文摘
苏云金杆菌生产晶体毒素被称为哭,对重要的农业是高度选择性和人类卫生害虫。哭与特定的受体蛋白质交互的造孔毒素敏感幼虫中肠细胞膜的毛孔,造成渗透压休克,最后导致昆虫死亡。在成孔的情况下特定于哺乳动物细胞毒素,死亡响应在低剂量可能诱导细胞凋亡或pyroptosis,根据细胞类型。哭毒素引起的死亡机制在昆虫中肠细胞了解甚少。在这里,我们分析还存在表达式通过rt - pcr分析,表明的最初反应Manduca sexta后中肠细胞低剂量Cry1Ab毒素管理包括一个快速和瞬态积累caspase-1信使rna,这表明pyroptosis激活了Cry1Ab毒素作为最初反应但后来压抑。相比之下,caspase-3信使rna需要更长一段时间的毒素暴露在被激活但呈现出持续激活,这表明细胞凋亡可能是诱导细胞死亡机制也在低剂量的毒素。
1。介绍
苏云金杆菌(英国电信)是杀虫产生包涵体由革兰氏阳性细菌δ内毒素的蛋白质,在孢子形成(1]。这些夹杂物的主要成分是水晶(哭)毒素,具有高度选择性的毒性对重要的农业和人类卫生害虫,但对哺乳动物无毒或其他生物2]。哭毒素分为孔隙形成毒素(击球)根据其能力,使毛孔在幼虫中肠膜造成渗透压休克,中肠细胞破裂,最后昆虫死亡(3]。
在哺乳动物细胞中,击球时重要的毒力因子,杀死真核细胞通过不同的机制,根据剂量和细胞类型(审查,请参阅[4])。在低剂量,细胞死亡发生在两个不同的机制:(1)细胞凋亡,以激活initiator-caspases (Cas) (Cas-2、4、8、9日,-10年和-12年)触发effector-Cas (Cas-3 6和7)分裂细胞基质。凋亡细胞的特性包括核和细胞质凝结和细胞碎片,Cas-3激活、DNA损伤,形成凋亡体(5)和(2)pyroptosis还存在激活为特征的炎症,如Cas-1、5和-11年,调解细胞死亡和炎症反应6]。细胞凋亡和pyroptosis死亡过程局限于一个离散的细胞群,认为侮辱和在某些情况下允许生物恢复。
击球时的一些例子,从而诱导凋亡的死亡反应,在低剂量使用时金黄色葡萄球菌Penton-Valentine杀白细胞素(PVL)触发Cas-9和Cas-3活动在中性粒细胞(7)和perfringens梭状芽胞杆菌肠毒素(CPE)诱导激活Cas-3或Cas-7 Caco-2细胞(8]。在内皮细胞链球菌引起的肺炎pneumolysin(厚度)诱发Cas-6、Cas-9 Cas-3 [9),在海拉细胞,英国电信parasoporin-1,激活Cas-3 [10]。激活Cas-1和pyroptosis一直在观察巨噬细胞治疗链球菌溶血素O物资货柜毒素链球菌细菌,厚度和炭疽毒素(11- - - - - -13]。结果表明:孔隙形成活动的击球是必要的诱导凋亡或pyroptosis反应,因为击球突变体孔隙形成的影响,toxin-knockout突变体,或生物体的击球大大减少了反义RNA的表达都无法引起这些反应(7,10,14- - - - - -16]。
在高剂量的击球时,细胞反应开始一个更严重的细胞死亡过程称为坏死和肿瘤病,例如,高剂量的CPE引发肿瘤病Caco-2细胞(8]。肿瘤病的特征是细胞和细胞器肿胀,膜起泡,膜透性的增加。肿瘤病导致损耗的细胞能量存储和失败的离子泵17]。
哭的毒素,没有报告研究细胞凋亡的诱导或pyroptosis陶醉鳞翅类昆虫体内的细胞死亡过程。唯一的报告的表达分析中科院-1在第三龄伊蚊caspius双翅类昆虫昆虫幼虫,显示激活的中科院1基因治疗后两个杀灭幼虫的细菌,英国电信和b . sphaericus(18]。我们工作的目的是探讨如果pyroptosis和凋亡细胞响应过程,被激活在活的有机体内在中肠细胞Manduca sexta幼虫在回应Cry1Ab中毒。在这里,我们表明,m . sexta幼虫中毒Cry1Ab引起的瞬时表达中科院1,在低剂量(LC25)和短时间。相比之下,cas-3长时间后诱导的毒素暴露在毒素的剂量也不同。我们的研究结果表明,m . sexta中肠细胞可能引起第一pyroptosis初始反应低剂量的毒素,然后,细胞凋亡被触发后更持续的模式还在低毒素剂量。
2。材料和方法
2.1。提取Crystal-Spore悬挂
英国电信窝藏pHT315-Cry1Ab菌株质粒(19)生长在30岁°C,在营养肉汤孢子形成媒介,补充了10μ克毫升−1红霉素,直到完成孢子形成(20.]。晶体相衬显微镜下观察和纯化如前所述21]。
2.2。Manduca sexta幼虫中毒
Cry1Ab应用到饮食中表面24-well板块(描述20.]。为了清晰起见,我们增加了35毫升的Cry1Ab水晶悬浮液,包含两个不同的毒素浓度(ng 1和2厘米−2),相应的致死浓度的LC25,信用证50如前所述(分别20.]。一旦表面完全干燥,新生儿first-instarm . sexta每口井的幼虫被添加,每剂使用24幼虫和时间(从0分钟48 h)为了分析的幼虫毒素的最初反应行动。两个实验都是共有48幼虫/治疗。摄食行为是同步的,因为第一个龄期幼虫很贪婪,并立即开始当转移到人工饲料喂养。
2.3。rt - pcr分析
总RNA分离中肠组织控制m . sexta或与LC与醉酒的幼虫25和信用证50Cry1Ab毒素的浓度在不同时间从0到48 h是用于互补脱氧核糖核酸合成之前报道22]。控制幼虫饲料有相同的饮食没有毒素除了在同一时间。简单地说,2μ克总RNA和500μ克的低聚糖(dT25) VN被用来合成cDNA 1μL(200单位/μL) Moloney小鼠白血病病毒Retroranscriptase (MoMLVRT)(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)。一个卷2μL的第一链cDNA反应是用于50 -μL PCR反应。引物cas-1Forward (5′CCA TTT ATT TTC AAT猫棉酚猫到达目标时间三大′)和cas-1Reverse (GGT TTA CCA GCA AGT GTG GGA-3′)或cas-3Forward (ACG亚美大陆煤层气有限公司TCG ATG亚美大陆煤层气有限公司CTC TGA 3′)和cas-3-Reverse (CAT TAA CCA手枪TTC GCG CTT颈- 3′)被用来放大m . sexta cas-1和cas-3分别的互补。Taq使用DNA聚合酶,进行PCR反应如下:(1)变性步骤,1分钟在94°C,(2)扩展一步,30 30秒的周期在94°C, 30秒58°C,和50秒在68°C,和(3)最终扩展,5分钟在72°C。一个5整除μ分析了L (PCR产品标准的琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色后观察。加载控制268 bp的rt - pcr产物核糖体蛋白S3(rpS3)(加入U12708)m . sexta使用rpS3-Forward也放大了,5′- 20 ATC GGA手枪猫猫猫GGC颈- 3′,5′rpS3-Reverse gca ACC GCG公司治理文化TTC AGA CTC颈- 3′引物。使用ImageJ mRNA带强度量化软件(http://rsb.info.nih.gov/ij/)。信使rna的相对量cas-1和cas-3量化使用参考相应的加载控制量(rpS3)。的感应折叠cas-1和cas-3后Cry1Ab毒素管理计算与控制幼虫,吃同样的食物和时间没有毒素。所有的数据集都做了两次,标准差的数据集计算和误差包含在数据中。
2.4。克隆和测序
后获得的PCR产物cas-1和cas-3上面所描述的那样被克隆到EcoR放大反应V限制pBCSK的网站+质粒(美国表达载体,加州卡尔斯巴德)和学院Biotecnologia测序,自治设施使用Taq FS染料终结者循环测序荧光技术测序珀金埃尔默/应用生物系统公司3730型音序器(ABI棱镜;美国加利福尼亚州卡尔斯巴德,AppliedBiosystems)。
2.5。系统发育分析
虚拟的翻译cas-1和cas-3基因序列的m . sexta是使用肌肉3.7对齐对齐(23]。校准包括Cas-1和Cas-3蛋白质不同鳞翅目、双翅类昆虫昆虫以及一些Cas-6 Cas-7, Cas-8被识别的双翅类的昆虫。最大似然树构造,用PhyML 3.0版(24)引导500复制。
3所示。结果与讨论
3.1。隔离m . sexta caspase-1和caspase-3基因
获取m . sexta cas-1和cas-3基因序列,的Bombix森基因序列的中科院基因被用作模板搜索同系物的EST序列库m . sexta存入http://www.agripestbase.org/。
当cas-1序列从b .森(加入AF448494)被用作查询,包含一个完整的DNA叠连群假设cas-1的m . sexta有80%的身份,b . mori cas-1查询得到(ctg7180001044351)。另一方面,使用b . mori cas-3序列作为模板(加入AAW79564), DNA片段重叠群m . sexta身份(ctg7180001055914) 40%b . mori cas-3被确认。
推导出开放阅读框m . sexta cas-1编纂289氨基酸残基的部分cas-3基因154残留。对齐的鳞翅目、双翅目半胱天冬酶蛋白碎片,包括催化领域显示催化二分体、半胱天冬酶家族的特征,是守恒的。在m . sextaCas-1,催化一对对应于他的119年和半胱氨酸174年残留。H和C催化残基m . sextaCas-3部分蛋白质序列也守恒(图1)。
3.2。Cas-1 Cas-3蛋白m . sexta幼虫属于两个独立的系统组守恒Lepidotera和双翅目之间
获得更好的图像之间的关系m . sextaCas-1和Cas-3蛋白质与其他生物,最大似然系统发育树构建。树包括代表Cas-1从不同的鳞翅目、双翅目和Cas-3蛋白质生物以及一些Cas-6 Cas-7 Cas-8原型和双翅类昆虫昆虫(图2)。Cas-1和Cas-3序列都聚集在两个独立的系统发育树的分支,指示m . sexta序列用于这项工作被正确识别。每个Cas-1和Cas-3演化支,反过来,分开两组:一组包含Lepidotera蛋白质和其他那些属于双翅目蛋白质。鳞翅类蛋白质包含的Cas-1集团b .森(Q8I9V7),Spodoptera frugiperda(P89116),小菜蛾(D9IVD4),Trichoplusia倪(B6EEC1),Helicoverpa armigera(A7L9Z3),双翅类昆虫组包括黑腹果蝇(O01382),这种致倦库蚊(B0W0K2),有明显(B5AK94) Cas-1相关蛋白质激活细胞因子在炎症。Cas-3组双翅类昆虫序列包括序列埃及伊蚊(Q178B6),这种致倦c .(B0WZJ4),d .腹(Q7KHK9),而鳞翅类组包含两个Cas-3序列b .森(Q2HZ04和Q2HZ05)相关的细胞凋亡(25]。我们还添加了一些其他的半胱天冬酶蛋白质分析,如Cas-6d .腹(Q9NHF9) Cas-7按蚊stephensi(Q86FL0),和两个发起者Cas-8序列,一个来自一个。冈比亚按蚊(Q5TMK1)和其他Ae。蚊(Q16H55)都聚集在不同分支从Cas-3 Cas-1(图2)。
3.3。Cry1Ab中毒引发cas-1和cas-3表达m . sexta幼虫中肠
得到的反应的新见解m . sexta中肠细胞Cry1Ab中毒,我们的表达模式进行了分析cas-1和cas-3分别作为pyroptosis特征和细胞凋亡。m . sexta幼虫被处理两种不同剂量的Cry1Ab毒素。25%的致死浓度和媒介致死浓度计算第一龄m . sexta幼虫饲料7天与不同浓度的毒素Probit统计分析。然后,我们使用低剂量,ng 1厘米−2(对应于信用证25ng)和中等剂量,2厘米−2(对应于信用证50)研究的最初反应M sexta后中肠细胞摄入的毒素。m . sexta幼虫饲料相同的饮食没有污染Cry1Ab毒素,被用作控制在每一个时间进行了分析。rt - pcr的方法被用来监控cas-1和cas-3基因表达和内部加载控制rpS3也进行了分析。预测的中科院- - - - - -1和中科院- - - - - -3互补脱氧核糖核酸的大小是440元和243元,分别。的互补产品通过rt - pcr、克隆,测序以证实自己的身份。图3显示了rt - pcr电泳模式的代表cas-1和cas-3获得控制幼虫毒素剂量和治疗后不同。这图也显示了rpS3加载控制。琼脂糖凝胶上的数字代表像素的数量在每个信使rna乐队确定扫描光密度的乐队。
利用rt - pcr分析的表达cas-1和中科院-3针对Cry1Ab中毒。在面板的图4,我们显示的相对表达水平cas-1和cas-3在控制和毒素中毒幼虫不同时间带强度的分析cas-1或cas-3rt - pcr数据带强度的本构rpS3控制在相应的时间和毒素的剂量。rt - pcr分析表明,这两个表达式cas-1和cas-3表情略诱导控制幼虫在时间框架的分析,都在哪里cas-1和cas-3显示两个感应喂养在正常饮食(图48 h后4(a))。
(一)
(b)
与Cry1Ab醉酒的幼虫,结果表明cas-1只是诱导低剂量Cry1Ab管理后,展示高水平的中科院-1 mRNA比控制饲料喂养的幼虫30分钟和2 h后m . sexta用信用证25Cry1Ab表面污染的饮食(图4(一),上半部分)。的cas-1mRNA表达被压抑在长时间的潜伏在这毒素剂量和在任何时候都与高毒素剂量中毒后,信用证50(图4(一)上半部分)。值得注意的是,幼虫看起来健康过程中实验。相对于中科院3 mRNA表达,我们发现这信使rna也诱导摄入低剂量的毒素,但需要长时期的毒素管理完全激活(图4(一)、较低的面板)。在信用证50毒素剂量,cas-3信使rna只有与毒素诱导2 h后喂养。有趣的是,这种基因并没有显示出清晰的镇压在长时间与毒素中毒剂量甚至在48 h。的感应cas-3信使rna依赖毒素剂量,是更高的信用证25而不是一个信用证50毒素剂量(图4(一)较低的面板)。幼虫看起来苍白比控制在48 h与LC喂养幼虫50毒素剂量,但没有观察到幼虫死亡如预期,因为信用证50值对应的剂量能杀死50%的幼虫中毒后7天。
在面板B的图4,我们的分析褶皱的表达的变化cas-1和cas-3信使rna后Cry1Ab摄入相对于控制幼虫再辅以noncontaminated饮食。在这个图中,很明显,最高的表达cas-1为了应对Cry1Ab 30分钟后观察中毒中毒LC25显示1.5折感应,然后它的表达式cas-1基因是压抑的24 h后摄入的毒素以及更高的信用证50剂量的毒素管理,被压抑的所有测试的时候,相比与美联储控制幼虫正常饮食(图4(b),上半部分)。相比之下,的表达cas-3信使rna显示一个2.3折的感应控制幼虫中毒LC后2 h25毒素剂量(图4 (b)、较低的面板)和一个折叠感应与LC 2 h后中毒50毒素的剂量。的表达cas-3信使rna没有显示一个明确的压迫与控制幼虫相比,在本研究的时间框架(图4较低的面板,(b))。
总之,两个不同的毒素剂量Cry1Ab,信用证25和信用证50在这项研究中,使用分析的最初反应m . sexta幼虫毒素中毒。在这项工作中,我们识别假定的cas-1和cas-3基因的m . sexta幼虫和分析他们的表情在活的有机体内在昆虫中肠组织的与Cry1Ab毒素中毒。正如上面提到的,炎症Cas-1和效应器Cas-3激活涉及不同的程序性细胞死亡反应,分别命名为pyroptosis或凋亡。在蚊子的幼虫,它被描述,Cas-3蛋白酶激活后与疟原虫入侵中肠细胞疟原虫存在和p .鼠表明中肠细胞死亡在疟疾动合子的渗透与凋亡过程(26]。在其他报告,表明Cas-1调制和Cas3在中肠组织的Heliothis virescens而在Periplaneta美国的激活与程序性细胞死亡在变形或饥荒期间,分别为(27,28]。
我们的研究结果表明,m . sexta幼虫触发pyroptosis作为最初反应与低剂量的Cry1Ab中毒,这表明这个过程可能参与作为一个防御机制在这种情况下,这个反应是抑制毒素的长时间摄入或在较高剂量的毒素(图4)。对于其他孔隙形成毒素,如厚度,SLO,致命的毒素炭疽杆菌,结果表明,这些毒素Cas-1激活巨噬细胞促进细胞死亡虽然pyroptosis [11- - - - - -13]。Cas-1-deficient巨噬细胞更能抵抗SLO毒素引起的细胞死亡(12]。相比之下,的表达cas-3在m . sexta醉幼虫表明细胞凋亡可能扮演一个角色,再乘以Cry1Ab毒素后管理和可能存在在更高的毒素剂量显示比Cas-1持续激活。这些结果与PVL毒素或相似α溶血素产生的大肠杆菌在中性粒细胞激活Cas-3表达,诱导细胞凋亡,monocyes和巨噬细胞在使用时sublytic浓度(7,15),或CPEc . perfringens这也引起典型的凋亡细胞死亡在哺乳动物的低剂量Caco-2细胞通过激活Cas-3 (15]。
对于更高的剂量Cry1Ab中毒,据报道,细胞死亡是由肿瘤病Trichoplusia倪H5卵巢癌细胞株表达m . sextaCry1Ab钙粘着蛋白受体。这些作者表明,广谱Cas抑制剂z-VAD-fmk不抑制细胞死亡在这些细胞,这表明Cas依赖反应如pyroptosis或细胞凋亡没有激活与高剂量Cry1Ab毒素细胞系(29日]。
这还需要进一步的研究来分析Cas-1活动激活免疫反应的作用,低剂量管理Cry1Ab毒素m . sexta幼虫。同样,Cas-3的作用在低剂量激活凋亡反应还有待分析。此外,这将是理想的分析具体的影响半胱天冬酶抑制剂的毒性Cry1Ab来确定这些程序性细胞死亡反应的潜在作用生存哭毒素中毒。
确认
作者感谢莉兹白卡布瑞拉的技术支持,Eugenio Lopez-Bustos和保罗Gaytan寡核苷酸合成,豪尔赫Yanez测序。这项工作是支持在128883年CONACYT部分中,农业部cre 2008 - 03980, DGAPA IN218610