文摘
目的。软组织肉瘤患者(STS)的风险增加第二原发性恶性肿瘤,包括第二针,但转移和第二个主要STS之间的区别是很困难的。患者和方法。基于阵列比较基因组杂交(aCGH)应用于30多个STS的四肢和躯干壁来自13个病人。不同histotypes在场与恶性纤维组织细胞瘤/未分化的多形性肉瘤主要亚型。结果。aCGH遗传复杂性与多个损益分析显示在所有的肿瘤。在无人监督的层次聚类分析,类似的基因档案并关闭集群之间的第一个和随后的STS被确定在5例,表明转移性疾病,而其余8名患者的肿瘤没有集群和只显示弱的两两相关,建议第二主STS的发展。讨论。确定的相似与相异的第一和第二STS表明遗传资料可以用来区分软组织转移的第二个主要针。演示基因不同的软组织肉瘤在同一病人建议独立肿瘤的起源和提醒人们考虑发展第二个主要STS,预后和治疗的影响。
1。介绍
第二级肉瘤的风险增加发展的观察来自个人治疗儿童癌症如视网膜母细胞瘤、白血病、霍奇金病的肿瘤、霍奇金淋巴瘤和肉瘤(1- - - - - -13]。然而,成人软组织肉瘤(STS)患者也被证明是在第二种原发恶性肿瘤风险更高,尤其是风险增加的第二个主要STS (14- - - - - -17]。STS已经与几个遗传综合征有关,最常见的是神经纤维瘤和李法美尼症候群的(18]。Treatment-induced肉瘤包括肉瘤与Stewart-Treeves综合症和辐射诱导血管肉瘤,放射治疗后平均10年发展(19]。然而,在排除神经纤维瘤患者和STS的STS辐照领域的开发,风险增加的第二个主要STS仍然是(17]。Metachronous STS被描述在1%的肉瘤患者16,17,20.),这个观察构成的基础研究相似/不同的多个STS基因的肿瘤患者。我们应用基于阵列比较基因组杂交(aCGH)利用与瓷砖覆盖整个基因组BAC克隆,允许详细的人类基因组分析,一系列30 metachronous STS的不同组织病理学亚型来自13个病人。
2。患者和方法
2.1。病人
成人患者(≥16岁)开发的两个或两个以上的STS在不同解剖网站在发展任何检测肺转移研究都有资格。李法美尼症候群患者神经纤维瘤病1型和被排除在外。在南部瑞典癌症登记处,20个病人确定满足这些标准。肿瘤被操作在隆德(肌肉骨骼肿瘤中心)或在瑞典南部的当地医院医疗区域()。综述了临床病理报告证实肿瘤位置和排除第二个主要STS代表局部复发和组织病理学综述了幻灯片的肉瘤病理学家(收听距离)来确认诊断。
冷冻肿瘤组织可以从16肿瘤和石蜡包埋组织使用来自28个肿瘤相关肿瘤来源没有系统的差异。肿瘤DNA提取后,7个人(14)被排除在外,因为DNA质量差在至少一个相同的肿瘤患者。优质aCGH数据得到来自30个肿瘤(15从冷冻组织)提取的DNA来自13个病人(表1)。这些患者贡献两到四STS,意味着73(28 - 83)年第一STS的诊断。第二个STS开发中3年后第一个STS (1 - 7)。没有新辅助化疗了,只有一个病人(例5)收到术后化疗后第一针。术后放射治疗由4名患者(5,6,8,和术前1),但第二个STS辐照领域内的发展。
对13例临床资料展示在表1。下肢是最常见的肿瘤部位肿瘤(16)和28肿瘤高级(等级3和4在4-tiered范围内)。第一个STS包括八个恶性纤维组织细胞瘤/未分化的多形性肉瘤(细胞瘤/ UPS),两个平滑肌肉瘤,两个恶性周边神经鞘肿瘤(对于),和一个多形性脂肪肉瘤。组织病理学诊断的第二个STS不同于第一个两个病人;平滑肌肉瘤的诊断在两个前细胞瘤/ UPS和平滑肌肉瘤患者被诊断出病人对于之前动手术。在剩下的病人,包括三种情况,分析了三个或四个不同的肿瘤,相同的组织病理学类型的多个STS确诊。
在9/13患者STS开发不同解剖位置,例如,不同的四肢或肢体和躯干壁。三个病人发达metachronous STS在同一肢体但在不同的地方,例如,小腿和大腿(8例、12和13)和一个病人(没有。7)开发两个STS在同一肢体;大腿内侧的根深蒂固的平滑肌肉瘤和五年后的皮下平滑肌肉瘤外侧大腿(表的一部分1)。临床随访完成至少8年的幸存者。在随访期间,两名患者(病例12和13)发达局部复发,1和10年之后主要的手术。肺转移了5/13的病人,平均50(范围15-51)个月后原发肿瘤的诊断。除了metachronous STS,两名患者(病例4和7)开发的腺癌,乳腺癌和结肠癌。研究伦理许可被授予来自隆德大学伦理委员会。
2.2。DNA提取和基于数组的比较基因组杂交
基因组DNA从冷冻()和石蜡包埋(使用向导)肿瘤中提取基因组DNA净化设备(Promega,麦迪逊,WI)和隔夜蛋白酶k消化治疗phenol-chloroform净化紧随其后。当使用石蜡包埋组织,一个新鲜的节了,用苏木精和伊红染色的,是代表肿瘤区域被选中。此后,1毫米的组织核心,用于获得DNA提取。组织核心在二甲苯蛋白酶k治疗前进行预处理和phenol-chloroform净化。DNA质量检查使用准备好了RAPD分析工具包(Amersham生物科学,白金汉郡,英国),和浓度测量使用纳米下降(美国德尔NanoDrop技术,威明顿)。商业男性DNA基因组,源自健康个体的池,作为参考(美国威斯康星州麦迪逊Promega,)。CyDye耦合/标签是使用一个随机标签工具包(美国加州英杰公司生活技术,卡尔斯巴德)根据制造商的建议。简而言之,2 -g肿瘤基因组DNA和参考DNA用荧光染料标记不同,肿瘤组织Cy3, Cy5 DNA供参考。净化后一步,这些汇集,混合着COT-1 DNA阻止重复DNA序列,脱水和resuspended formamide-based缓冲区(表达载体)。标记的DNA被应用于阵列进行预处理在清洗解决方案(立刻!微阵列试剂系统、康宁Labsystems康宁,美国纽约)和杂交进行48 - 72小时37°c DNA的掩护下孵化了滑从冷冻分离肿瘤材料而毛伊岛杂交系统(BioMicro系统公司、盐湖城犹他州美国)用于DNA来自肿瘤石蜡包埋。Dye-swaps(即。,complementary hybridization in which Cy5 was used for tumor tissue and Cy3 for reference DNA) were used in three cases and allowed subtraction of dye-related noise. The slides were treated in post-hybridization washing solutions and finally scanned using an Agilent Microarray scanner (Agilent Technologies, Palo Alto, Calif, USA).
2.3。BAC阵列平台
BAC数组幻灯片使用时产生Swegene DNA微阵列资源中心,肿瘤学部门,隆德大学。这些平均分辨率为80 kb,包含32 433 32 k的BAC克隆人类基因组高分辨率BAC rearrayed克隆集合,1.0版本BACPAC资源中心的儿童医院奥克兰研究所(美国加州奥克兰)(http://bacpac.chori.org/)。克隆提供> 99%的覆盖率指纹图谱和当前序列的组装与分辨率为100 kb。
2.4。数据分析
图像分析和数据提取使用GenePix Pro 4.1.1.4版本(轴突仪器公司,促进城市、钙、美国)和量化数据矩阵然后上传到网络BioArray软件环境(基础;http://gothmog.thep.lu.se/int/index)[21),所有的数据进行管理和分析。Cy3背景校正和强度和Cy5计算使用中值特性和median-local背景强度的上传文件,并使用背景强度比率计算修正点强度计算参考强度比率的肿瘤。在基地初步过滤,基于图像分析中,应用和斑点直径< 55岁m和信号噪声比(信噪比)≤3在肿瘤或参考通道被标记为“坏”和过滤从进一步分析。的intensity-dependent洛斯算法(22)在单个阵列用于规范化数据。为空间偏见,正确的组内数据规范化print-tip 8块。移动平均滤波算法以250 kbp滑动窗口应用,和BASE-adapted CGH-plotter软件被用来识别区域的收益和损失(23]。CGH-plotter,每个克隆被分配一个计算水平比率值,对应的水平克隆属于,为了减少噪音。以后一个无人管理的分层聚类分析,利用皮尔森相关距离度量,平均链接法,应用于数据来源于CGH-plotter (TMeV应用程序使用微阵列软件套件;http://www.tm4.org/mev.html)。CGH-plotter也用于生成三元范围内,所有克隆都指定了,丢失或不变。这些值被用来计算的比例改变克隆在每个试验和改变在肿瘤克隆子组的平均数。皮尔逊相关性被用来确定肿瘤在同一个体之间的关系,基于改变克隆的数量。收益和损失被定义为一个比±0.2。放大被定义为与一个克隆比≥0.5,而高层放大被定义为一个比≥1.5。纯合子缺失被怀疑的时候率≤1.5。
3所示。结果
基因组资料30 metachronous STS的五个不同病理亚型显示多个损益和识别几个高层放大(HLA)和纯合子缺失(表2)。受影响的改变意味着39(9 - 70)%的整个基因组缺失放大为19%和20%。当第一个STS (随后的STS(相比))一个小差异的总数变化被发现与35(16-54)%,42(9 - 70)%基因组的改变,分别。几个周期性畸变与最频繁的变化(在> 60%的肿瘤)被删除10 q24.3 - 25.2, 13 q12.1 - 12.2, 13 q21.1 - 21.2, 16个问题- 23.2,18 q12.2 - 12.3, 1 q21.3 - 23.1和19 p13.3放大。
无人监督的层次聚类分析,基于过滤器的幸存~ 27 000克隆基地,显示关闭集群的肿瘤从五个人之间没有明显区别第一次和随后的STS基因组的改变(43%和41%)(图1和表1,1、2、6、9、12)。这些肿瘤对显示强大的基因块(图之间的相似之处2(一个))意味着相关性为0.7 (0.5 - -0.9)。许多共享变更数量确定的一些差异在所有5个情况和删除第一个肿瘤中总是出现在第二针。第一次和第二次之间的平均时间间隔STS在这五个病人是1(1 - 7),和两个病人后来出现肺转移。在剩下的8例STS来自同一个体没有聚集在一起,显示出显著相关性较弱,平均0.1 (0 - 0.4)。intertumor这些肿瘤有明显变化(30%的基因组被改变的肿瘤相比,后续肿瘤)的42%,相当于interpatient变异性,这意味着相关性为0.1 (0.04 - -0.2)。在四种情况下,删除出现在第一个肿瘤并没有出现在随后的肿瘤,它支持独立的肿瘤的起源。第二个STS在这些发达平均4 8例(1 - 5)年之后第一个STS和三晚的肺转移的病人。
(一)
(b)
4所示。讨论
尽管多学科和多峰性治疗,远处转移发展STS患者的30%左右。血性的,肺转移占主导地位,而淋巴传播发生在< 5%的病人(19,24]。软组织转移非常罕见,主要报道在脂肪肉瘤(16,25]。同步或metachronous STS的发展被描述在几个案例研究,但它仍然是一种罕见的临床表现和解释本有不同25- - - - - -29日]。流行病学数据支持的风险增加第二个成人STS患者原发性肉瘤(14,17]。为了减少偏见从包含家族性肉瘤综合症,我们排除了多个肉瘤李法美尼症候群患者诊断为神经纤维瘤或。唯一的发达多个对于病人是仔细检查,没有任何迹象表明神经纤维瘤(直到去世3年后)。因为只有一个病人接受辅助化疗后第一个STS和没有第二个STS辐照领域的发展,第二个STS研究不可能代表treatment-induced二级肿瘤。
CGH在STS中的应用主要包括平滑肌肉瘤和细胞瘤/ UPS和这些高度恶性和多形性STS亚型展示了广泛的基因组的复杂性与复发性拷贝数的变化,包括损失2 p, 2 q, 10 q, 11问,和13 1 q q和收益,5便士,8 q,和17 p [30.- - - - - -36]。这些周期性变化的几个也确认30 STS在这项研究中最常见的是删除10 q24.3 - 25.2, 13 q12.1 - 12.2, 13 q21.1 - 21.2, 16个问题- 23.2,18 q12.2 - 12.3, 1 q21.3 - 23.1和19 p13.3放大。为了获得尽可能多的肿瘤对,冻结以及肿瘤石蜡包埋组织使用。获得了高质量的DNA的肿瘤中,没有发现差异(表相关肿瘤来源1)。当从不同的肿瘤基因组资料对比较,五双显示高度相关的基因档案转移性疾病的暗示,而8例显示不同的概要文件暗示主STS截然不同。在后者的STS,相似之处,目前数量的差异导致弱相关,这可比interpatient变异性。重要的是,没有系统性的差异在两组之间的样品制备方法暗示转移性疾病和不同的初级STS,分别。无监督的相似性和差异明显分层聚类分析(图1)的五名前肿瘤对集群密切,而后者八没有。
之前的多个STS的报告主要涉及脂肪肉瘤。在混合系列九STS患者同步以及异时STS, Grobemyer等人发现脂肪肉瘤()和胃肠道间质瘤()作为最常见的亚型,而布莱尔等人报道16多个其中STS患者9脂肪肉瘤(20.,37]。我们的研究只包括成功地分析了一个病人的脂肪肉瘤(没有。6)开发四个脂肪肉瘤在四年内没有肺转移的迹象,群众22个月后死于局部晚期肿瘤。安东内斯库等人印迹分析应用于肿瘤患者从六个多病灶的黏液样脂肪肉瘤和特此monoclonality验证,从而证明多黏液样脂肪肉瘤在同一个人最有可能代表复发性疾病(16]。相似的遗传资料都在我们的系列中metachronous STS相同的组织病理学类型;三个细胞瘤/ UPS、脂肪肉瘤、平滑肌肉瘤,平均1年开发的间隔。后续发展的肺转移发生在两个五个病人(表1)。先前的研究在研究了小学和复发性STS之间的遗传差异进行了使用传统的全息和演示了增加遗传复杂性主要STS局部复发(38- - - - - -40]。然而,第二个主要STS的发展问题已经对我们的知识没有利用基因分析解决。我们将演示惊人地相似的基因图谱的五STS可能代表软组织转移意味着43%和41%的基因组改变和几个共享删除标识。此形成鲜明对比的八个STS病人metachronous STS显示不同的遗传资料。其中,多个组织学亚型(即。,MFH/UPS, MPNST, and leiomyosarcomas) were present and four of the deletions identified in the primary tumors were not found in the second STS. In summary, the clinical presentation, histopathology, and the genetic profile support independent sarcoma origin in 8 of the 13 patients (Table1)。尽管发展metachronous STS是罕见的,我们的演示不同的遗传资料在绝大多数情况下提醒人们要考虑独立的肿瘤的起源,影响治疗的选择,例如,使用的辅助化疗和/或放射治疗手术后第二个STS本身不应被视为代表转移性疾病。
确认
金融支持被授予从瑞典癌症基金,瑞典研究理事会,瑞典儿童癌症基金会,尼尔森癌症基金。