文摘gydF4y2Ba

Tenosynovial骨巨细胞瘤是一种肿瘤疾病的关节,可以引起严重的发病率。复发是常见的局部治疗后,目前没有有效的药物治疗存在。最近的研究表明,所有病例中的巨噬细胞集落刺激因子过表达(CSF1),通常作为激活基因易位的结果,导致大量的巨噬细胞,形成大量的肿瘤。anti-CSF1新药开发;然而没有临床前模型适用于评价药物的好处在这个疾病。在本文中,我们描述一个小说肾被膜下的异种移植模型tenosynovial骨巨细胞瘤。使用这个模型,我们表明一个anti-CSF1单克隆抗体显著抑制宿主巨噬细胞渗透到这个肿瘤。该模型支持的临床试验的结果相当于人性化代理和anti-CSF1R小分子药物的tenosynovial骨巨细胞瘤耐火材料传统的局部治疗。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

Tenosynovial骨巨细胞瘤(TGCT)影响年轻人,和可能发生局部软组织肿瘤的滑膜衬里肌腱鞘(通常称为腱鞘巨细胞瘤)或衬里的滑膜关节,它通常被称为色素villonodular滑膜炎(PVNS) [gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。PVNS在本地是咄咄逼人,有能力入侵周围的软组织和骨骼,侵蚀关节软骨表面的关节,并最终通过二级关节炎的发展造成重大的发病率。PVNS的恶性进展是少见但发生(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。尽管总滑膜切除治疗,甚至与辅助放疗,PVNS复发率高(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

在大多数情况下的tenosynovial骨巨细胞瘤,一种特定疾病gydF4y2BaCOL6A3-CSF1gydF4y2Ba易位检测在不同族群的肿瘤细胞。存在高水平的CSF1表达式,招募大量的巨噬细胞肿瘤部位,似乎是一个一致的功能在所有形式的这种疾病gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。因此,异常CSF1信号在肿瘤发展和发展中扮演着一个关键的角色在PVNS / TGCT,因此这可能代表了理想指数疾病测试CSF1抑制剂的治疗价值。测试的价值这策略是直接的临床意义,因为目前缺乏有效的医疗治疗这种疾病。gydF4y2Ba

伊马替尼是抑制巨噬细胞集落刺激因子受体(CSF1R),在戏剧性的最近的一份报告就是明证,伊马替尼治疗导致一个完整的响应在一个案例中先进的复发PVNS [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。然而,后来的研究只有证明了稳定的疾病(凄凉的;个人沟通)。招募巨噬细胞肿瘤站点和监管功能的专业化通过CSF1促进增长和转移在很多肿瘤类型(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),因此代理阻止CSF1信号的发展成为一个活跃的研究重点(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。鉴于伊马替尼并不是一个特别强烈的CSF1R抑制剂(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),有可能是其他代理,包括新药临床实验的专门设计用于阻止CSF1信号,可能是更好的选择。gydF4y2Ba

迫在眉睫的问题在设计临床前研究PVNS / TGCT疗法是缺乏合适的实验模型。正如所料的病变gydF4y2Ba90%的肿瘤细胞宿主巨噬细胞,这种疾病不容易建模gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba当前,没有细胞系存在。此外,与大多数的肿瘤生长缓慢,标准皮下异种移植非常贫穷的利率。在这项研究中,我们建立一个新的模型PVNS / TGCT移植主要人类肿瘤样本点头SCID小鼠肾被膜下。然后我们开发一个分析招聘的宿主巨噬细胞植入人类肿瘤组织,允许我们测试的有效性伊马替尼和反人类的CSF1抗体阻止巨噬细胞招聘在这个模型系统。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。原发肿瘤组织和临床资料gydF4y2Ba

8例患者诊断为PVNS / TGCT需要手术切除在温哥华总医院答应了本实验研究。志愿者待遇按照加拿大Tri-Council政策声明涉及人类道德行为的研究,而这些研究综述和BC癌症机构研究伦理委员会批准。病人的年龄中位数为gydF4y2Ba年,从20到50年。对这些病人临床资料总结了表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

2.2。肾被膜下的异种移植gydF4y2Ba

约gydF4y2Ba新鲜肿瘤组织从每个病人,得到的碎片gydF4y2Ba被移植的肾脏囊下20 - 36 nonobese糖尿病老鼠/重度联合免疫缺陷(SCID点头)。这些方法详细描述了在以前发表的工作和有一个高速率的成功移植(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

动物保健和实验进行了按照指南的加拿大委员会批准的动物保健和动物保健的英属哥伦比亚大学的委员会。Meloxicam皮下注射手术前提供长期的缓解疼痛。动物体重和氯胺酮麻醉/甲苯噻嗪(gydF4y2Ba和gydF4y2Ba分别地,gydF4y2Ba体重,腹腔内注射)。Bupivacaine管理是在注射部位局部麻醉。一个切口约gydF4y2Ba皮肤是沿着中线的鼠标。动物躺在一边,一个小切口是在体壁的长轴长度略长于肾脏。肾脏被施加压力然后形象化的另一边用食指和拇指。体壁上的形象化的肾脏休息。一双细钳用于轻轻地捏把胶囊从肾脏的薄壁组织,2 - 4毫米的切口可以胶囊与细弹簧剪刀。创建了一个口袋和肾脏之间的钝性剥离软组织。不小心被破坏肾脏实质,从而防止出血。移植物被转移到肾脏的表面使用钝的手术刀。肾胶囊的切边解除与一双细钳和贪污是插入口袋下胶囊使用抛光玻璃吸管。嫁接过程完成后,肾脏是轻轻地缓解回腔; and the incision in body wall (muscle layers) was closed with 4–0 sutures; the edges of the back skin will be aligned and closed with the aid of suture. Buprenorphine was injected subcutaneously at 0.05–0.10 mg/kg (0.1 ml/25 g body weight) at the time mice show signs of recovery from anaesthesia.

2.3。实验设计gydF4y2Ba

两周后移植物植入,点头SCID小鼠随机分为治疗和控制。CSF1抗体治疗,鼠标反人类的CSF1单克隆抗体5 h4(写明ATCC入世HB10027),具体为人类二聚的CSF1与鼠标CSF1(而不是可交叉反应的gydF4y2Ba12gydF4y2Ba诺华生物医学研究所提供的),请研究(美国CA维尔)。5 h4抗体通过腹腔内注射接种10毫克/公斤,每星期一次。伊马替尼是购买从LC实验室(美国马沃本)和通过填喂法是100毫克/公斤,每天一次,在五个八的情况下足够的老鼠和组织提供这些额外的实验的手臂。在一个案例中,伊马替尼是在浓度为200毫克/公斤。水车辆(磷酸缓冲盐= PBS)被用来控制,由于腹腔内每周1次。两周的治疗后,所有老鼠都牺牲了gydF4y2Ba室;两个肾脏肿瘤移植被移除,固定gydF4y2Ba中性缓冲福尔马林,石蜡包埋,组织学,免疫化学和荧光原位杂交(FISH)研究。评估长期5 h4治疗效果,我们还完成了一个实验中使用7周治疗。gydF4y2Ba

2.4。石蜡的鱼gydF4y2Ba

荧光原位杂交(FISH)分析gydF4y2BaCSF1gydF4y2Ba基因中断使用分开进行杂交探针,使用相同的协议(如前所述)(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。为负的情况下,最少500核在原发肿瘤标本进行评估。gydF4y2Ba

2.5。组织病理学和免疫组织化学gydF4y2Ba

他走时染色病理评价使用标准协议的执行。免疫组织化学,抗原检索了0.1柠檬酸缓冲(pH值6.0)在一个蒸笼。内源性过氧化物酶活动受阻gydF4y2Ba过氧化氢和非特异性蛋白质绑定与血清蛋白阻塞块(Dako Carpenteria, CA)。老鼠antimouse巨噬细胞F4/80单克隆抗体(英杰公司集团,卡尔斯巴德,CA)是应用于1gydF4y2Ba50个稀释和孵化一夜之间gydF4y2Ba。生物素化的antirat二级抗体(Dako Carpenteria, CA) 1gydF4y2Ba300稀释用辣根标记peroxidase-conjugated链霉亲和素(向量实验室,伯林盖姆,CA)和可视化使用新星红色衬底工具包(向量实验室)。鼠标反人类的Ki67单克隆抗体SP6 (Dako Carpenteria, CA) 1gydF4y2Ba50稀释和人类巨噬细胞CD163 (Novocastra、纽卡斯尔、英国)1gydF4y2Ba应用100稀释使用M.O.M.工具包(向量实验室)根据制造商的建议。山羊多克隆反人类的CSF1 (GeneTex,欧文CA) 1gydF4y2Ba10稀释评估使用Vectastain精英ABC山羊工具包(向量实验室),民建联的发色体(Dako)申请gydF4y2Ba分钟在室温下。gydF4y2Ba

2.6。免疫组织化学评分和统计分析gydF4y2Ba

免疫组织化学染色结果为阳性细胞的百分比得分从中间部分的移植肿瘤区域,除了人类Ki67(得分的绝对计数阳性细胞核每高倍显微镜领域的异种移植组织)。因为一层薄的炎症通常存在作为外科植入肿瘤组织周围的反应,这外层被排除在得分F4/80等化验指标。所有评分工作是由一位病理学家蒙蔽所有药物治疗和样本标识符;码只有破碎的所有成绩都完成后,得分和数据分析是由独立的研究人员。小鼠巨噬细胞被F4/80染色鉴定,和宿主巨噬细胞渗透指数被定义为F4/80阳性细胞的数量,除以总数量的细胞在异种移植肿瘤的检查整个部分。结果表示为百分数,对应报告实验误差gydF4y2Ba置信区间的中位数。治疗效果比PBS控制的意义是评估在每个治疗组(5 h4与PBS和伊马替尼与PBS)使用成对Wilcoxon等级和测试。Foldchanges巨噬细胞浸润率报告总体上平均叠化所有老鼠在每个治疗组。gydF4y2Ba的意思是foldchange估计的置信区间bias-corrected加速引导计算使用1000复制gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。肾被膜下的异种移植模型着色Villonodular滑膜炎/ Tenosynovial骨巨细胞瘤gydF4y2Ba

所有情况下,tenosynovial骨巨细胞瘤异种移植植入点头SCID小鼠肾被膜下产生可行的人类肿瘤组织牺牲(有时从一到六个月)。肿瘤大小没有明显增长;细胞阳性人类Ki67的分数小于gydF4y2Ba,不受药物治疗。评估PVNS的代表性/ TGCT肾被膜下的异种移植,我们考察了收获并排移植组织和相应的原发肿瘤标本,比较histomorphological特性,gydF4y2BaCSF1gydF4y2Ba易位状态和CSF1蛋白表达模式。gydF4y2Ba

的gydF4y2BaCSF1gydF4y2Ba易位(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba)在只有三个可识别出8例标本招募在这项研究中,发现没有意想不到的考虑到gydF4y2BaCSF1gydF4y2Ba易位只能检测到gydF4y2Ba情况下,甚至在只有少数肿瘤细胞(约gydF4y2Ba)[gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。组织学检查所有检查PVNS / TGCT肿瘤移植非常类似于原发肿瘤同行(数字gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。然而,而混合CD163 +人力和F4/80 +小鼠巨噬细胞移植中植入两周后,由4周小鼠宿主F4/80 +巨噬细胞已经取代了大部分的人类巨噬细胞和合胞体巨细胞很少。CSF1表达表现出整体扩散模式在肿瘤移植和原发肿瘤组织(图gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba),非常类似于[描述的CSF1表达式模式之前gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。肿瘤是稳定的寿命点头/ SCID主机(6个月),但不能通过积累到新一代。gydF4y2Ba

3.2。一个Anti-CSF1单克隆抗体显著减少宿主巨噬细胞浸润到PVNS / TGCT异种移植gydF4y2Ba

众所周知,人类CSF1 crossreact和刺激小鼠巨噬细胞(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。5 h4是人类CSF1鼠单克隆抗体中和。在短期gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba文化主要PVNS肿瘤组织5 h4没有任何细胞毒性的影响(数据没有显示)。当由小鼠腹腔途径轴承PVNS异种移植,5 h4明显阻止小鼠肿瘤宿主巨噬细胞招聘网站(数据gydF4y2Ba1 (e)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (f)gydF4y2Ba)。系列5 h4对异种移植的影响来自8个病人个体如图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba相比,PBS和伊马替尼。治疗组得分的病理学家蒙蔽,5 h4的巨噬细胞浸润减少所有病例在治疗2周的实验中,平均2.7倍相比,车辆控制(PBS) (gydF4y2Ba置信区间2.3 - -3.0)。在一个实验中,治疗持续7周,宿主巨噬细胞之间的细胞在异种移植的一部分gydF4y2Ba(gydF4y2BaCI 53% - -67%) PBS的手臂相比gydF4y2Ba在5 h4臂(gydF4y2BaCI 24% - -36%)。gydF4y2Ba

3.3。伊马替尼块巨噬细胞浸润程度低于5 h4在这个肾包膜下移植模型gydF4y2Ba

因为伊马替尼函数作为CSF1R抑制剂(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba)和高效在PVNS临床病例报告gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),我们使用它作为一个比较控制在本研究足够数量的xenograft-bearing老鼠。我们测试了5个病人的组织在100毫克/公斤/天伊马替尼,一剂有效地抑制转移报道乳腺癌异种移植模型(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba)和一个200毫克/公斤/天(在短期治疗剂量过大gydF4y2Ba15gydF4y2Ba])。在所有六个实验,伊马替尼宿主巨噬细胞浸润降低了1.1倍,相对于PBS控制(95%置信区间1.0 - -1.3),一个并不显著(图效果gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。相对于5 h4,伊马替尼表现出较小的影响减少巨噬细胞的招募这些剂量在这个模型系统。伊马替尼没有显著影响人类Ki67-positive细胞的数量相对于控制(数据未显示)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

移植人类原发性肿瘤在点头SCID小鼠肾被膜下最近开发了异种移植模型的建立方法。相对于低移植率与皮下植入积极的癌(通常20 - 40%)(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba),肾被膜下的植入显示肿瘤采取率高(可能是由于其高组织灌注环境),尤其便于建立模型低级,生长缓慢的肿瘤(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在我们PVNS模型,估计移植非常明显,显微镜下确认可行的肿瘤组织是超过95%。收获移植保持特征的原始肿瘤对肿瘤形态、gydF4y2BaCSF1gydF4y2Ba易位状态、CSF1和巨噬细胞CD163表达,这第一个PVNS模型实际应用的临床治疗的调查。尽管植入肿瘤没有明显增长的净尺寸,我们可以评估F4/80 +主机小鼠巨噬细胞的浸润。在实验中使用其他类型的肿瘤,不产生CSF1(滑膜肉瘤、透明细胞肉瘤和黏液样脂肪肉瘤),没有看到主机F4/80 +巨噬细胞浸润(Cheng和尼尔森,未发表的观察),支持他们在PVNS异种移植确实发生由于肿瘤植入CSF1表达式而不是作为一个反应过程。该模型可用于测试的影响新一代的药物制剂设计阻止CSF1-recruited巨噬细胞浸润。gydF4y2Ba

Tumor-derived CSF1超表达是一种常见的发现在许多类型的人类肿瘤(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。与公认的角色在刺激巨噬细胞生存、增殖和分化(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba],CSF1似乎直接巨噬细胞采用M2表型(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。这巨噬细胞亚型参与免疫调节、伤口愈合、肿瘤,其次在晋升,而不是主动吞噬antipathogen免疫反应。瘤内巨噬细胞浸润在许多肿瘤类型的临床与实验研究,与肿瘤预后差,例如,在癌症乳腺癌、前列腺癌、卵巢和平滑肌gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。肿瘤相关巨噬细胞的机制被认为在支持血管生成,促进肿瘤的生长包括角色的分泌肿瘤生长因子,抑制免疫监视作用,增强肿瘤转移(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。因此越来越多的证据表明CSF1信号潜在的重要作用在癌症生物学,和许多anti-CSF1方法正在发展。例如,CSF1抗体、反义寡核苷酸gydF4y2BaCSF1gydF4y2Ba小干扰RNA策略都证明在其他疾病和肿瘤抑制功能不同程度模型系统(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

自从CSF1-activating translocation-driven巨噬细胞招聘PVNS的病理生理学基础gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),这个肿瘤有可能代表一个索引疾病模型来评估anti-CSF1治疗的价值。在研究中,我们测试了5个h4的影响,小鼠单克隆反人类的CSF1-neutralizing抗体,它能够抑制巨噬细胞招聘在我们PVNS异种移植模型。基于anti-CSF1受体活性的伊马替尼(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)和最近的出版物显示伊马替尼治疗效果在一个PVNS的情况(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),我们选择伊马替尼作为一个积极的控制实验。相对于5 h4,伊马替尼表现出较小的巨噬细胞的封锁效应在动物模型使用的剂量(100和200毫克/公斤)。目标在这个模型中系统主机鼠CSF1R,而不是人类CSF1R,导致伊马替尼的好处的低估;不过值得注意的是,最近的研究证明,伊马替尼是否抑制小鼠的磷酸化CSF1R [gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

本研究介绍和描述PVNS模型适合anti-CSF1治疗研究。我们能够证明anti-CSF1治疗阻止巨噬细胞招聘、支持他们的潜在价值作为治疗代理商在当地积极疾病的关节没有建立,有效的药物治疗目前尚不存在。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

5 h4:gydF4y2Ba	小鼠反人类的CSF1单克隆抗体克隆5 h4gydF4y2Ba
CSF1:gydF4y2Ba	巨噬细胞集落刺激因子gydF4y2Ba
鱼:gydF4y2Ba	荧光原位杂交gydF4y2Ba
SCID点头:gydF4y2Ba	Nonobese糖尿病严重联合免疫缺陷gydF4y2Ba
PVNS:gydF4y2Ba	色素villonodular滑膜炎gydF4y2Ba
TGCT:gydF4y2Ba	Tenosynovial骨巨细胞瘤。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

世贸组织尼尔森的高级学者迈克尔·史密斯卫生研究的基础。这项工作,使用试点启动资金从美国肉瘤基金会,由操作拨款支持癌症研究社会。作者感谢塞缪尔·梁和尼尔·波林协助数据分析和手稿准备和罗伯特b .西方和凯利蒙哥马利(斯坦福大学)建议CSF1免疫组织化学。他们报告在这项研究的结果没有经济利益。gydF4y2Ba