脊索瘤肿瘤样本是来自Ardais公司(列克星敦,MA)。病人是一个59岁的女人与当地骶骨肿瘤,当地骶骨肿瘤52岁的女人,一个48岁的男子与当地肿瘤涉及retrorectal组织,和一个76岁的老人转移到手臂。肿瘤细胞占70 - 90%的组织样本,没有坏死。
2.4。RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的一代
媒体从烧瓶吸气,细胞与PBS溶液洗两次原位,分离胰蛋白酶/ EDTA(σ目录T4049),和两PBS洗后收集细胞颗粒。总RNA从颗粒使用纯化试剂盒RNeasy迷你包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)和QIAshredder均质器根据制造商的指示。基因组DNA污染消除DNase消化在隔离列按照试剂盒的指示。RNA被筛选了ribonuclease-free水和立即冻结在−80°C。产量、浓度和纯度为260/280 nM吸光度比值决定在NanoDrop分光光度计(ThermoScientific沃尔瑟姆,MA)。的微阵列分析的RNA质量安捷伦2100生物分析仪,和只有样品RIN大于7。对RNA用于q-RT-PCR,证实了RNA的完整性的比率28 s和18 s RNA可视化紫外线照射下变性RNA分离后Tris-Borate-EDTA 1%琼脂糖凝胶。rna在50%甲酰胺变性,6%甲醛、10毫米磷酸钠(pH = 7.2),和0.5毫米EDTA孵化在65°C 5分钟,溴化乙锭的一个微克是添加到样品缓冲在装货前(21]。互补脱氧核糖核酸是来自1 - 2μ总RNA的g使用六聚体随机引物和上标三世第一链合成装备(表达载体,卡尔斯巴德,CA)按照制造商的指示。
2.5。DNA隔离
培养细胞分离和收集如上所述。细胞球立即冻结在−80摄氏度和加工后使用Flexigene DNA基因组DNA隔离隔离设备(试剂盒,瓦伦西亚,CA)按照制造商的指示。DNA的浓度、大小和完整性孤立经NanoDrop光谱学,溴化乙锭染色后,琼脂糖凝胶电泳。
2.6。公共数据检索
基因表达阵列数据来自36个不同类型的正常组织(入世GSE2361) [22)和四个样本iso-osmotically椎间盘细胞培养(入世GSE1648) [23]从NCBI基因表达综合下载(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)地理。表达阵列数据从96年间叶细胞恶性肿瘤(实验e - mexp - 353) [24欧洲生物信息学研究所)是下载ArrayExpress网站(http://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae/)。
2.7。基因表达分析
RNA标签和杜克微阵列杂交进行的核心设施如前所述[25)使用HG-U133A HG-U133 + 2.0 Affymetrix GeneChip平台,分享22277相同的探针集。所有数组都是背景调整,分位数规范化,抛光,中位数和日志2转换使用RMA表达[26,27]。HG-U133A HG-U133 + 2.0数组数据在两个不同的批次处理。RMA正常化后,表达式的值22277探针集共享两批次提取和合并成一个电子表格。为了弥补实验之间的平均信号强度的变化,所有数组值为中心为零和标准化(28]。评估每个基因差异表达探针设置使用一个双尾不平等的方差以及和绝对意味着脊索瘤组和彼此之间的差异。绝对差异> 2的手段被用作标准微分表达式。与多个基因差异表达探针,探针的均值设置值被用来代表整体基因表达。选中的记录存在与否决定使用MAS5算法(GeneChip操作软件,Affymetrix)。
无人监督的平均链接层次聚类是使用集群执行(29日)来确定一组样品之间的相似性的表达。两组检查;一套包含摘要脊索瘤肿瘤,假定的脊索瘤细胞系,与正常组织(包括试管),和第二组包含脊索瘤肿瘤,假定的脊索瘤细胞株,间质肿瘤。去除噪声引起的探针集具有相似表达所有样本,集群只有探针集上执行标准偏差大于0.7在样本集,导致2351年选择探针集第一组样本和1208探针集第二集。系统树图和热图可视化使用TreeView [29日]。
2.8。Q-RT-PCR mRNA表达和Q-PCR基因拷贝数
相对mRNA表达水平测定使用设计的引物甘油醛3′磷酸脱氢酶(GAPDH;NM_0002046)和3′的brachyury地区(T);使用底漆Express 3.0 NM_0003181)(应用生物系统公司,培育城市,CA)(见补充材料为网上的寡核苷酸序列doi: 10.1155 / 2010/630129)。定量进行一个ABI7900序列检测系统(应用生物系统公司)。引物验证了线性和比例放大使用U-CH1 cDNA作为brachyury积极控制表达式。基因拷贝数、Brachyury-specific引物和探针设计,用于定量(见补充材料)。RPPH1和叔VIC-labeled TaqMan探针用于输入DNA正常化(应用生物系统公司,# 4403326和# 4403316,resp)。在双工与Brachyury-specific引物PCR反应。所有样品都是用数量来表示一式四份。
2.9。物种的分析
物种起源的细胞系是由放大的部分醛缩酶基因(如前所述30.]。
2.10。免疫印迹
蛋白质提取的细胞是由刮冰成冷包含磷酸酶- PBS和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Gibbstown Calbiochem / EMD,新泽西,# 524624,# 539134,职责)。十二烷基硫酸钠添加到最终的浓度1%,并提取被孵化立即变性在沸水浴5分钟。样品粘度降低了声波降解法,确定每个样本的蛋白质浓度用BCA蛋白质化验(ThermoScientific沃尔瑟姆,MA)根据制造商的指示。5倍集中Laemmli聚丙烯酰胺凝胶电泳(页面)样品缓冲添加给最后一个1 x的浓度。蛋白质分离的页面,转移到聚乙二烯二氟化物膜,和阻塞tris-buffered盐水含有10%的奶粉。Brachyury,β细胞角蛋白,肌动蛋白PTEN、phospho-AKT和AKT检测使用商用抗体圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯,CA) # sc - 17743 # sc - 1616微孔(Billerica, MA), MAB1611,细胞信号(丹弗斯,MA) # 9559, # 9271, # 9272,分别使用标准的化学发光检测x射线胶片。
2.11。流式细胞术
脊索瘤细胞收获从烧瓶Trypsin-EDTA 0.05%,与PBS洗两次,resuspended 1%牛血清白蛋白(σ,猫# A7906,圣路易斯,密苏里州)在PBS。细胞被染色和藻红蛋白(PE)标记anti-CD24马伯(BD生物科学Pharmingen,猫# 555428,圣何塞,CA)和7-AAD (PN IM3422 beckman coulter,马赛,法国)30分钟在4°C。PE-labeled老鼠免疫球蛋白1(BD生物科学,猫# 349043)是用于消极控制染色。细胞与PBS洗两次,收购FACSCalibur机(BD生物科学)和分析使用CellQuest软件(BD生物科学)。生活(7-AAD-negative)肿瘤细胞CD24表达进行了分析。
2.12。免疫荧光
电镀后15毫米玻璃或thermanox盖玻片(纽约罗彻斯特热科学),U-CH1 U-CH2细胞治疗3.7%甲醛/磷酸缓冲盐(PBS)解决方案10分钟,冲洗和PBS短暂,然后用1% permeabilized诺乃清洁剂P40(丙烯酰胺Biochemika) / PBS 20分钟,然后有三个五分钟的PBS孵化项目。Brachyury检测顺序后一小时37°C孵化项目与anti-Brachyury抗体(圣克鲁斯,# SC17743)和antigoat Alexa 488二级抗体(英杰公司)与三个五分钟的室温PBS每个抗体孵育后耐洗。抗体稀释1:200年,1:1500年,分别。图像得到一个奥林巴斯IX51 DP70数码相机附件荧光显微镜。
2.13。STR基因分型
基因分型结果进行如前所述(凯利,2001)使用10 ng细胞系基因组DNA为模板的每个35周期PCR反应。遗传标记分析的八个STR标记(CSF1PO、D13S317 D16S539, D5S818, D7S820,多元非线性,TPOX,协力)。七个已知基因型的肿瘤细胞系和两个样本CEPH家庭1331作为控制。
2.14。阵列比较基因组杂交
3微克的DNA被AluI分散/ RsaI消化和标签由随机启动合并cy5-dUTP(试样)或cy3-dUTP参考DNA(男性)。测试样本和参考双结合在安捷伦杂交缓冲与安捷伦阻滞剂和Cot-1 DNA和杂化寡核苷酸微点阵全息40小时65°C(安捷伦)。对所有样本,使用安捷伦105 k芯片除了U-CH1 U-CH2,杂化到244 k微阵列。幻灯片是洗根据制造商的协议,和成像激光扫描仪(安捷伦)。图像处理与安捷伦特征提取软件和分段在Nexus软件(BioDiscovery)。阈值的日志2的比例。2、。6was used for gain or large gain, and −.2 and −1 were used for loss and large loss.
3所示。结果
3.1。收集现有的细胞系
我们确定了五个出版物描述七人脊索瘤细胞系(11- - - - - -15)(表2)。没有出版物描述非人类起源的脊索瘤细胞系被确定。三个细胞系由克里斯托弗·亨特(卡尔加里大学)14,15),但一行标记CCL2到达死亡,没有包含在任何分析。在这个研究的时候,只有一个所描述的三个细胞株Ricci-Vitiani et al。13)是由作者提供。一个细胞培养建立了杜克大学(K001)停止增长分析之前完成。细胞株生长在文化的图像如图所示1。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.2。基因和蛋白表达分析
,以确定哪些假定的脊索瘤细胞系来自脊索瘤组织,我们比较了全球细胞系的基因表达谱与四个主要脊索瘤肿瘤,一组九十六间质肿瘤(包括脊索瘤之四)24),36个正常组织类型(22),和四个主要短期培养椎间盘样本中央髓核(23]。试管是唯一成年的髓核组织来源于notochordal细胞,因此可能代表一个非肿瘤的模拟脊索瘤(21,31日]。RNA从一个细胞系,CCL3,并不与阵列杂交,因此,不包括在基因表达分析。层次聚类分析剩余的细胞系脊索瘤和正常组织(图2)表明,三种细胞系,U-CH1 U-CH2, K001,与八脊索瘤样本紧密聚集在一组不同细胞系GB60,亚兰,和cm - 319,良性的组织样本。的主要分支系统树图36正常non-mesenchymal组织分离获得来自通用电气等人脊索瘤,试管,和细胞系,暗示可能批效果。接下来,我们检查了脊索瘤的表达关系和样品间质肿瘤(32)(图3)。聚集在一起,远离所有的脊索瘤肿瘤间质肿瘤除了单个脊索瘤瘤,而非保密肉瘤样附近聚集。细胞系U-CH1、U-CH2 K001再次聚集接近其余七脊索瘤肿瘤样本。三个集群的脊索瘤肿瘤样本与U-CH1 U-CH2,从相同的数据集和K001其他间质肿瘤,从而使一批效应可能是唯一的解释观察到的集群。
五个明显差异表达基因在脊索瘤肿瘤与三个对照组(nonchordoma间质肿瘤,正常组织和试管):T, CD24, COL2A1, CA3, KRT19(补充材料)。分析了六个细胞系中,只有K001和U-CH2重要的所有五个基因的表达。U-CH1表示所有基因签名CA3除外。亚兰只有KRT19和CD24表达,但在水平低于U-CH2, 33 - 88倍。CM319只有CD24和表达,在很低的水平,COL2A1,只有低水平的CD24和COL2A1 GB60表达。额外的基因分化脊索瘤肿瘤从试管,正常,间质肿瘤单独但不是所有三个比较(补充材料)。例如,KRT15在脊索瘤差异表达与间质肿瘤和脊索瘤与试管,但不是脊索瘤和正常组织。能、CA12 RAB3B差异表达在脊索瘤和正常组织和间质肿瘤但不是试管。
确认Brachyury和CD24的表达细胞系,我们进行rt - pcr,免疫印迹污点,流式细胞术。Brachyury mRNA表达在U-CH1容易定量rt - pcr检测到。使用UCH1作为标准,Brachyury U-CH2低表达了10倍,在GB60低160倍,低于检测极限(少于16000倍低于U-CH1) CCL4B CM319。人类支气管上皮细胞样本作为一个控制和Brachyury RNA表达U-CH1低630倍。Brachyury蛋白质免疫印迹检测的U-CH1 U-CH2,但没有发现在CM319, CCL4B或GB60(图4(一))。U-CH1 Brachyury蛋白质表达水平高于U-CH2,符合mRNA表达这些线之间的差异的存在。免疫荧光定位的表达Brachyury U-CH1和U-CH2细胞核(图4 (b)),类似于亚细胞定位在初级脊索瘤肿瘤(24]。没有见过其他细胞系染色。二次抗体仅显示没有染色(数据未显示)。使用流式细胞仪,CD24蛋白表面检测三个细胞系,U-CH1, U-CH2,和cm - 319,但不是在CCL3 CCL4b或GB60(数据没有显示)。此外,细胞角蛋白表达临床使用以及其他免疫组织化学标记来确定组织起源的肿瘤。摘要脊索瘤是已知表达细胞角蛋白(33,34]。CM319 U-CH1,通过免疫印迹和U-CH2显示强大的细胞角蛋白表达,但没有检测到亚兰和GB60细胞表达(图4 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
PI3K通路的激活与脊索瘤发病机制和可能是一个潜在的治疗目标8,35]。我们检查了这个途径的关键调控蛋白的表达,PTEN在U-CH1 U-CH2。如预期基于U-CH1 PTEN基因损失,没有观察到(图PTEN蛋白的表达4 (d))。PTEN表达U-CH2附近,发现在正常的人类成纤维细胞(图4 (d))。异质性以前描述PTEN的表达一直在脊索瘤的肿瘤(汉族2009),我们观察到相应的下游phospho-Akt差异这两个细胞系(图4 (e))。
3.3。全息阵列分析
aCGH分析进行六个细胞系,以确定他们拷贝数变异(CNAs)一致,脊索瘤肿瘤(11,36]。细胞系CCL3没有杂交人类aCGH数组在两个独立的尝试并没有进一步CNAs的特点。未发现CNAs细胞系亚兰和GB60而U-CH1 UCH-2,和cm - 319有多个CNAs(补充材料),这表明只有U-CH1 U-CH2和cm - 319是来自肿瘤细胞。U-CH1和U-CH2显示biallelic CDKN2A损失和CDKN2B p21基因座9号染色体上(图5)。这也删除包含整个MTAP轨迹U-CH1和删除在U-CH2 MTAP轨迹附近。CNAs染色体区域内U-CH1和U-CH2使用经PCR扩增引物的5′和3′末端MTAP基因,和在CDKN2A DMRTA1基因(补充材料)。Rb 13号染色体位点和PTEN的轨迹U-CH1 10号染色体上有损失,但不是U-CH2(数据没有显示)。与这个结果一致,PTEN成绩单没有检测到基因表达微阵列在U-CH1,但出现在U-CH2和其他细胞系和肿瘤(补充材料)。没有发现染色体区域高层放大。U-CH1有很多CNAs损失染色体1,3,4,9,10,11日,13日,18日和22日,以及收益染色体1、7、9、14、15、17、18、19(补充材料)。U-CH2损失1 p, 2、3、4、8、10、14、16、17日,19日,20日和X;收益观察1、6、7、12、15、16、19日和X(补充材料)。
(一)
(b)
3.4。Brachyury拷贝数
我们最近描述Brachyury基因的拷贝数的增加,T在家庭倾向脊索瘤(37]。因此,我们进行定量PCR使用T基因外显子6探头细胞系U-CH1和U-CH2 aCGH发现有多个区域。aCGH CNA的地区RPPH1,这通常是用作控制qPCR;因此,我们使用叔控制,没有CNA aCGH。U-CH1显示qPCR相对价值1.11(范围:0.93 - 1.40)相比叔,这表明U-CH1没有额外的副本T基因,符合aCGH显示6问地区没有收获。U-CH2值1.36(范围:1.28 - 1.53),表明U-CH2有三个T的副本,这是符合aCGH显示获得的端粒的6月底q(补充材料)。
3.5。物种的分析
因为CCL3没有杂交与表达式或aCGH数组,我们认为它可能不是人类的起源。确定物种的起源,我们使用PCR扩增的片段醛缩酶基因,导致种特异的PCR产物长度(30.]。eb病毒转化成淋巴细胞基因组DNA样本CEPH家庭个人,CEPH 1331 - 01,被用作控制和生成预期的500年和300年英国石油碎片而CCL3和一只老鼠基因组DNA样本培养NIH-3T3老鼠细胞导致了相同的模式占主导地位的180个基点的片段和两个较大的微弱的乐队(图6)。所有其他细胞系样品给类似的扩增子作为CEPH 1331 - 01年的发现,从而确认人类的起源。180个基点片段的序列分析CCL3从老鼠证实它的起源。
3.6。基因分型
因为细胞系身份经常被混淆在实验室,我们进行了八个STR pcr标记CODIS面板所用的细胞系U-CH1, U-CH2, cm - 319(表3),以及亚兰和GB60(数据没有显示)。这些线的基因档案中没有写明ATCC STR基因型数据库的细胞系,表明它们不是来自共同的现有的细胞系。
4所示。讨论
基于我们的全面描述,只有一个五脊索瘤细胞系先前文献中描述分子,遗传,脊索瘤的典型形态特征。我们也报告创建一个新的细胞系,叫做U-CH2,展品chordoma-like特征。K001额外的细胞系,在一年多的培养和维护chordoma-like基因表达模式,但已经停止增长,不再可用。
一个假定的细胞系,CCL3,发现小鼠的来源。所有其他细胞系被证实是人类和基因型不同的常用细胞系中写明ATCC库表明他们可能是独立的。然而,无论是GB60还是亚兰基因改变典型的人类癌症,表明他们可能不灭的非恶性的细胞克隆。脊索瘤之至少,因为所有先前分析了全息阵列存在多个拷贝数异常(36),缺乏拷贝数畸变表明GB60和亚兰不太可能脊索瘤肿瘤细胞。可能这些细胞系来源于基质细胞参与他们培养的肿瘤。此外,只有U-CH1和U-CH2保持physaliferous细胞形态学的典型脊索瘤肿瘤。
层次聚类显示全球U-CH1的基因表达谱,U-CH2,和K001非常类似脊索瘤的肿瘤,而其余集群除了脊索瘤肿瘤细胞系。此外,我们确定了五个基因之间的明显差异表达脊索瘤和92其他间叶肿瘤,肿瘤36正常组织类型和椎间盘组织)。所有这五个基因高表达K001 U-CH2,四人U-CH1中高度表达,一个在CM319弱表达,没有表达GB60或亚兰。其中两个基因的蛋白质产物,T(Brachyury)和CD24 (HSA、热稳定的抗原),用作脊索瘤的诊断标记38),因此用生化方法。Brachyury发现蛋白质只有在U-CH1 U-CH2,尽管U-CH1 CD24蛋白检测,U-CH2, CM319。
基于这些观察结果,我们得出这样的结论:只有U-CH1和U-CH2忠实地保持形态、基因表达谱和基因改变脊索瘤肿瘤的特征。CM319 physaliferous不显示,不表达通常大多数基因表达的脊索瘤肿瘤;但是,它有异常基因符合作为一个癌症细胞系和CD24表达。因此,我们不能排除这种可能性确认这是来自脊索瘤细胞。可想而知,CM319来自一个肉瘤或非典型脊索瘤,或其基因表达变化显著的文化。另一方面,CD24表达神经细胞表面的子集的谱系分化(33),据报道在许多肿瘤类型(39),所以这个细胞株可能起源于脊索瘤以外的肿瘤,或可能成为污染的另一个癌症细胞系,并没有被写明ATCC基因分型。避免误认chordoma-like细胞系(U-CH1和U-CH2)在未来的出版物,我们建议细胞系的基因核查身份使用基因型信息报道。
我们发现三个细胞株在文献中报道,CCL3,亚兰,和GB60污染或建立了从nonchordoma细胞。亚兰和GB60可能确实是来自脊索瘤肿瘤中包含的细胞群,但很可能不是肿瘤脊索瘤细胞。使用这些细胞系已报道在一些出版物(10,13- - - - - -15,40]。我们的发现质疑的相关性结果生成使用这些脊索瘤细胞系。
因为脊索瘤细胞生长缓慢的(倍增时间> 5天),脊索瘤细胞培养可能特别容易被永生的基质细胞增生或污染快速增长的细胞系。因此,我们提出以下标准确定是否源自脊索瘤的细胞系。
4.1。形态
脊索瘤肿瘤形态组成的异质细胞,包括有液泡的physaliferous细胞,小星状细胞和其他细胞类型(35]。其他人已经报道,脊索瘤细胞培养反映类似的形态异质性程度,physaliferous细胞随时间变化的比例(41,42]。除了细胞系报道,我们试图文化五个其他脊索瘤肿瘤,随着时间的推移,在每种情况下,physaliferous细胞取而代之的是梭形或spindle-like细胞在文化最终停止增长。目前尚不清楚是否physaliferous细胞改变外观,还是梭状细胞群超越physaliferous细胞。此外,它是未知的细胞群(s)代表着肿瘤细胞肿瘤。Murad和同事们发现有丝分裂只在星状细胞群,并暗示星状细胞是主要的肿瘤细胞,可能分化成physaliferous细胞(43]。事实上,脊索瘤之肉瘤,更高的脊索瘤之比传统的有丝分裂活动,特点是缺乏physaliferous细胞(8]。U-CH1 U-CH2始终保持大约30% -50% physaliferous细胞。根据我们的观察和脊索瘤细胞的形态异质性在活的有机体内,我们不相信没有独自physaliferous细胞应该排除脊索瘤的细胞系被认为是起源;相反,physaliferous细胞的存在,脊索瘤的特征,应该是强阳性指标的脊索瘤细胞系被保存。
4.2。遗传学
比较基因组杂交(CGH)和脊索瘤之全息阵列分析证实,具有复杂的基因组,均匀拥有多个拷贝数变化和重组11,36]。因此,脊索瘤细胞系还应该将统一港多个基因改变,和细胞系没有或脊索瘤的起源的一些基因改变不太可能。细胞线预计将有类似的基因变化的原始脊索瘤肿瘤。与其他细胞系,假定的脊索瘤细胞株的独特身份可以由基因型决定,我们建议写明ATCC STR标记使用的面板。理想情况下,应该证明细胞系的基因型是一样的,谁的病人组织用于推导出直线。
4.3。基因和蛋白质表达
我们确定的5个基因明显在脊索瘤,Brachyury,转录因子在脊索细胞的细胞核(44),是最具体的脊索瘤(24]。通过免疫组织化学,Brachyury脊索瘤中高度表达,但不是在各种正常或肿瘤组织,因此,作为脊索瘤的诊断标记(24]。脊索瘤之以外,只有可以高度表达Brachyury [45,46]。然而,最近Palena和他的同事报道适度Brachyury表达癌和carcinoma-derived细胞系(47]。因此,Brachyury的存在本身并不足以表明一个脊索瘤细胞系的有效性。相反,一项研究发现,只有89%的摘要脊索瘤表达Brachyury [38),这表明缺乏Brachyury表达并不排除一个脊索瘤细胞系的有效性。此外,chondrocytic脊索瘤细胞的分化潜能之前已经报道过了,它已经表明,一些摘要脊索瘤进行分化,模仿髓核的发展(48]。我们的分析,Vujovic的工作和他的同事们24),表明Brachyury不是表现在髓核细胞是来自脊索[31日),这表明细胞notochordal原产地,脊索瘤,会失去Brachyury表达式。
细胞系,缺乏Brachyury但遗传学异常(如CM319),表达一个或多个标记的脊索瘤包括CD24、胶原蛋白II型α1,角蛋白19日和碳酸酐酶3 chordoma-derived细胞可以提供证据。如果材料从原始肿瘤可用,这些基因的表达应该对比肿瘤细胞系来确定在体外表达水平改变。聚类分析的全球基因表达可能需要进一步定义可能的起源non-Brachyury表达细胞系。
我们的研究也有一些局限性。首先,我们无法比较与他们的肿瘤细胞系。此外,我们无法运用原产地组织分析因为脊索瘤的正常组织被认为是衍生,脊索,不可用表达分析。然而,我们的聚类分析表明,细胞株U-CH1 U-CH2, K001可能共享相同的组织起源的。第二,所有现有的细胞株产生在骶骨脊索瘤之来自。事实上,大多数的生物分析骶骨脊索瘤的脊索瘤已经完成,现在是更大的肿瘤。因此,脊索瘤之未知是否出现在斜坡或其他领域可以建模骶骨脊索瘤细胞系的来源。
5。结论
总之,两个细胞系,U-CH1和U-CH2特征符合脊索瘤起源和脊索瘤的可供使用模型。一个或两个的这些细胞系分子性质模型特定的治疗靶点如p16删除(36),MTAP删除(9),PTEN失活(8,49],Brachyury基因复制(37]。发表使用另一个细胞系的研究结果可能不是人类脊索瘤相关。
确认
作者感谢罗伯特Pallini博士,Dianzhong Zhang博士和克里斯托弗·亨特博士提供细胞株,阿西夫·卡恩的技术援助,玛格丽特Adkins行政援助。赞助工作的退伍军人事务部和脊索瘤基金会。
补充材料
寡核苷酸的序列用于定量PCR和定量rt - PCR第一节所示。
第二节包含一个清单的基因表达微阵列数据集划分脊索瘤的肿瘤样本要么non-chordoma间质肿瘤,正常组织,或椎间盘。一些基因从一个以上的non-chordoma组脊索瘤之区分。
第三节以图形方式显示aCGH数据的每一个假定的脊索瘤细胞系的研究(亚兰、CM319 GB60, U-CH1, U-CH2)。绿色阴影或右侧内chordomosomal意符代表额外的副本而红色阴影内或在左边代表拷贝数的损失。亚兰和GB60基本上没有拷贝数畸变而CM319 U-CH1,和U-CH2有多个拷贝数畸变(虽然没有高收益),符合脊索瘤的起源。
第四节表明,PCR U-CH1和U-CH2的基因组DNA。缺乏扩增PCR产品确认删除p16的细胞系。
第五节列出数组PTEN的表达水平,波形蛋白和角蛋白8/19细胞系并选择脊索瘤肿瘤样本。微阵列数据分析与MAS5和得分(P)或缺席(A)和一定程度的表达式计算。所有四个探针集PTEN显示,U-CH1缺席的表达式,同时至少有两个起诉PTEN的表达在所有其他细胞系和肿瘤样本。单探头设置波形蛋白在所有芯片表示表达式包含在所有的细胞系和肿瘤样本。角蛋白8 - 19不定地存在取决于探针集但至少有一个在所有样本调查显示表达式。