植物遗传多样性原料药SPP。在泰国推断出28s rRNA核和细胞色素B线粒体基因序列

摘要

人类遗传多样性知识原料药SPP。对于更好地了解涉及野生物种和养殖种群的殖民地生存的育种策略来提供更好的育种策略。在这里，五个蜜蜂原料药从泰国12个省采集的物种。DNA提取后，28S rRNA核（710 BP）和细胞色素B（cytb)对线粒体（520 bp）基因片段进行测序。使用BLASTn算法从GeneBank获得同源序列（核苷酸同源性超过95%），对齐，并通过最大似然和贝叶斯推理系统发育分析。对于28S rRNA，种内检测到较低的遗传变异（单倍型多样性范围为0.212至0.394），而种间检测到19个多态性位点。尽管相对单倍型多样性较高，但发现迁徙物种的核苷酸差异较低（0.7%）cytb，序列分歧在物种之间的0.24％至3.88％，物种之间的7.35至13.07％。分歧cytb高于对照组28S rRNA．中华蜜蜂在泰国南部和其他地区之间有两个明显的分支中华蜜蜂（亚洲洞穴筑巢），梅利费拉（欧洲腔嵌套），答:dorsata（大型开放式筑巢），以及花属植物和A. Andreniformis.（矮人蜜蜂）被定义为28S rRNA和cytb树拓扑。

1.介绍

蜜蜂的多样性(原料药在农业领域很重要，因为它们在为多种作物花授粉中起着至关重要的作用[1.]。大型森林区域越来越分散，用于农业和其他土地管理，大型单一种植区和工业区越来越多。此外，气候变化已变得更加严重。这些变化可能影响到森林的多样性原料药因为每个物种都有不同的食用植物和栖息地偏好。

多样性原料药在过去的几十年中，泰国已报道了spp.的情况。在花属植物[2.]，A. Andreniformis.[3.]，及答:dorsata[4.]，以及答:dorsata和梅利费拉[5.,6.].研究原料药使用了线粒体DNA基因片段[7.,8.]，单核苷酸多态性[9]，和等位酶[10]区分品种，并提供一种更有效的方法来确定蜜蜂群体之间的遗传变异程度。

线粒体基因是用来确定昆虫遗传多样性程度的最常用的分子标记[11，因为线粒体基因组的平均突变率通常比核基因组高(10倍)[12]由于核苷酸不平衡[13]以及与真核生物类群间有效单倍体遗传相关的小有效群体规模[14]对于真社会性昆虫，多夫交配系统似乎在线粒体基因中插入了比核基因更高的替换率，因为线粒体DNA完全通过母体谱系遗传[15]因此，线粒体DNA的遗传仅通过一个女王传递，而核基因组则来自亲本系。这导致了核DNA库和线粒体DNA库的有效大小之间存在偏差[16]．

然而，仅使用线粒体DNA作为遗传标记来解决系统发育研究是不够的，并可能导致错误的结果。因此，对核基因组和线粒体基因组之间的系统发育关系进行了比较和组合[17]核基因内含子似乎可用于该分析。使用线粒体的最大似然（ML）和邻接分析NADH脱氢酶亚基2(阐述)和核能伸长因子1-α.(EF1-α.)基因内含子原料药spp.产生了相同的基本拓扑结构原料药spp[18]．

虽然这样一个限定的分类群如原料药据报道，蜜蜂内系统发育关系的重要方面仍存在不确定性，需要更多的数据来重新确认泰国蜜蜂多样性的状况。因此，这项工作旨在调查蜜蜂内部和之间的遗传变异水平和系统发育关系原料药SPP。泰国人群使用来自核的部分序列数据28S rRNA区域与线粒体相比较细胞色素B.基因(cytb).这个se data will provide complementary information and a more satisfactory comprehension of the phylogenetic variation and the origin within and among原料药在进化的时间尺度上。

2.材料和方法

2.1.样本收集

共有76个蜂群，包括Apis Cerana.(26),梅利费拉(11),答:dorsata（15），花属植物（22）及A. Andreniformis.（2） 2016年和2017年期间，从泰国东部、中部、北部、西部和南部的12个省份采集的样本，范围为北纬8°46′04.4′到北纬18°45′34.1′，东经98°57′56.3′到东经102°27′09.0′（图1.和补充1.).样品用干冰冷冻，并在-20°C下储存在实验室中，直至使用。

2．2.28S rRNA和Cytb基因部分核苷酸序列

使用QIAamp®DNA微型试剂盒（目录#51304，Qiagen）从胸部提取总基因组DNA28S rRNA和cytb采用聚合酶链反应(PCR)扩增基因片段28S rRNA（正向：5′-AGAGAGTTCAAGAGTACGTGTG-3′，反向：5′-AGTTCACCATCTTTCGGGTCCC-3′）和cytb（正向：5′-TGAATTGGATCAATCTTGG-3′，反向：5′-TCCAAGAGAGATAGATGATCAG-3′）引物对[3.,19].每次PCR扩增均在25个培养基中进行μ.l最终反应体积为12.5μ.l 2X祖母绿®PCR主混合料（目录RR300A，塔卡拉），1μ.每个10的Lμ.M正向和反向引物，至少30ng基因组DNA模板和无核酸酶蒸馏H_2.O.热循环条件为94°C，持续2分钟30秒，然后是35次94°C循环，持续1分钟，x  摄氏度持续1分钟（x=65摄氏度持续1分钟）28S rRNA以及50°C的温度cytb)在2%（w/v）琼脂糖凝胶上80 v电泳30 min后，在溴化乙锭染色后通过UV透照观察PCR产物。扩增产物的预期产物大小28S rRNA和cytb片段分别为710和520 bp。扩增的DNA片段使用QIAquick凝胶纯化试剂盒（目录#28704，Qiagen）进行纯化，然后在Macrogen Inc.（韩国）进行商业直接测序。获得的序列用于在国家生物技术信息中心（NCBI）搜索同源序列GenBank数据库使用BLASTn算法并对齐。

2.3.序列分析和多样性指数

MEGA7程序版本7.0[20]用于产生多重序列比对，并获得序列之间的替换数量、核苷酸组成以及序列的转换或颠换比率28S rRNA和cytb种内和种间的遗传变异被确定为单倍型的数量（数量），多态性位点的数量(s)，单倍型多样性(H) [21]，平均核苷酸差异数（k）和核苷酸多样性(π) [22]，使用DNASP V.5.0程序[23]．与Jukes和Cantor的序列散度(%)[24]使用MEGA7 V7.0和ARLEQUIN 3.5.2.2版软件估计物种间和物种内的核苷酸差异和平均数[25]．

2.4.系统发育分析

采用ML和贝叶斯推理（BI）方法重建了系统发育关系28S rRNA和cytb序列。采用Akaike信息标准(AIC)确定ML的最佳拟合核苷酸替代模型[26]贝叶斯信息准则（BIC）用于BI[27]如在Kakusan 4计划中实施[28].在Treefinder中进行ML分析，并进行1000次引导重复，以估计分支置信值[29]．自举值(BV)大于或等于70%的树拓扑被认为是充分解析的。BI是使用MrBayes V3.1程序执行的[30]使用所选模型，从一棵随机树开始，四条链同时运行至少1000000代，每100代进行一次树采样。ML和BI都给出了系统发育树的共识。

3.结果

3.1. 分子数据与序列分析

共有106个序列（73个来自28S rRNA和33个来自cytb)，并已存入GenBank，其登录代码如附录所示1.。该基因的平均核苷酸组成28S rRNA两组之间的顺序差别不大原料药A(17.33%)、T(21.05%)、G(31.84%)和C(29.78%)的平均含量较高，GC含量为61.6%(补充2.).平均cytb序列组合物在物种之间略微不同，平均A（34.2％），T（42.5％），G（11.8％）和C（11.4％）之间，高A + T含量为77.2％（补充2.和3.）.

对于28S rRNA在最后的数据集中，共有612个职位被分析。转换位点的频率低于转换位点(表1.）.为了cytb共分析了33个序列，包括 , ,和密码子和非编码位置分开，最终数据集中共有325个位置，76个多态性位点，其中27个位点显示转换，42个位点显示颠换，7个位点同时携带两种碱基替换（表1）1.）.

基于物种内的序列比对28S rRNA亚洲物种间遗传多样性指数低，遗传变异低原料药spp．（表格2.和3.).序列差异（成对比较）28S rRNA在中华蜜蜂,弗洛雷亚，和答:dorsata使用泰国各地的26、22和15个序列，分别从612、638和627bp处获得（表1）3.).这个sequence alignment between species revealed 19 polymorphic sites comprising seven A/G transitions, six T/C transitions, two A/T transversions, three G/T transversions, and one G/C transversion. The between species transition and transversion mutations in the28S rRNA序列分别为62.42%和37.58%。我们的结果还表明，种内序列差异低于种间序列差异（表1）4.）.为了cytb，只获得了一个和两个序列答:dorsata和A. Andreniformis.385个位置的每个序列的碱基差异数如表所示4.物种间的序列比对显示76个多态性位点，其中有11个A/G转换、20个T/C转换、37个A/T颠换、1个G/T转换、1个G/C转换和7个携带两种碱基替换的位点在cytb种间序列分别为54.54%和55.46%。所有变异的平均序列差异为8.9%。总体而言，物种间的序列差异较大，介于6.5%到25.2%之间，而同一物种的个体之间的序列差异较小。

基于cytb序列比对cytb分析中华蜜蜂（n = 10）揭示了来自16个多态性位点的八个单倍型，其包含四种A / g过渡，八个T / C转变和四个A / T横向（补充4.).这个中华蜜蜂来自泰国南部的种群与泰国其他地区的种群有明显的序列差异。物种内的序列差异（%）以及在物种间成对比较中观察到的核苷酸差异的平均数量中华蜜蜂如表所示5..当HAP1–HAP6（包括中华蜜蜂来自东部、中部和西部地区）与HAP7和HAP8（来自南部地区）进行了比较（补充4.).这个se results suggest that中华蜜蜂泰国南部的人口与泰国其他地区的人口不同。

在里面花属植物，将cytb序列表明花属植物来自SA的两个菌落（中部区域）与其他区域略有不同（表1）5.）.有趣的是，序列分歧中华蜜蜂和梅利费拉（10.22%）低于对照组答:dorsata,花属植物和A. Andreniformis.(表4.).与此同时，花属植物显示序列与A. Andreniformis.（7.35%）较中华蜜蜂和梅利费拉（分别为12.19%和13.07%）。

3.2。系统发育分析

通过ML分析，AIC构建系统发生树的最佳拟合模型为TVM + gamma，而BIC下BI树的最佳拟合模型为HKY85 + homogeneous。构造的ML树28S rRNA和cytb基因序列基本上与对应的双树相同，因此此处仅说明了ML树拓扑（图2.和3.）.

对于28S rRNA序列（612-638bp），其中的系统发育关系中华蜜蜂,弗洛雷亚，和答:dorsata来自所有地理区域的物种在系统发育树中均未显示出地理聚类的证据，尽管非本地物种梅利费拉在物种内部表现出一些差异。总的来说，所有亚洲人的遗传变异都很低原料药spp．根据本研究的75个序列加上两个A. Andreniformis.从GenBank获取并使用科里纳三角洲作为外部群体（图2.).这个原料药spp．被细分为四个主要分支（BV范围从50到98%，PP范围从0.60到0.95），强烈支持原料药泰国的物种（BV=100%，PP=1.0）。有趣的是，所有四种原料药除了两个矮小蜜蜂物种外，其他物种被明确地划分为各自的物种分支，花属植物和A. Andreniformis.，但未完全解决（图2.)这反映了这些矮种之间的低序列差异，这些矮种在原料药分组（图2.）.

对于cytb区域（383bp长），基于本研究中33个序列的ML系统发育树状图原料药仅包括一个和两个序列的物种答:dorsata和A. Andreniformis.分别加上五个序列原料药spp．从GenBank开始，使用Collina.外围集团。得到的树显示了四个主要的进化枝(图)3.)，每个原料药物种明显与其他物种区分开来，包括花属植物和A. Andreniformis.虽然花属植物在泰国，来自Samutsongkram（中部地区）的人群被分为三个单倍型的小亚群，其中的遗传变异水平较低cytb在花属植物基础组为答:dorsata对于中华蜜蜂（第1类），第10类中华蜜蜂本研究在泰国的样本加上三个中华蜜蜂来自GenBank的序列被细分为泰国南部和其他地区的两大组，以及东部地区的一个亚组（图1）3.).这个中华蜜蜂来自苏拉特哈尼的群体与其他区域明显分离（BV=100%；PP=0.95），而来自泰国东部的样本与其他区域略有差异，尽管其支持度较弱（BV=64%）。这种低支持度可能反映了单倍型之间的核苷酸差异（补充）4.)这些结果表明中华蜜蜂泰国南部的人口与泰国其他地区的人口不同。

4.讨论

总共73人28S rRNA和33cytb物种内和物种间基因片段的总体序列多样性都很低，尤其是对于28S rRNA这表明所有单倍型的序列差异都很小（0.7%）。这表明，在这方面几乎没有变化28S rRNA在原料药spp．在泰国28S rRNA该基因常被用作科种及以上级别的代表性核基因，例如，据报道，其中最保守的28S-D3区域可用于定义encarsia.spp[31]．

但是，使用28S rRNA单独存在可能是不够的，特别是在物种层面及以下。除了28S rRNA，其他核基因也被使用，比如itpr.[32]和EF1-α.内含子[18]，为了解决蜜蜂和其他昆虫的家庭水平。尽管如此，核EF1-α.据报道，内含子可用于蜜蜂的种间分类，但不能用于种内解析[18]．同样，据报道了28S rRNA不太可能恢复蜜蜂在家族水平上的深刻差异[33].相反，与其他基因结合，如视蛋白,cytb和16S RRNA,28S rRNA似乎有助于解决基础蜜蜂分化。

在这项研究中，我们发现cytb是否大于每个转换的数量原料药种类（表1）1.).这与先前报告的过渡偏差一致[18].在中华蜜蜂， 这cytb序列差异从0.26%到3.88%不等，但有趣的是，泰国南部人口的序列差异高于泰国其他地区（表1）5.).这个phylogenetic results are consistent with the molecular diversity indices of中华蜜蜂哪里中华蜜蜂泰国南部的人口与东部，西部和中部地区的人分开（图3.).这一结果可以用该物种的生物地理学来解释中华蜜蜂．此外，数据与之前的PCR-RFLP分析一致[34]．

为了花属植物，只有一个很低cytb检测到序列差异（0-0.74%），只有一个单倍型。萨穆特松克拉姆省只有两个菌落与其他菌落略有不同（图1）3.）.

总体而言，层序的散度cytb(8.9±5.0%)高于对照组28S rRNA（0.7±0.5%），与线粒体的进化率高于核基因组的进化率一致[11].虽然the mitochondrialcytb表现出较高的变异率，但在这些方面仍然表现出较低的变异原料药这可能反映了原料药spp．高度优群性和一妻多夫制，这降低了替代率，并通过增加有效种群规模抵消了遗传漂变的影响[35].不同种群中的祖先基因组将得到保留，因此种群之间的遗传距离将缩短[36]．导致低遗传变异的另一个可能因素是迁移行为。的偏移距离答:dorsata据报道，其宽度为50公里，最大可达200公里[37].在中华蜜蜂，尽管它们有迁徙的蜂群，飞行数十公里[38]，他们每年培养5-6次的强烈倾向，并且适应新的领域，因为它对每个领域的某些疾病和害虫问题更具抗药性[39]．

ml和bi系统的分析28S rRNA和cytb序列显示了相同的拓扑结构，其中有四个主要分支原料药许可证（对于ML：数字）2.和3.).使用Collina.作为外组，外组28S rRNA树把矮蜂放在属内的基础位置，而答:dorsata位于基部的位置cytb树，与之前的分析一致[40].虽然cytb和28S rRNA本研究中的系统发育树不能清楚地解析这些基因之间的关系原料药物种，它们可以分离答:dorsata来自其他人（数字）2.和3.).据报道，双方关系密切答:dorsata和中华蜜蜂在28S rRNA树和分子指数[32].虽然中华蜜蜂和梅利费拉据报道，它们彼此关系密切[18]，他们有生态和行为上的差异[41].在本研究中28S rRNA和cytb清晰分离的拓扑结构中华蜜蜂和梅利费拉在泰国，虽然彼此之间的距离仍然很近，但彼此之间的距离却很近原料药种

尽管如此答:dorsata和花属植物是开放式筑巢的蜜蜂，答:dorsata更接近中华蜜蜂和梅利费拉而不是花属植物和A. Andreniformis.在这项研究中，这可以通过研究对象的行为演变来解释原料药，其中腔嵌套是衍生的[42].此外，答:dorsata在白天和晚上有一个嗡嗡作响的舞蹈花属植物它只有一种无声的摇摆舞，洞穴筑巢的蜜蜂在黑暗的环境中适应了这种嗡嗡的摇摆舞。因此，视觉线索的损失被声音补偿了。

5.结论

总的来说，遗传变异原料药spp．泰国12个省的64个种群的遗传多样性指数较低，物种内部和物种之间的差异较小。这可能表明栖息地破碎化、单种作物农业、工业管理和气候变化并未影响物种多样性原料药SPP。在泰国，但显然，在建立实际的遗传多样性和关系方面，仍然是至关重要的原料药亚种，包括分析其他基因以获得更好的分辨率。

数据可用性

作者确认，手稿中的所有数据都是免费提供的。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

致谢

这项工作得到了泰国科学成就奖学金的财务支持朱拉隆功大学基金周年纪念（Ratchadaphiseksomphot捐赠基金）。

补充材料

补充件1：样本收集和GenBank登录号的详细信息。补充件2：样本核苷酸组成的频率（%）28S rRNA和cytb区域。补充3：不同密码子位置的碱基组成的平均频率（%）cytb基因片段。补充4：八个基因中的16个多态性位点cytb单倍型中华蜜蜂在泰国。仅指示与单倍型HAP1不同的位置。(补充材料)

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