文摘
森林种植园在乌拉圭在过去的十年里已经翻了一倍,桉树种虫害导致这种增长。青铜错误,Thaumastocoris peregrinus(半翅目:Thaumastocoridae),原来局限于澳大利亚,是一个重要的新兴的害虫桉树种植园在南半球。t . peregrinus以成熟的桉树叶子,使它们变成褐色,经常从树上跌下来。虽然种群动态和行为模式不清楚,间接观测表明男性和仙女聚集。我们使用气相色谱与质谱分析挥发性有机化合物排放的维珍男性和女性和男性特征化合物,3-methylbut-2-enyl butanoate,基于质量色谱与光谱数据和合成标准。我们还执行Y-olfactometer生物测试处女男性和女性的吸引力对处女男性生活,男性挥发性提取物,合成3-methylbut-2-enyl butanoate。男性对同种的男性所吸引,而处女女性没有偏好,表明男性挥发物没有参与沟通性。进一步的嗅觉测量器测试表明,男性被吸引男性挥发性提取物和合成3-methylbut-2-enyl butanoate。这种化合物的生态意义和其潜在的使用管理t . peregrinus在桉树森林将进一步调查。
1。介绍
商业在乌拉圭森林的面积达到约100万公顷,其中超过70%是由桉树种植园。这一地区在过去十年几乎翻了一番,在南美大趋势的一部分。在乌拉圭,e .桉和大肠茅是最重要的物种,代表54%和32%的桉树分别种植面积,而红胶树等大肠tereticornis占据约7% (1]。取决于种植用于纸浆或木材生产,生长周期在8到12岁之间,,因此,外来作物的单一文化的实践的一个明显的例子,这将有利于外来入侵害虫和疾病的传播,比如青铜错误,Thaumastocoris pereginus(半翅类:Thaumastocoridae)。
t . peregrinus是一个主要新兴害虫桉树生产在南半球。是一个小的扁平的bug(1 - 3毫米长)提要桉树和一些Corymbia物种(2,3]。它采用lacerate-and-flush喂养策略4),导致光合面积的损失,树落叶,甚至死亡(2]。这种昆虫是本机来自澳大利亚,和一些研究已经完成,直到它成为种植的害虫桉树树木在悉尼,2002年(5,6]。外面首次记录其自然范围2003年在南非,尽管它被认错t . australicus(2]。从澳大利亚原始看似独立的介绍7),它在2005年首次记录在阿根廷6),它被认为是新物种t . peregrinus(8]。现在是建立在阿根廷、巴西、乌拉圭、智利和巴拉圭(3,9),预见它将产生重要的影响桉树在该地区种植。
的行为和自然历史的信息t . peregrinus是稀缺的。被囚禁自己的观察交配建议短precopulatory次成年后出现(g·马丁内斯,未发表),和preoviposition时间从7到10天记录在澳大利亚20°C (10]。
间接观察表明男性和仙女往往聚集,可能通过semiochemicals。开始推出铜的化学通讯错误的可能性,我们进行了一项研究,由每周两次five-instar仙女处女雄性和雌性,发出和三通管嗅觉测量器来测试volatile-based生物种内景点。具体来说,我们表明,男性产生一个特定的挥发性化合物,我们的特点和合成,而这种化合物作为男性聚集信息素,吸引同种的男性。
2。材料和方法
2.1。昆虫
维珍从实验室获得殖民地长大成人的bug大肠tereticornis(改编自10])。男性,女性,和仙女在mesh-covered笼子(35×50×70厘米)在一个温室,大肠tereticornis盆栽植物,昆虫和期刊的字段。从这个股票的殖民地,成年人定期转移到大肠tereticornis在厄伦美厄烧瓶用蒸馏水和保存在实验室控制条件下(20±5°C, 55% RH)。从这些成年的笼子是孵化蛋集群收获在培养皿饲养室(25°C, 55% RH, 12: 12 L: D)在叶圆盘浮在蒸馏水。孵化仙女被转移到成熟笼子等于那些成年人,和两次第五周龄期仙女分离和成人出现每天检查一次。Just-moulted成年人承认的unsclerotized角质层,立即就被性感的,分开的化学和行为研究。他们一直与随意访问大肠camaldulensis叶子和水。
2.2。不稳定的收集和分析
挥发性有机化合物从处女男性和女性获得封闭在玻璃房间(24厘米长,4.6厘米直径。)有四个大肠tereticornis叶子。挥发物从20岁到40岁男性和女性被吸附在50毫克的Haysep-Q 80/100网,目前款湿润的空气(300毫升/分钟)72 h (24°C, 14: 10 D: L光周期)。挥发物被筛选了1毫升蒸馏己烷和集中到100年μL对氮的gc - ms分析下一个流。挥发物从四个大肠tereticornis收集树叶在相同的方式控制。男性挥发性提取物的生物获得类似的(从29岁男性),除了只有一个部分的提取(200μL)集中了gc - ms分析,而大多数是没有集中用于生物分析。
gc - MS分析使用qp - 2010 gc - MS,日本岛津公司装备有极性(AT-WAX MS)或一个无极(5 MS)列(Alltech) (30 m×0.25毫米,0.25μ米),与一个常数和运营载体流1毫升/分钟(他)。GC烤箱的温度程序如下:对于极地列,初始温度40°C(1分钟),然后提高到250°C在7°C /分钟为1分钟,250°C。无极的列的初始温度是40°C(1分钟),然后提高到300°C在10°C /分钟,3分钟。喷油器温度为220°C和间期温度250°C。注射(1μL)模式,在离和质谱被收购了m / z30到350 (70 eV,扫描模式)。为保留指数的计算,正烷烃的混合物(100 ppm,己烷)注入样品后立即在离模式。
2.3。行为的生物
所有的实验都是在白天进行,使用玻璃三通管嗅觉测量器(每个手臂长度20厘米,直径4厘米)的刺激放在单独的玻璃管(10厘米长,直径4厘米)和聚四氟乙烯管连接到嗅觉测量器。测试的相对位置之间交替刺激及其相应的控制复制,以防止任何位置偏差在昆虫的行为。款湿润空气推和拉通过嗅觉测量器的总流量1200毫升/分钟。测试昆虫被单独放置在中央管的入口,并为10分钟观察他们的行为。第一臂的选择和时间居住在每个手臂都被记录下来,并使用卡方和Wilcoxon测试结果进行了分析,分别。测试昆虫都是处女成年人和只使用一次,和那些没有达到任何嗅觉测量器的武器也没有包含在分析。测试刺激如下:(a) 10住男性(处女,有两个大肠tereticornis叶子)与两个大肠tereticornis叶子;(b)男性挥发性提取物与己烷(5μL,在滤纸上,有两个大肠tereticornis叶子);(c) 3-methylbut-2-enyl butanoate与己烷(1μg在5μL,在滤纸上,有两个大肠tereticornis树叶)。
2.4。合成
从3-methyl-2-buten-1-ol 3-Methylbut-2-enyl butanoate合成乙烯基丁酸(计划1),使用biocatalyzed酯交换(11]。脂肪酶B南极假丝酵母(卡尔B, 30毫克,Novozym 435)被添加到乙烯基丁酸盐的混合物(0.15克,1.3更易)和3-methyl-2-buten-1-ol(0.10克,1.2更易)2毫升的己烷。混合搅拌在一个轨道瓶2 h 30°C。酶是过滤、溶剂蒸馏压力降低,原油通过柱色谱法纯化(十六进制:AcOEt 8: 2)。3-Methylbut-2-enyl butanoate中得到98%的收益率,其结构经核磁共振和质谱:1H NMR (400 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 0.94 (t)赫兹,3 h);1.65(祷告,赫兹,2 h);1.71(年代,3 h);1.76(年代,3 h);2.28 (t, 3 h,赫兹);4.57 (d,赫兹);5.33 (tsept,赫兹,赫兹)。13C NMR (100 MHz, CDCl3):δ(ppm) = 13.6;17.9;18.5;25.7;36.2;61.1;118.7;138年,9;173.7。女士(即; 70 eV) : (0.2%)、156年(2.1%)、128年(0.4%)、114年(1.9%)、96年(0.2%)、89年(2.7%)、86年(1.6%)、85年(7.4%)、83年(1.1%)、72年(4.6%)、71年(100%)、70年(4.7%)、69年(62.0%)、68年(89.3%)、67年(56.6%)、66年(1.3%)、65年(1.2%),57例(2.6%),56例(1.1%),55(3.6%),54(1.6%),53例(14.3%),51例(1.2%),44(2.4%),43(63%),42例(6.5%),41个(49.8%),40(5.1%),39例(11.4%),38 (0.6%),31 (0.4%)。
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商业反应物买来Sigma-Aldrich Inc .和脂肪酶Bc .南极洲(卡尔B, Novozym 435)是获得诺维信。使用硅胶柱层析法进行了flash (EM试剂Kieselgel 60, 230 - 240目)Macherey-Nagel。核磁共振光谱(1H和13C)进行了在一个力量皇冠DPX 400 MHz设备。所有的实验都是在30°C;CDCl3被用作溶剂和TMS内部标准(缩写:9月(七重奏);午时经(六个一组);t(三联体);d (doblet);s(单线态)]。gc - ms分析挥发性提取物如前所述。
3所示。结果
3.1。波动分析
一些挥发性提取物得到相同数量的男性和女性,和他们相比较分析始终显示男性复合(图1)。这种化合物筛选了保留时间为10.1分钟在极地专栏(RI = 1379)和7.4分钟在无极的列()。极地列coeluting化合物存在于女性的挥发性提取物,显然不同于男性复合(图1(b))。这种化合物被确定为壬醛的质谱与标准相比,它还发现在叶片挥发性提取物(数据未显示)。
男性化合物的质谱(图1(一))显示一个小分子离子(2%)m / z156年和一个M + 1离子约为10%,表明9个碳原子和一个可能的分子式C9H16O2。基本的峰值m / z71年提出了一个公式C碎片离子4H7啊,是预期的α丁酸酯的乳沟。此外,离子集群m / z67、68和69是常见不同prenyl酯的相对强度。依照这个数据库搜索(NIST 08)这个质谱表明,酯3-methylbut-2-enyl butanoate(相似性指数96%),因此,合成并用气相色谱-质谱与男性相比挥发性提取物,导致相同的保留时间和质谱之间的合成和天然化合物(图2)。
3.2。行为的生物
当生活t . peregrinus男性在三通管作为刺激嗅觉测量器,男性对同种的男性表现出明显的偏好。嗅觉测量器臂轴承经常选择男性挥发物(第一臂的选择:,测试中,),男性花更多的时间在这个手臂比控制杆大肠tereticornis树叶(,Wilcoxon测试,)。女性不喜欢要么嗅觉测量器的手臂,关于第一臂的选择和停留时间每个臂(,测试中,;,Wilcoxon测试,职责。)(图3(一个))。
(一)
(b)
(c)
只剩下的行为实验集中在男性的反应和评价男性吸引力的化学性质对同种的男性。不过值得注意的是,男性没有任何偏好的三通管嗅觉测量器在女性面前挥发性提取物刺激(第一臂的选择;刺激= 27个男性;控制= 27岁男性)。相反,男性挥发性提取物被用作刺激时,男性表现出明显的吸引男性挥发物(,测试中,;,Wilcoxon测试,)(图3 (b))。结果分离时根据男性的年龄,结果表明,老年男性的吸引力更重要(降生)比那些测试后一个星期内出现(,测试中,;,Wilcoxon测试,;一周大的男性:,测试中,;,Wilcoxon测试,)(图3 (b))。后,明显的合成吸引男性复合(见下文),表明他们可以应对男性气味以及年长的男性。
合成3-methylbut-2-enyl butanoate也吸引t . peregrinus男性在三通管嗅觉测量器测试。结合测试大肠tereticornis叶子,1μg滤纸的男性化合物吸收了更多的男性选择刺激的手臂比控制臂(,测试中,;Wilcoxon测试,)(图3 (c))。和男性挥发性提取物不同于实验,年长的和出来的男性表现出显著的吸引力对合成化合物(雄性两周神经元:,测试中,;,Wilcoxon测试,;一周大的男性:,测试中,;,Wilcoxon测试,)(图3 (c))。
考虑男性用于男性的数量波动集合,集合的时间,来的男性生物挥发性提取物进行0.002昆虫情商·h−1。此外,通过比较峰地区3-methylbut-2-enyl butanoate测试提取和合成化合物的100 ppm解决方案,它可以估计的数量3-methylbut-2-enyl butanoate在5μ提取是0.25 L的测试μg。合成材料用于生物分析的数量,因此,较大,但在同一个订单的预计金额提取的生物。此外,在一个平行的研究中,马丁斯et al。(2012年,这一问题)的报告,整个身体的提取t . peregrinus男性包含1μg /昆虫3-methylbut-2-enyl butanoate,表明金额用于我们的生物相关生物。
4所示。讨论
据我们所知,这是第一个报告3-methylbut-2-enyl butanoate作为昆虫semiochemical,和第一个小Thaumastocoridae家庭中描述的信息素。相同的化合物被报道同时马丁斯和独立研究et al。(2012年,这个问题),确认其在不同的数量t . peregrinus在南美洲。这些作者还发现少量女性提取的化合物,和男性的另一个次要的男性化合物提取物,这两个我们没有发现可能由于不同的抽样程序(全身提取物对挥发性提取物)。
短链脂肪族酯类是常见的信息素组件在真正的bug (12]。的位置异构体3-methylbut-2-enyl butanoate (E)2-methylbut-2-enyl butanoate,据报道一级,male-attractant宽错误信息素成分Alydus eurinus(蛛缘蝽科)。男性,和一定程度上女性和仙女,吸引混合包含这个和其他丁酸酯生产metathoracic腺体(13]。脂肪族丁酸己酸酯类和酯类盲蝽科家族中也常见的信息素(12),股票总科与Thaumastocoridae Miroidea [14]。然而,酒精的半个这些酯显然不是萜烯的起源,这是最可能出现的情况与3-methylbut-2-enyl部分男性化合物t . peregrinus。
不同pentatomids,大多数性或聚集信息素释放的男性,信息素的一些物种已确定密切相关的盲蝽科使用雌性产生的性信息素,或由两性化合物排放但只有男性所吸引12,15- - - - - -17]。除了性信息素,male-produced性信息素(或男性排斥力),非常相同的化学motiv和解剖女性phermones起源,据报道在两个mirid物种,暗示一个守护伴侣的策略在这些家庭中可能还有其他物种(18,19]。我们的行为研究t . peregrinus没有任何吸引异性工作人员由性信息素,而是volatile-mediated男性吸引力对同种的男性。虽然这些雄性间的化学作用的常用的定义并不严格符合聚集信息素(两性吸引了),我们认为男性化合物在此报道,3-methylbut-2-enyl butanoate,可以被视为男性的聚集信息素,或者信息素成分。事实上,我们的结果表明,男性(一)气味吸引男性生活在Y-olfactometer生物(数字3(一个)和4(一)),(b)男性挥发性提取物(数字3 (b)和4 (b))和(c)合成3-methylbut-2-enyl butanoate(数字3 (c)和4 (c))。值得注意的是,包括我们所有的行为实验大肠tereticornis叶子的双臂嗅觉测量器。我们测试的吸引力对住昆虫用树叶防止昆虫干燥;因此,测试挥发性提取物和合成3-methylbut-2-enyl butanoate进行同样的,为了比较不同实验的结果。虽然吸引寄主植物的气味从我们的结果不能排除,叶子在嗅觉测量器武器的使用在我们的研究让一个独立的测试添加刺激。它仍然有待研究,然而,如果寄主植物挥发物玩一个额外的,在男性的吸引力可能协同作用。
(一)
(b)
(c)
最后,我们的嗅觉测量器测试与男性挥发性提取物显示一个age-dependant区别男性吸引力,因为一周大的男性并没有表现出明显的偏好(图3 (b))。然而,年轻男性的趋势是类似于年长的男性,和一周大的男性显然对合成3-methylbut-2-enyl butanoate(图3 (c))。因此,男性年龄的反应可能的影响需要进一步的调查。不过,有趣的是化学同时发表我们的研究数据显示,年长的男性产生更多3-methylbut-2-enyl butanoate比年轻人(马丁斯et al ., 2012年,这个问题),可以推测,一个生产和响应之间的相关性可能发生男性聚集信息素。这个聚集信息素的生态意义,其可能的应用程序管理t . peregrinus在桉树商业种植园,将进一步调查。
确认
作者希望承认由国家机构资助的研究和创新(ANII: pr_fsa - 2009 - 1 - 1522)和部分资金由国家农业研究所(INIA:格兰特FO6)。