文摘

本文表明灭活百日咳博德特氏菌(iBp)可以提高大鼠的肺气道代敏化,与卵子的挑战。cAMP-PDE活动的机制参与upregulation PDE4A, PDE4D, PDE3基因表达在肺部。但只有PDE4活性不同的卵子,卵子+后备组之间,和PDE4D表达显著增加仅在iBp老鼠。因此,我们的数据表明,cosensitization卵子和iBp影响肺气道反应性通过调节肺cAMP-PDE活动和PDE4D基因表达。

1。介绍

灭活百日咳博德特氏菌(iBp)已经被用来作为强大的Th2佐剂提高过敏反应的抗原,如屋尘螨抗原(HDM)、卵清蛋白(OVA),和花粉在哮喘过敏动物模型从1968年(1- - - - - -4]。系统性管理后备增强了这些敏化过程和提高肺和系统性免疫反应在本地管理HDM [5]。我们的实验也表明,同时接触卵子和肌内iBp可以增强支气管高反应性6]。但是这发生在分子水平上尚未阐明。

磷酸二酯酶(PDE)总科参与唯一的细胞通路降解无处不在的胞内第二信使。它由11个生化和药物不同的酶的家庭(pde 1 - 11)水解营地和/或cGMP [7]。PDE4特定阵营和包括四个亚型(A, B, C, D)。它主要是表达和扮演重要的角色在炎症和免疫调节细胞功能细胞。已经有显著的兴趣PDE4抑制剂作为一个潜在的治疗炎症性疾病,如过敏和哮喘8]。环腺苷酸(cAMP)松弛气道平滑肌的肺。我们之前使用iBp佐剂研究表明PDE4是调节过敏小鼠的肺6]。但是否佐剂对PDE活性和表达的影响还不清楚。

越来越多的证据表明,D亚型PDE4-PDE4D在平衡中扮演着重要角色在气管平滑肌松弛和收缩(9]。PDE4D-deficient小鼠气道平滑肌收缩性的破坏,不再对胆碱能刺激(10]。有趣的是,动物先天而不是后天暴露在香烟烟雾显示一个气管内的注射后的气道高反应增加来自烟曲霉属真菌提取。这个增加是有因果联系气道高反应减少肺营水平,PDE4酶活动增加,PDE4D isoform-specific mRNA表达在肺11]。

因此,我们着手调查的影响卵子和后备气道反应和可能的磷酸二酯酶的作用。我们的研究表明,航空公司的反应是不同卵子与iBp模型(卵+ iBp)和卵子模型没有后备(卵子)。有趣的是,PDE4D表达也增加肺的过敏老鼠使用iBp佐剂,虽然这个结果中没有观察到大鼠过敏不使用iBp佐剂。因此,我们的研究首次提出,PDE4D upregulation被iBp诱导,参与气道高反应性。

2。材料和方法

2.1。动物模型制备(12]

男性Sprague-Dawley老鼠(140 - 160 g,浙江大学医学院实验动物中心,杭州,中国)下保持24小时光/暗周期与食物和水随意。动物治疗按照美国国立卫生研究院的指导实验室动物保健和使用的。动物实验是由浙江医学实验动物管理委员会批准。

老鼠被皮下注射致敏(1毫升)包含0.2%的生理盐水悬架卵子(σ,圣路易斯,密苏里州)和10%氢氧化铝为两脚架,脖子,背,腹股沟(0.1毫升)和腹部(0.5毫升)0天,有或没有2×10的肌内注射¹⁰heat-killedb .百日咳(后备;1毫升)到突起物。其他老鼠敏化与卵子但没有iBpinjection之上。从第14天致敏后,这些老鼠挑战为7天每天一次20分钟的接触产生的卵子雾化1%盐水喷气式喷雾器(同等的主人,帕里GmbH,施塔恩贝格,德国;液滴直径:1 - 5μ米)。b .百日咳控制(iBp)老鼠收到2×10的肌内注射¹⁰iBp(1毫升)。空白控制老鼠“敏感”和“挑战”盐气溶胶。

2.2。测量(AHR)[气道高反应13]

老鼠是气管插管麻醉后聚氨酯(40毫克/公斤),然后放在一个全身肺阻力测量体积描记器()和肺动态顺应性(Cdyn)实时数据分析系统(MedLab生物信号采集系统V 5.0, Medease科学技术有限公司南京,中国)。稳定5分钟后,被暴露于醋甲胆碱诱导气道高反应性气溶胶(妇幼保健,西格玛化工有限公司,圣路易斯,密苏里州)增加剂量(0.2,0.4,0.8,1.2,1.6,2.0,4.0,8.0,12日和16 g / L)通过气管插管10年代飞机喷雾器。将压力传感器的信号被拟合连续加工流程,体积,运动方程和压力。和Cdyn监控5分钟和最大变化的基线为每个参数都被记录下来。十到十五分钟之间的间隔被允许浓度。

2.3。制备支气管肺泡灌洗液体(BALF)

最后一个卵子的挑战后,老鼠与氨基甲酸乙酯麻醉(2 g / kg, i.p)。支气管肺泡灌洗是由轻轻地灌输D-Hanks入肺的解决方案通过气管导管撤军紧随其后。这个过程重复三次的总量5毫升D-Hanks。总BALF细胞计数与血细胞计数器测定。细胞颗粒的幻灯片是沾染了赖特的污点;中性粒细胞,嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞在每个幻灯片被记录。每个样本中细胞总数然后决定根据BALF的体积恢复。

2.4。组织学检查

肺通过气管注入1毫升10%中性的福尔马林和七天沉浸在同样的固定剂。组织蜡膜,5μ米部分被削减和沾)检查光显微镜下细胞浸润。炎性细胞浸润及支气管旁炎性细胞数量被用来评估其严重性。

2.5。化验cAMP-PDE和cGMP-PDE活动(14]

21天,动物被牺牲了,肺都被立即删除,在液态氮冷冻,然后储存在−80°C到分析。冷冻的肺被解冻,并切成小方块。在100年25毫克的肺是均质μL冰冷的30毫米的玫瑰(pH值7.4)包含Triton x - 100年的0.1%。PDE测定混合物(200μL) PBS (pH值7.4)包含137毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,8.8毫米Na₂HPO₄,1.5毫米KH₂阿宝₄1毫米CaCl₂1毫米MgCl₂,1μM营地或1μM cGMP(σ),肺匀浆。PDE反应开始的10μ左肺匀浆和执行在37°C 10分钟。的反应是停止沸腾3分钟的混合物。测定混合物冷却在冰上,紧随其后的是离心12850×30 gμ敏在4°C。营的数量或cGMP中高效液相色谱法测定上清液(海波西尔ODS 4.0×250毫米;惠普,帕洛阿尔托,CA)使用标准曲线。PDE抑制剂,茶碱(非选择性),rolipram (PDE4-selective) SKF94836 (PDE3-selective),和敏喘宁(PDE5-selective),被用来抑制PDE活性和分析组件PDE活动的肺。总之,100年μM PDE抑制剂添加到PDE测定混合物如上所述,然后与肺匀浆混合。其余的过程如上所述。总数量的蛋白质是由布拉德福德方法使用BSA作为标准(15]。PDE活动的结果表示为nanomoles每毫克的蛋白质。

2.6。PDE亚型mrna分析

从每个组织总RNA被隔离在液态氮冷冻使用试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)。准备的第一链cDNA老鼠和总RNA进行使用合成第一链cDNA工具包(上海Sangon生物工程技术和服务,上海,中国)和优势RT-for-PCR工具包(Clontech,帕洛阿尔托,CA),分别。PCR引物组PDE都是列在表中1。每个PCR引物组能够检测所有已知变异来源于适当的PDE基因。进行PCR扩增的PCR缓冲(10毫米Tris-HCl, pH值9.0,100毫米氯化钾,80毫米(NH)₄)₂所以₄,0.1% NP-40)包含每个核苷酸的0.2毫米,1.5毫米MgCl₂500 nM的底漆,1 U的Taq DNA聚合酶(Sangon) 25的总量μL 30周期,用下面的循环参数:变性,45秒94°C;退火,58°C 70秒;和扩展,72°C 2分钟。PCR扩增后,8μl解决了每个反应混合物含有溴化乙锭1.5%琼脂糖凝胶上电泳,和PCR产物乐队量化使用UVP凝胶文档系统(UVP高地,CA)。PDE mrna计算相对的水平肌动蛋白。它是确定的,那就是在这些条件下的PCR产品积累没有达到高原水平(数据没有显示)。

2.7。统计分析

数据表示为±SEM。统计分析了单向方差分析(美国以SPSS11.0)评估PDE活动,PDE mRNA表达和肺阻力,和动态合规。差异与被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。肌内iBp气道高反应性增强了

基线值之前气溶胶挑战与妇幼保健相似控制老鼠,卵子敏化和挑战老鼠iBp作为佐剂(卵+ iBp),独自iBp (iBp)和卵子激活和挑战老鼠没有后备(卵子)。在基底没有明显差异和Cdyn组。吸入妇幼保健存在剂量依赖的相关性引起的支气管收缩,在60年代达到顶峰。在我们的过敏性哮喘大鼠模型中,卵子敏感和挑战Cdyn大幅减少和增加造成的而控制老鼠(图1)。同时接触卵子和肌内iBp增强Cdyn的减少和增加在低浓度的妇幼保健,但在高妇幼保健的浓度,卵子,卵子的反应+后备组相等。有趣的是,一个单一的iBp注入类似于卵子敏化产生影响和挑战。

3.2。肌内iBp增加BALF中嗜酸性粒细胞

探讨分子机制鼠模型之间的差异,我们使用另一个系列的老鼠研究BALF和肺。细胞的总数(表2)和BALF中嗜酸性粒细胞增加卵子+后备和卵子组,相对于控件()。同时,总白细胞的数量,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞在BALF从卵+后备组明显高于卵巢组。虽然iBp groupshowed总数与空白对照组相似,嗜酸性粒细胞,中性粒细胞显著高于空白控制。

3.3。同时接触卵白蛋白和肌内iBp增强cAMP-PDE活动

PDE调节肺,卵子敏感和挑战有或没有后备显著升高cAMP-PDE活动,导致2.5倍或者2倍比正常动物的活动,虽然卵子,卵子+后备组之间的差异没有统计学意义(图2(一个))。但iBp并不影响cAMP-PDE活动;相当于正常水平控制。总cGMP-PDE活动在正常控制和卵巢组织高,而在卵子+ iBp iBp团体活动减少(图2 (b))。

进一步确定哪些PDE亚型总PDE活动中扮演着重要角色,我们使用了茶碱(非选择性PDE抑制剂),rolipram (PDE4抑制剂),SKF94836 (PDE3抑制剂),和敏喘宁(PDE5抑制剂)来确定每个亚型的整体PDE活动。Rolipram (100μcAMP-PDE活动(即美元)敏感。,PDE4 activity) was 1.4-fold or 1.6-fold higher in the OVA or OVA+iBp rats than in normal rats (Figure3 (d))。这些结果表明,增加总cAMP-PDE活动卵子敏感和挑战主要是由于upregulation PDE4。敏喘宁(100μcGMP-PDE活动(即美元)敏感。,PDE5 activity) was the major resource of cGMP-PDE activity, but the OVA or the OVA+iBp rats were similar to normal rats (Figure4 (c))。

3.4。肌内iBp增强PDE4D的mRNA表达

调查PDE活动的高度是否由于PDE亚型基因表达增强,我们测量肺mRNA水平的亚型PDE1 PDE11控制,卵子,卵子+ iBp, iBp老鼠。没有明显变化的表达pd - 1, 2, 9, 10, 11(数据未显示)。的表达pd 3、4、4 d, 5, 7, 8是调节卵巢+ iBp老鼠。尽管PDE4A和PDE4D在卵巢+ iBp老鼠显著增加,卵巢或iBprats PDE4A没有增加,而同时暴露于卵子和肌内iBpenhanced PDE4A表达式。有趣的是,在iBprats PDE4D的表达显著增加,而在卵巢组织并没有增加。这表明iBpspecially调节PDE4D(图5)。同时,这个结果还暗示cAMP-PDE活动增加可能是由于增强PDE7 PDE8基因表达,同时暴露在卵子和后备,至少在部分。

PDE3和PDE5是复杂的表达。在卵巢组织,PDE5表达下调。有趣的是,在后备老鼠,PDE5显著增加,而在卵子+ iBp集团PDE5表达水平位于中间的卵巢组和卵巢+后备组。PDE3在卵子或后备组调节,而在卵子+ iBp PDE3组明显低于卵子或后备组。这表明iBp专门调节PDE5,没有显著差异。

3.5。同时接触卵子和肌内iBp增强嗜酸性粒细胞的浸润

肺组织学,渗透嗜酸性粒细胞增多观察支气管旁和血管周围组织的卵子,卵子+后备组,后者更多的嗜酸性粒细胞。在后备组,肺组织学与正常对照组相似(图6)。

4所示。讨论

灭活b .百日咳一直被用作有效的佐剂诱发IgE应对各种抗原在实验动物,同时也是一个抗原(16- - - - - -19]。由于这种特性,iBp也被用于动物模型HDM过敏症增加过敏反应,卵子和花粉。早在1980年,巴特尔和会先显示政府的b .百日咳疫苗的老鼠与受损的发展有关β肾上腺素能受体响应能力和在许多方面类似于人类哮喘。异丙肾上腺素的松弛剂效应在气管平滑肌隔绝受损b .百日咳。接种小鼠(20.]。此外,Giembycz建议β2-adrenoceptor脱敏是基于加速退化营地的磷酸二酯酶(21]。最近,不仅香等人建议PDE4D是不可或缺的组成部分β2-adrenoceptor信号复杂但还强调了亚细胞营地监管的关键作用的复杂控制受体信号(22]。iBp所以,我们认为,政府将与upregulation PDE4D活动和相关的表达式。

这里描述我们的过敏模型提供了一个实验系统,可用于进一步研究的潜在作用iBp过敏和哮喘的发展。这项研究还证实了iBp的功能。随后的肺抗原后的挑战,presensitized动物显示许多过敏性哮喘的特征包括支气管高反应性的增加,嗜酸性粒细胞的炎症反应,和粘液生产。这些数据表明,iBp提高敏化过程。iBp早就知道引起气道高反应性(23,24),但这种影响的机制还不清楚。iBp的影响可能是由于脂多糖(LPS)或百日咳毒素。重要的是,两者都是toll样受体受体激动剂4但有不同的下游效应。

在目前的研究中,我们调查了PDE调节肺的卵子+ iBp,卵子,iBp老鼠。卵子敏感和挑战增加了cAMP-PDE活动可能主要是由于upregulation PDE4 PDE3,但减少cGMP-PDE PDE5的差别可能主要是由于对这些活动。没有显著的贡献iBp cAMP-PDE活动和cGMP-PDE活动;这个结果符合组织学和BALF的变化就越少。iBp的主要贡献是,气道高反应性,而不是炎症。我们的数据表明,b .百日咳明确气道高反应性增强,特别是增强了PDE4活性和PDE4D表达式。

监管PDE4的过敏和哮喘许多团体已经进行了调查,但只有在人体血液白细胞,和数据是不一致的。有些团体公布PDE4活性显著增加哮喘或过敏患者25- - - - - -29日),而其他人没有发现显著差异在酶活性等病人与健康人相比(30.- - - - - -33]。PDE4B参与炎症过程的航空公司(34]。唯一的其他重要PDE4迄今为止已知基因诱导物是脂多糖(LPS),特别是激活PDE4B基因在单核细胞/巨噬细胞(35,36]。然而,在肺部过敏的老鼠,PDE4A和PDE4D基因的表达,而不是PDE4B基因,是调节,这表明这些基因的表达可能会引起一种机制(s)或有限合伙人机制不同于那些营地。我们的结果显示upregulation PDE4的肺部过敏老鼠支持使用PDE4抑制剂在哮喘。因此,如果PDE4在哮喘的发病机制中发挥作用,肺PDE4可能一样重要,如果不是更重要,白细胞PDE4。各种PDE4已知亚型表达在不同组织和发挥独特的生物学作用。PDE4B是主要的亚型在血液中性粒细胞和单核细胞37但不是在肺,这或许可以解释不变PDE4B mRNA的表达。

有趣的是,PDE4D基因表达在iBp老鼠特别增加了。所以我们认为PDE4D和后备之间的关系。PDE4A参与炎症过程的航空公司(34]。PDE4D基因参与呕吐(38),这限制了PDE4抑制剂的治疗用途。同时,PDE4D还参与PDE4D-null小鼠气道高反应性,不再对胆碱能刺激产生反应,并暴露于抗原是废除(气道高反应性11]。此外,动物先天而不是后天暴露在香烟烟雾增加展出与PDE4D mRNA表达有关肺气道高反应性(12]。最近,PDE4D已被证明在血管疾病发挥重要作用,包括中风(39]。这些发现表明PDE4D基因在疾病的发展中扮演着重要的角色。如何受益于PDE4D和避免不利的呕吐的效果仍然是一个重要的问题。

总之,我们的结果表明,灭活b .百日咳特别是诱发PDE4D表达式和气道高反应性,而不是诱导炎症肺和移植的总PDE活性。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢教授IC布鲁斯(浙江大学医学院、浙江、中国)的修改。这项工作是支持的浙江省自然科学基金(Z204198),中国国家自然科学基金(81170536,81170536),和年度安徽省(1301043040)的科学项目。