文摘
恶性周边神经鞘肿瘤(对于)是高度恶性和耐药。转换可能暗示调节表皮生长因子受体(EGFR)。52对于样本研究表皮生长因子受体,ki - 67, p53,通过免疫组织化学和生存素的表达表皮生长因子受体通过原位杂交放大。结果与临床相关数据。表皮生长因子受体RNA也量化了rt - pcr在20其他对于和14皮肤纤维瘤。一半的患者神经纤维瘤病1型(NF1)。EGFR表达,检测到对于的86%,在NF1标本更频繁,与高档和p53-positive领域密切相关。对于表达更多的表皮生长因子受体比纤维瘤成绩单。不放大表皮生长因子受体观察轨迹。NF1地位是唯一预后因子在多变量分析中,与18 - 43个月患者的中位生存有或没有NF1。最后,EGFR可能成为对于治疗的新目标,尤其是在NF1-associated对于。
1。介绍
恶性周边神经鞘肿瘤(对于)许旺细胞高度侵略性的肿瘤,常致命的,通常对常规放疗和化疗(1,2]。
将近一半的这些肿瘤的上下文中出现的遗传易感性综合症、神经纤维瘤病1型(NF1),暗示的失活NF1肿瘤抑制基因可能有因果联系这些癌症的发展(3]。NF1是一个主要继承了人类疾病影响到2500年的3500人(4]。NF1的特点是牛奶咖啡斑(平色素皮肤损伤),丽斯结节(iris)异常,骨骼异常,学习障碍,纤维瘤,患恶性肿瘤的风险增加中枢和周围神经系统5]。NF1与肿瘤抑制基因的突变有关NF1,这对于Ras-GTPase-activating蛋白质编码neurofibromin [6- - - - - -8]。
分子事件导致周围神经肿瘤发展尚不清楚。失去neurofibromin NF1的上下文中,NF1蛋白产品,被认为是最早的事件,作为突变患者继承NF1等位基因和失去第二个副本对于细胞。失去两个副本也观察到在良性纤维瘤。肿瘤抑制基因突变很可能仅是不够的,放松管制和/或突变的癌基因诱导雪旺细胞的恶性转化是必要的。超表达或突变的肿瘤抑制基因TP53观察到对于支持p53的观念改变扮演一个角色在他们的发展9]。几项研究已经证明了核心作用的表皮生长因子受体(EGFR)在雪旺细胞的恶性转化10- - - - - -13]。据我们所知,只有12例人对于已经通过免疫组织化学方法研究了表皮生长因子受体(10,13]。在目前的研究中,我们分析了52的表皮生长因子受体在肿瘤中的表达对于患者,并与NF1状态和生存。
2。材料和方法
2.1。病人和样品
病人的主要系列()都在古斯塔夫Roussy研究所(IGR、瑟、法国)在1985年和2005年之间。综述了临床记录由我们中的一个(r . Bahleda),特别注意初始定位、NF1状态、治疗和生存。诊断NF1成立根据美国国立卫生研究院标准(14]。大部分的病人做了手术在另一个中心和二级IGR引用。肿瘤被认为是当地阶段,当R0行手术最初,R1和R2手术的局部晚期阶段。只有例石蜡包埋对于样本包括在这项研究。组织学检查发现了所有包括患者至少两个病理学家(PT、MJTL JFE) hematoxylin-eosin彩色幻灯片。根据世卫组织标准的诊断对于执行(15]。没有执行分级的肿瘤,由于数量有限的石蜡包埋标本。S100蛋白免疫染色(美国加州兔多克隆,Dako, Carpenteria)和工具(兔多克隆,Dako)必要时进行确认诊断。
所有52石蜡包埋标本受到免疫组织化学;其中8 / CISH也分析了鱼。
冷冻样本其他20个患者对于被用于RNA分析。十六岁来自先前发表的系列(16)和四个从莱昂-中心(法国里昂)。冷冻控制样本14良性皮肤纤维瘤患者也进行了分析。
所有样品都获得手术进行诊断和/或治疗的目的,并根据法国道德规定使用。
2.2。免疫组织化学
免疫组织化学进行从石蜡包埋肿瘤样本,4微米部分抗原检索后加热在10毫米柠檬酸缓冲pH6 20分钟。鼠单克隆anti-EGFR(31日七国集团(g7)、酶、南旧金山,加州,美国最终稀释1/10),P53 (7、Novocastra纽卡斯尔,英国最终稀释1/50),和反- ki - 67 (Mib1 Dako,最终稀释1/50),染色显示了LSAB工具包(Dako)。anti-Survivin (12 c4, Dako最终稀释1/100)染色法显示了CSAII (Dako),根据制造商的指示。
EGFR染色,肿瘤细胞被认为是消极的,积极的信号检测时对nontumour细胞(通常是梭形细胞和/或小神经肿瘤的边缘);否则,染色被视为不解释。
2.3。荧光原位杂交(FISH)
八石蜡包埋标本的表皮生长因子受体的主要系列分析了放大。EGFR特定序列探针(LSI表皮生长因子受体)和控制染色体枚举探针7 (CEP7)使用根据制造商的推荐协议(Vysis-Abbott分子诊断、巴尔、瑞士),但在一些小的修改。DNA探针和部分组织变性5分钟使用HYBrite乐器。之前洗的额外添加蒸馏水对比染色和安装解决方案4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。结果报告的比例平均EGFR / CEP7每核信号。信号的比值< 2被列为nonamplified (NA)和≥2放大(A)。在每个部分中,至少30核数了信号。
2.4。显色原位杂交(CISH)
CISH实验,根据协议由供方(酶),连同鱼样品形态和有更多的信息有一个永久的信号。结果被解释为上述鱼。
2.5。实时聚合酶链反应
的理论和实践方面使用ABI棱镜7700序列实时定量rt - pcr检测系统(美国应用生物系统公司,加州福斯特城)已经详细描述了在其他地方(16]。
总RNA的确切数量添加到每个反应混合(基于光密度)和质量(即。、缺乏广泛的退化)都难以评估。我们也因此量化内源性RNA的转录控制基因真沸点塔塔(加入基因库NM_003194)编码框结合蛋白质。每个样本归一化的基础上它真沸点内容。结果,表示为具有多个目标基因表达的差异相对于真沸点基因,称为“Ntarget”,确定,那里的样本由价值减去目标基因的平均Ct值的平均Ct值真沸点基因。
N目标随后的样本值归一化,这样的均值真皮纤维神经瘤N目标值是1。
2.6。统计分析
定量数据被表示为平均值±标准偏差;定性数据频率和百分比。使用学生的方式进行比较必要时以及曼和惠特尼非参数检验。比较使用x平方分布检验的频率进行,或在必要时确切概率法。
Log-rank测试用于检查之间的关系总体生存和以下变量:年龄、性别、初始定位,NF1状态和EGFR的表达。变量的统计值<。20.were entered into a Cox model multivariate analysis.值小于0.05被认为是显著的多元分析。
8.2与SAS统计分析软件包(SAS研究所有限公司、卡里、数控、美国)。
3所示。结果
52名患者的主要临床特点对于展示在表1。诊断的平均年龄在时间年,性别比例是30米/ 22 f。肿瘤局部在树干,头部或颈部(),或者在四肢()。一半的患者()有一个NF1,其中九NF1的家族历史。对于之前的年龄诊断患者NF1 (比non-NF1患者(年)年)()。
表皮生长因子受体表达的肿瘤细胞通过免疫组织化学方法检测36个患者42例(86%)有价值的对于;NF1子群比例较高(分别为95%和75%;;卡方检验(见表)1)。本地化表皮生长因子受体在肿瘤细胞内的膜、胞质,或两者兼而有之(见图1)。在6例,肿瘤细胞是消极和其他10例没有价值,因此被排除在分析之外。
(一)
(b)
有趣的是,整个肿瘤染色是异构在一些情况下(见图2(一个))。在这些情况下,EGFR-positive细胞局部在“高档”领域,定义为地区high-cellular密度和细胞有丝分裂指数高。在这些情况下,四个样本用于执行串行部分,我们证实EGFR-positive与高档隔离的区域特性,增殖指数检测到ki - 67表达,在两种情况下也有P53-positive区域(见图2 (b))。相比之下,与生存素染色,对于积极的在所有的情况下,扩散到所有肿瘤区域(见图3)。
(一)
(b)
确认,通过另一种方式,对于表皮生长因子受体超表达的高频率,我们量化表皮生长因子受体记录在一个独立的系列20对于使用实时rt - pcr和比较14良性皮肤纤维瘤。的均值表皮生长因子受体在对于RNA水平高于良性皮肤纤维瘤(与、NS)和4(25%)对于样本显示显著增加表皮生长因子受体成绩单(超过3倍的意思是良性皮肤纤维瘤)。
确定超表达EGFR蛋白和RNA可能相关的放大表皮生长因子受体轨迹,我们执行CISH和鱼八对于分析样品的主要系列(R72、R74 R78, R84, R85, R86, R92, R94, R111, R116),其表达式是同质的()或异构()。没有一个肿瘤的证据表皮生长因子受体放大。点的平均数量在细胞核中发现的40到60肿瘤细胞通过样本染色CISH为2.42(范围从2.1到3.3)。只在一个情况下,5 - 6点被发现在一些肿瘤细胞,但是鱼透露多体性染色体为这个肿瘤(请参见图74)。
(一)
(b)
所有的病人接受手术切除肿瘤,除了两个诊断转移性阶段执行的。另外两个患者失去了看,几天后初步诊断,并为生存分析因此被排除在外。Kaplan-Meyer总体存活率分析显示,当地的阶段(本地或局部晚期)以及NF1状态有一个贫穷的结果(和、职责),而诊断年龄、性别、和表皮生长因子受体表达。多变量分析显示,只有NF1状态坚持作为一个独立的预后因子(),风险比为2.7 (1.2 - -6.2)。中位数生存的患者有或没有NF1 18 - 43个月,分别和5年生存率分别为11%和45%。
4所示。讨论
在这个定义的一系列52对于患者,我们通过免疫组织化学方法显示表皮生长因子受体表达在86%(71 - 94%)的情况下。在20对于rna的独立的系列中,我们观察到明显表皮生长因子受体RNA超表达在4(25%)对于(> 3倍水平良性皮肤纤维瘤)。我们的结果证实之前通过免疫组织化学方法检测EGFR在8/12例(10,13),在6/7的病人通过免疫印迹(13),以及表皮生长因子受体信使rna在16/42例(17]。在后者中,NF1患者阳性更频繁表皮生长因子受体RNA表达非NF1患者(12/25和4/17)。分析人类对于细胞系还显示一个更强大和更分散的表皮生长因子受体在细胞中的表达行来源于NF1 non-NF1患者相比(18]。表皮生长因子受体也更频繁地表达NF1病人在我们的系列(分别为95%和75%;)。免疫组织化学EGFR检测数据已经在许多出版物报道具有良好的染色石蜡包埋组织样本的敏感性和特异性。
超表达的蛋白质和RNA表明pretranslational监管对于表皮生长因子受体。扩增的基因位点的表皮生长因子受体是一种常见的监管机制等其他肿瘤头颈部鳞状细胞癌(19),肺非小细胞癌(20.],大肠癌癌(21]。对于,表皮生长因子受体放大5 17患者此前曾报道(22]。在这项研究中,一个“低级”放大了分散细胞包含6 - 12点,3例伴有多染色体7。另一组未能检测到表皮生长因子受体放大在四种情况下,虽然1 - 2额外的副本被认为在这些情况下(23]。在这里,我们证实了这些结果在8个病人。因此,表皮生长因子受体超表达在大多数对于不是由于放大的表皮生长因子受体在7 p12轨迹。正常的雪旺细胞不表达表皮生长因子受体,而NF1突变导致表皮生长因子受体超表达在这些细胞(12]。NF1的损失函数可能因此提高表皮生长因子受体的转录。
老鼠的杂合的删除NF1( )没有神经肿瘤的发病率增加;然而,当这些老鼠也携带的杂合突变TP53( 他们开发肉瘤和脑肿瘤(24,25]。表皮生长因子受体经常表达许旺细胞行源于这些( 老鼠)。细胞生长在这些线大大刺激通过EGF和被表皮生长因子受体拮抗剂(11]。减少表皮生长因子受体信号 小鼠减少了死亡率(12]。在本系列中,我们表明,表皮生长因子受体的高表达是出现在高档的肿瘤区域,似乎colocalize ki - 67在所有情况下和p53在一半的情况下。在一些情况下,一个强大的表皮生长因子受体的表达在高度细胞区域,与消极其他地区对比,已被描述在一个NF1病人(10]。因此,对于动物和体外模型,我们的数据表明,表皮生长因子受体超表达与雪旺细胞的恶性转化。
然而,NF1地位是唯一预后因子在多变量分析中,与18 - 43个月患者的中位生存有或没有NF1。表皮生长因子受体表达,尽管高NF1病人,没有出现对于预后因素,当地也没有舞台,诊断、年龄或性别。
过度的生存素信使rna在对于已经观察到由三组独立(16,17,26]。监督分析,对于发现的基因表达分析表皮生长因子受体阳性和阴性肿瘤有一个特定的基因表达特征(17]。有趣的是,这些作者显示表皮生长因子受体阳性的肿瘤有较高的表达ki - 67和生存素记录。我们通过免疫组织化学方法证实在此,将补充数据表达的细胞定位,生存素表达的恶性雪旺细胞。但是,对比与表皮生长因子受体存活素表达并不局限于高档地区的肿瘤。
对于的预后很差,只有23%的生活个人十年后诊断(27]。术后照射,不影响整体生存和没有有效的化疗方案,是可用的1]。在我们的系列中,诊断的平均年龄年,生存中值为30个月。因此,有相当大的兴趣建立机制负责对于tumourigenesis并使用这些信息来开发新的,更有效的疗法。表皮生长因子受体靶向治疗用单克隆抗体是高度有效的几位人类癌症28]。到目前为止,大多数患者单克隆抗体anti-EGFR西妥昔单抗(艾比特思,里昂,法国)患有结肠直肠癌(29日)或肺部(30.癌症。最近,西妥昔单抗是成功地用于防止纤维瘤的发展NF1的小鼠模型31日]。几组显示的含义表皮生长因子受体表达的雪旺细胞恶性转化细胞系和/或小鼠模型。我们的结果在一个大的一系列人类对于证实了这些数据。肿瘤与酪氨酸激酶受体过度已成功治疗靶向治疗,如胃肠道间质肿瘤表达工具,可能与伊马替尼治疗(32]。肺腺癌中,EGFR的表达没有预后价值(33),也可以接受吉非替尼或埃罗替尼。因此,表皮生长因子受体的过度NF1对于患者的95%,这些年轻患者的不良预后中显示本研究表明新疗法针对表皮生长因子受体为这些病人可能会很有趣。
确认
作者想要感谢所有法国,意大利,和西班牙的病理学家,提供患者的石蜡块:安德烈博士处理Bendjaballah,贝尔坦公司,布兰奇,Boddaert, Bognel,布鲁赫,Cordonnier, Devillebichot, Dulmet, Ferlicot, Gruchy, Guillermand-Gerard,海宁,Lacroix-Ciaudo,跛,Leger-Ravet, Maiorano,设计学院男人味儿,马修,Mikol, Molimard, Nistal马丁·德·塞拉诺Payan,珀蒂,Ranchere-Vince,施密德,Slama, Tourneur Voisin-Rigaud,维斯和Yaziji。作者还要感谢Mariama Bakhari优秀技术援助。美国Tabone-Eglinger是ANRT,金融支持中心莱昂-癌症和诺华公司。这项工作得到了Saint-Quentin-en-Yveline大学(“奖金质量生僻”)和协会pour la Pathologie精心设计的。