文摘

昆虫病原真菌(EPF)不同的属已知有潜力参与fungus-plant交互真菌内生菌。这个隐藏的寄主植物内寄生的交互提供了几个优势,比如害虫管理。因此,本研究旨在探讨内寄生的潜力和毒性的EPF人工接种后集合。总共27属EPF隔离白僵菌和绿僵菌属是毒性筛查。两种接种方法(叶和拌种)被用来研究内寄生的殖民化的潜力所选的隔离。有显著变化的检测分离的能力c . partellus幼虫。较低的平均死亡率百分比记录隔离B4, DS-51-21, B1, 9分28.01%,32.29%,和34.58%,分别。所有筛选EPF隔离能够殖民玉米组织人工接种后,除了APPRC-34GM。玉米组织随压力的百分比殖民化,和交付方法范围从最低0%,最高53%,最高记录的年代# 10 h。幼虫死亡率与EPF喂食玉米叶片接种后从18%到60%不等。本研究的结果表明白僵菌种虫害和绿僵菌属种虫害有可能人为接种后殖民玉米,把从感染的网站。因此,潜在的感染和杀灭幼虫从网站活动后殖民化会给管理害虫的优势作用于玉米的不同部分。

1。介绍

害虫在减少作物生产发挥重要作用。在谷物中,玉米是高度受到天牛物种因为它包含高浓度的氨基酸和糖类和挥发性化合物排放量高于其他禾本科主机1]。玉米是由鳞翅类饲料植物茎茎蛀虫,造成约80%的产量损失在非洲(2]。鳞翅类茎蛀虫、斑点天牛、卡勒partellus(他),造成高达45%的玉米产量损失在东非(1]。c . partellus是破坏阶段的幼虫阶段,可以攻击整个工厂,除了根。在埃塞俄比亚,害虫高度丰富的半干旱ecozones海拔1200至1985米,造成重大损失的产量在玉米和高粱3,4]。各种管理方法,包括文化、化学和生物方法,被用来减少破坏性的影响c . partellus。此外,农药仍经常用来杀死害虫,尤其是根除天敌。

在生物防治剂,昆虫病原真菌(EPF),尤其是那些属的白僵菌和绿僵菌属,被广泛报道感染广泛的节肢动物。这些真菌主要是土壤中不同的栖息地,包括橡树森林,农业土壤,松树造林,和茂密的树丛5]。这两个组是最主要的昆虫病原真菌在土壤和有可能在相同的环境中共存而不损害对方(6]。然而,最近的研究表明,在不同属EPF有潜力参与fungus-plant交互真菌内生菌和自然分离出不同的植物物种,如咖啡(7)、玉米(8],甘蔗[8),和西红柿9]。如一和刘易斯(10显示通过分生孢子的萌发管发展单独使用输入玉米组织直接通过植物角质层,菌丝的增长发生在质外体以后扩展到木质部的元素。还发现了昆虫病原内生菌殖民上面和地下组织的寄主植物(11]。

的毒性特征行列式EPF受到众多因素的影响,在实验室和现场条件下。感染比例、径向生长、发芽势和spore-bound公关−1与重复接种和营养成分(酶活性下降12]。EPF的字段有效性也严重受到环境条件的影响,如不利的温度,湿度,减少和高水平的紫外线辐射。EPF作为植物体内寄生菌的应用有一个之前的优势传统的方法来管理害虫,因为它的生命周期包括穿刺和喂养(厂内部分13]。

这个隐藏的内寄生的交互提供了几个优势,寄主植物。内生菌性能优越的生物防除共生体通常存在于土壤。Botryosphaeria quercumendophytically隔绝健康豆荚的可可树(Theobroma可可L。)表现出对植物病原体生物防除指数高于木霉可可生产菌株从根际土壤分离农场(14]。此外,植物内生微生物具有广谱宿主抵抗昆虫食草动物。殖民的植物根系土壤微生物引起茉莉酸和ethylene-dependent基因的表达,产生诱导系统性抗性(ISR) leaf-chewing昆虫(15]。N-formaylloline、epoxyjanthitrem I-naphthalene, nodulisporic酸是well-characterizedanti-insect内生真菌产生的次生代谢物(16]。

植物的内生定殖白僵菌和绿僵菌属防止害虫。昆虫病原单独使用endophytically孤立从咖啡导致成人咖啡浆果蛀虫累积死亡率100% (7]。玉米植株接种B。单独使用显示增加产量和产量等参数高度,数量的叶子,粒重,和比例的种子发芽,这说明额外的EPF在植物生长中的作用[17]。内生植物的存在的白僵菌和绿僵菌属也研究了诱导upregulation生长素和gibberellin-related基因(18]。昆虫病原真菌的应用也被报道在射击和根生物量显著增加小豆蔻植物(19]。这提供的辅助作用的EPF多种用途的机会增加害虫综合治理策略。使用内寄生的EPF害虫控制被发现兼容其他害虫管理策略等生物制剂和化学杀虫剂7]。entomopathogens的字段有效性是限制由于几个因素,包括易受紫外线、低水分、交付方法,达到目标。因此,使用entomopathogens真菌内生菌也可能提供一个比较优势超过其他交付方法的局限性,如喷涂。

大多数研究内生菌进行复苏展示潜力接种后,一直和有限的关注可能对昆虫的影响。除了使用生物农药,有越来越多的证据表明,许多EPF物种可以通过人工接种殖民植物组织或自然发生的内生菌。已经有许多成功的尝试使用不同的技术人为地引入EPF植物(9,20.]。的自然或人工殖民化对植物内生菌可能是有益的,因为他们已报告改善植物生长,减少害虫侵扰在许多经济作物(21]。本研究旨在确定的毒性绿僵菌属和白僵菌隔离与c . partellus幼虫和评估这些隔离的内寄生的殖民化潜在人工接种后的玉米植株。

2。材料和方法

2.1。筛选EPF隔离g . mellonella幼虫

2.1.1。饲养的g . mellonella

的饲养g . mellonella进行生物防除实验室读经台农业研究中心的埃塞俄比亚。成人飞蛾被保持在500毫升玻璃瓶所包含折叠纸注入了水和蜂蜜的解决方案允许交配和产卵。组织论文与下蛋了瓶和插入塑料饲养箱80克,50克,180克蜂蜜,麦麸,甘油,分别作为幼虫饲料。盒子是在黑暗中孵化20°C长达4周获得合适的筛选昆虫病原真菌分离株龄。

2.1.2。EPF源隔离

EPF隔离用于实验得到的读经台农业生物防治研究中心实验室和亚的斯亚贝巴大学真菌学实验室,埃塞俄比亚。共有27个昆虫病原白僵菌种虫害和绿僵菌属种虫害亚文化在Sabouraud葡萄糖琼脂(SDA)媒体和孵化26°C允许孢子形成的三到四个星期。从土壤样本收集所有EPF菌株的不同部分使用诱饵广场方法(表1)。

2.1.3。应变能力

所有27个隔离受到发芽试验评估的可行性分生孢子,以下描述的程序确保et al。22]。三到四个星期SDA上接种之后,得到的分生孢子真菌隔离无菌金属铲刮,悬浮在试管中包含10毫升无菌水渐变80 (0.01% v / v)股票暂停。分生孢子的浓度调整到3×10⁶分生孢子/毫升,一种改进的纽鲍尔血球计使用光学显微镜(日本Olympus-CH30RF200) (40 x放大功率)。大约有100μl悬挂在SDA镀传播媒体在直径90毫米的培养皿中,和1毫升70%的酒精是蔓延在每个培养皿的孵化24 h后26°C停止在发芽。每个培养皿pseudotriplicated每个培养皿放置三个无菌盖玻片。发芽的比例是由光学显微镜下计数至少300分生孢子(40 x放大)。一分生孢子被认为是发芽,如果它显示发芽管增长规模一样大。每个隔离复制三次。生存能力的百分比计算发芽孢子的数量除以总数孢子检查,乘以100。

2.2。暴露的g . mellonella幼虫为EPF

g . mellonella幼虫被用来屏幕EPF选择相对毒性菌株。每个白僵菌和绿僵菌属菌株的分生孢子是从2-3-week-old培养板,分生孢子的浓度调整为1×10⁸分生孢子/毫升。十fourth-instar幼虫都沉浸在一个包含孢子悬液的无菌烧杯在10 ~ 30秒内,放在无菌滤纸防止被水窒息。幼虫被转移到9厘米直径无菌培养皿和放置在室温下(平均室温25°C)十天。死亡率记录日报和昆虫尸体表面消毒,放在室温下湿润滤纸确认真菌从尸体的产物。用无菌蒸馏水对照组治疗。每个处理重复三次。

2.3。筛选的EPFc . partellus

2.3.1。饲养的c . partellus

幼虫的c . partellus喂养利用其自然宿主、玉米、读经台农业研究中心的实验室里。拟寄生物和disease-freefield-collected幼虫和蛹被用于饲养。幼虫被转移到玉米,新鲜食品改变了每三天直到蛹化。蛹被保存在潮湿的培养皿,直到成年出现。成人飞蛾被维护在一个饲养笼3-4-week-old玉米植株生长在锅和允许产卵。鸡蛋每天收集并保存在无菌培养皿。刚孵出的幼虫被转移到一个塑料罐含有新鲜的玉米叶子。定期喂养幼虫,玉米植株生长在一个塑料罐和保存在一个温室的光周期12 h: 12 h光明与黑暗。二、third-instar幼虫被用于测试。

2.4。致病性的EPF的幼虫c . partellus

八EPF隔离被用来评估他们的幼虫的致病性c . partellus。选择隔离是基于他们的生存能力和毒性g . mellonella幼虫。每个隔离的孢子悬浮液和所需的分生孢子的浓度(1×10⁸分生孢子/毫升)如上所述,准备和两毫升暂停喷在10 s c . partellus late-second-instar幼虫。对照组治疗2毫升无菌蒸馏水80一滴渐变。新鲜的玉米叶子正在逼近提供表面消毒后的幼虫,如上所述。每个处理重复三次在室温下和维护。死亡率记录每日11天,死者幼虫霉菌病开发确认检查真菌感染,如上所述。

2.5。EPF对幼虫的剂量反应研究c . partellus

2.5.1。分生孢子悬浮液制备

3个三分生孢子EPF隔离(两个白僵菌。和一个绿僵菌属。)被用于多个浓度化验以确定致死浓度(LC₅₀和信用证_90年(LT)和致命的倍₅₀和肝移植_90年)杀死昆虫测试的50%和90%,分别。这是继Tefera描述的程序和执行普林格尔(23]。股票分生孢子悬浮液形成孢子真菌的文化是由混合分生孢子和无菌蒸馏水滴0.1%渐变80使用电磁搅拌器。股票分生孢子的浓度决定使用一个血球计,和分生孢子的浓度调整四个浓度水平:1×10⁸1×10⁷1×10⁶,1×10⁵分生孢子/毫升。

在每个试验中,一批10 C。partellus幼虫被放置在一个无菌培养皿(9厘米直径)和处理2毫升每分生孢子的悬架用一个手持喷雾化器。Preweighed surface-disinfected玉米叶子,长约5厘米,宽2厘米,给幼虫和被允许饲料24小时之前用一个新的替换的叶子。消极的控制处理包含一滴渐变80蒸馏水。实验在室温下保持了11天。每个处理重复四次。每天进行了观测,死者幼虫霉菌病开发确认检查真菌感染后表面消毒和放置在湿润的滤纸。

2.6。玉米殖民EPF

昆虫病原真菌分离株用于剂量反应研究检验了组织殖民。每个隔离的股票分生孢子悬浮液制备在试管中包含10毫升无菌蒸馏水包含渐变80 (0.01% v / v)。暂停无性孢子的浓度调整为1×10⁸使用一个旋涡混合器混合后分生孢子/毫升。

2.6.1。温室的研究

Jibat玉米品种的种子被用于殖民研究的潜力。次氯酸钠(0.5%)和乙醇(70%)被用于表面消毒的种子。为了避免残留的消毒剂,种子与无菌蒸馏水清洗三次。的成功证实了表面消毒接种最后冲洗整除PDA和孵化3天26°C。种子被分为两个组的种子和叶接种实验。昆虫病原真菌的胚胎没有种子被镀评估碎种子在PDA上。玉米生长在塑料锅(大小为20厘米×17厘米)充满了2.5公斤的无菌土壤、砂、堆肥(2:1:1)。

2.7。接种的EPF

叶和种子接种的方法被用来感染玉米EPF,所述Tefera和比达尔(24]。

2.7.1。种子接种

Surface-disinfected种子被沉浸在穿着真菌分生孢子悬浮液悬浮的50毫升10分钟。种子被种植在锅装满无菌复合土壤(四个种子每锅,两人在出现变薄),和植物被维护在一个温室12 h光周期。控制种子都沉浸在无菌蒸馏水。

2.7.2。叶接种

7天出现后,没有种子幼苗接种接种到直接向每个幼苗的叶3毫升真菌分生孢子的悬架(1×10⁸分生孢子/毫升)。控制植物喷洒无菌蒸馏水。每个处理重复十次,治疗被安排在完全随机设计(crd)。分别进行了两个实验。

2.8。评估的EPF玉米

接种后二十天,幼苗无菌从锅中取出接种隔离和评估。幼苗被分为叶、茎和根部分,和表面消毒使用次氯酸钠和乙醇如上所述。四块(5毫米×2毫米)每个工厂每一部分工厂复制被剪切了surface-sterilised示例使用无菌手术刀片和接种SDA评估接种EPF孤立的存在。总共120块样品(40件/植物部分)的治疗,包括对照组,进行分析。接种菌株的结果记录10天后孵化26°C的真菌。殖民的使用公式计算百分比%殖民=隔离的样本数量增长除以分析样品的总数乘以10011]。

2.8.1发布。Endophyte-Insect交互

选择隔离证实殖民玉米被用于组织内生植物昆虫相互作用研究。昆虫死亡率与接种叶是由提供喂养后接种玉米叶子和茎c . partellus的幼虫。在每个试验中,一批10°C partellus幼虫(2日龄)被放置在一个无菌培养皿(9厘米直径)和复制的四倍。Preweighed的茎和叶子被提供到幼虫在培养皿中,允许喂一天才用一个新的替换的叶子。控制被允许吃玉米叶子和茎从无菌蒸馏处理的水的植物。实验在室温下保持为6天(平均25°C),并且每个治疗重复四次。死亡率数据记录日常和死者幼虫被移除,放在室温下湿润滤纸来确认一个真菌感染。死亡率由于治疗决定如雅培所述25]。

2.9。统计数据分析

所有死亡率和萌发数据受到一个方差分析使用SAS软件版本9来确定治疗之间的显著差异。可行性和致病性试验,意味着分离利用邓肯的多个测试范围和最显著的区别(LSD)测试 。LT₅₀和肝移植_90年确定使用概率元分析(IBM SPSS统计20)。方差分析(方差分析),并被LSD分离。

3所示。结果

3.1。应变能力和筛选g . mellonella幼虫

27 EPF来自不同来源的菌株获得的可行性评估,和分生孢子的萌发的比例超过80%(表2)。所有27个EPF分离株的致病性是第一次筛选g . mellonella幼虫使用galleria-dipping方法(表2)。测试之间的死亡率变化百分比隔离,导致死亡率在13.94%和90.0%之间。隔离年代#公元前048年是最致命的隔离,导致13.94%的死亡率。大多数的隔离是中度毒性,导致幼虫死亡率超过40%。前八个隔离造成的死亡率大于75%,表现出分生孢子的萌发大于85%被选为毒性测试c . partellus幼虫。

3.2。EPF幼虫的毒性研究c . partellus

八EPF分离株的毒力(七白僵菌和绿僵菌属)是评价,重大的变化(图1)。低平均死亡率百分比记录隔离B4, DS-51-21, B1,得分28.01%,32.29%,和34.58%,分别。隔离APPRC-34GM S # 10 h, APPRC-44BC最致命的毒株,平均死亡率为81.39%,90.00%,和90.00%,分别。

3.3。剂量反应研究

曾经有一段时间区别隔离导致幼虫死亡率50%和90%(表3)。LT的₅₀范围从3.53到4.72天,6.15到9.05天,高和低浓度,分别。# 10 h显示一个相对较短的LT₅₀6.15天。有一个普遍增加₅₀分生孢子的浓度下降。最高的LT₅₀(26.69天)和LT_90年(9.05天)被记录绿僵菌属sp。至少分生孢子的浓度。在最高的分生孢子的浓度(1×10⁸分生孢子/毫升),S # 10 h在7.46天也造成了90%的死亡率,这几乎等于APPRC-34GM所需的时间,7.42天1×10的分生孢子的浓度⁶分生孢子/毫升。

所需的最高剂量年代# 10 h杀死幼虫人口的50%和90%为5.5×10⁴和2.5×10⁷分别为每毫升分生孢子;然而,较低的LT₅₀和信用证_90年APPRC-34GM记录(1.5×10吗⁴和1.73×10⁶分别)。因此,APPRC-34GM可能导致幼虫死亡率较低的分生孢子的浓度(表4)。

3.4。内寄生的殖民EPF的玉米

所有筛选EPF隔离能够移植使用两种接种方法除了APPRC-34GM玉米组织,并没有隔绝根使用叶面喷雾方法(图2)。然而,殖民的百分比的玉米组织随压力,和交付方法范围从最低0%,最高53%。在叶面喷雾方法,根殖民三个菌株的最小(˂13%),表明从接种站点居住和易位能力低,也就是说,叶子,植物的基地。殖民的最大比例(53%)与叶面喷雾是记录的年代在叶# 10 h。所有EPF隔离显示相对良好的运动从叶到茎,这可能采取行动的可能性等stem-dwelling害虫的幼虫c . partellus。在种子处理,APPRC-44BC殖民化的比例最高(43%),有相对较好的潜在从感染的网站(种子)。这可能作用于害虫的刚孵化的龄等c . partellus,大量的鸡蛋玉米的叶子。然而,EPF菌株的一般发生在根和种子处理相比非常低,在树叶采用叶面喷雾法。年代# 10 h相对不错的殖民根和种子处理(48%),有可能移动的植物部分。然而,APPRC-34GM得分最低的复苏可能在每个采样(不超过23%)植物通过种子处理方法。

3.5。死亡率c . partellus吃玉米接种EPF后幼虫

幼虫死亡率后喂玉米叶子接种EPF范围从18%到60%(图3)。最大的死亡率(60%)被APPRC-44BC记录,和APPRC-34GM造成的死亡率最低。

4所示。讨论

在这项研究中,生存能力和致病性试验g . mellonella幼虫被用来屏幕27隔离选择最剧烈的EPF菌株。这对昆虫病原真菌的研究证明,所有的测试隔离致病性的幼虫c . partellus与重大变化之间的隔离。这种差异在毒性隔离可能直接关系到生产的杀虫毒素,宿主的免疫系统,和筛选条件。变化在生产重要的毒力因子,如杀虫毒素,菌株之一m . anisopliae报道了王et al。26]。Tefera [3)表示,一些entomopathogens的致病性的影响通过降低温度低于25°C。entomopathogens的感染过程也影响昆虫表皮,这是一种物理屏障影响依从性和真菌分生孢子的萌发有较低的水活动,缺乏现成的营养,和抗菌化合物的生产27]。

这项研究的结果也表明,曾经有一段时间区别杀死给定幼虫数量的50%和90%。这可能与分生孢子的浓度直接应用于宿主的免疫系统。LT的差异₅₀和肝移植_90年价值观也反映了遗传和生理变化进行隔离。同意这个,Teshome和Tefera28]表示所需的时间杀死玉米象的人口增加了白僵菌和绿僵菌属分生孢子的浓度下降。各种各样的LT₅₀引起的EPF已报告对不同昆虫宿主(29日,30.]。任意数量的传染性真菌结构也被报道在昆虫宿主致病。EPF隔离对仓储害虫的功效还发现受粮食类型(31日]。因此,最剧烈的昆虫病原真菌隔离年代# 10 h, APPRC-44BC, APPRC-34GM对幼虫进行测试c . partellus是很好的候选人myco-pesticide发展。

EPF隔离测试显示潜力殖民玉米组织与他们的能力的变化。然而,EPF的平均百分比殖民化隔离不能超过53%,和潜在的感染可以提供从网站管理的优势害虫作用于玉米的不同部分。类似的研究中,Pourtaghi et al。32)也报告说,单独使用把感染(叶)网站的其他部分(茎和根)的番茄。APPRC-44BC和S的结合使用# 10 h,得分43%和53%的恢复潜力,分别在叶,可能有增加的机会减少c . partellus喂养龄人口通过抑制活跃。微生物的成功殖民潜力的差异可能会影响到具体的品种特征和土壤条件,如提供一个enemy-free空间和交付方法。比达尔和贾比尔(11)发现,复苏的潜力单独使用在高粱不同接种方法。同意我们的发现,他们发现的殖民潜力单独使用使用叶片接种导致最高殖民化的树叶。Gonzalez-Guzman et al。18)中恢复过来单独使用使用三个接种技术:从番茄叶抽出,种子浸泡,和根浸渍,叶片喷洒交货是最有效的方法。然而,殖民潜力随着接种后的天数的增加而减少。

这项研究还显示,c . partellus幼虫吃玉米叶子后死亡,因为昆虫病原真菌的内寄生的发生。各种研究成果还表明,EPF内生定殖后人工接种原因死亡率和喂养威慑效果。成人粉虱死亡率增加进食后被记录单独使用内生植物番茄植物(32]。遭受玉米种以叶子的性能Rachiplusiaν幼虫内寄生的存在的影响单独使用(17]。现场应用mycopesticides可以通过地面或空中广播灰尘或颗粒使用雾化设备(33]。然而,环境因素,包括高度、pH值、土壤类型、植被类型、温度、紫外线辐射,有助于减少字段有效性和昆虫病原真菌的发生(6,34]。因此,昆虫病原真菌的应用通过endophytism可能有优越的优势直接喷洒在克服entomopathogens的关键环境因素限制字段有效性。

5。结论

目前的研究显示,Eetomopathogenic白僵菌和绿僵菌属有可能在人工接种后殖民玉米植物组织。然而,殖民的领唱是不超过53%,随接种方法。这项研究还调查了EPF能否把网站的感染到其他地区的玉米、指示的比较优势作用于不同的害虫的幼虫阶段。EPF的内寄生的事件也可以毒药的幼虫c . partellus。然而,EPF杀死幼虫的作用方式由于其内生植物的存在还没有理解。基于研究结果,结果表明,使用EPF内生菌可以替代战略遏制住玉米害虫的管理。然而,内寄生的害虫的幼虫行动方式和接种方法提高殖民EPF应该进一步研究的潜力。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

所有作者构思的想法和设计实验。Denberu Kebede进行实验和写的手稿;Tesfaye而minelik和Tadele Tefera修订草案。Tadele Tefera获得资金。从ICIPE Denberu Kebede是一个研究生。所有作者阅读和批准了手稿。

确认

本研究工作是由美国国际开发署资助的“保障未来粮食供给IPM创新实验室,弗吉尼亚理工大学的合作协议。援助- oaa - l - 15 - 00001由icipe实现。