文摘
我们调查的机制肋膜滑石(TP) 20复发性恶性胸腔积液患者和10良性的胸腔积液患者。我们测量之前和TP,找到后6 h引发水平显著增加三倍(2.26 ng / mL 0.1±0.7到6.5 ng / mL),这也解释了这些患者的炎症细胞的招募。我们假设TP支持通过刺激分泌FGF的间皮的细胞(MS)。显著增加了十倍,FGF-b (0.05 ng / mL 0.6±0.02到0.44 ng / mL)被视为后24 h滑石滴剂()。为了检查是否FGF-b分泌细胞女士,女士从瑞士法郎复发性胸腔积液患者培养48 h浓度增加的存在与否滑石(从100 ng / mL到1毫克/毫升)。他们产生显著水平的FGF-b以剂量依赖的方式()。肋膜我们假设一个成功包括炎症细胞的早期增强招聘通过增加引发随后登记submesothelial空间通过增加的成纤维细胞间皮的FGF-b生产。
1。介绍
在癌症患者复发性胸腔积液是一种常见的问题,显著影响他们的生活质量。几个姑息治疗方案可用于恶性胸腔积液复发癌症病人化疗不回应,反复胸腔穿刺术,肋膜或化学。肋膜最广泛使用的技术是基于硬化性代理到胸膜空间的滴注法。治疗目标在恶性胸腔积液患者症状的管理是实现有效的胸膜硬化。sclerosant代理的目的是刺激胸膜和诱导间皮的细胞脱落和随后的顶叶和内脏表面之间的粘连形成。虽然代理必须刺激物的属性,它需要限制甚至消除负面影响病人。几个硬化性制剂用于临床实践,其中强力霉素、米诺环素、四环素、博来霉素、顺铂、依托泊苷、氟尿嘧啶、干扰素β,棒状杆菌以及孢子。滑石长期副作用最小,它被证明是最有效的预防复发(代理1]。肋膜的机制尚未完全清楚。弥漫性胸膜炎症和纤维蛋白沉积在胸膜联合的成功被认为是有影响力(2]。在动物实验中,组织学分析talc-treated肋膜[2]显示中性优势在24 h,紧随其后的是单核细胞浸润到胸膜下结缔组织矩阵和周边空域的肺。在第七天,单核渗透是伴随着成纤维细胞和胶原蛋白。Rodriguez-Panadero et al。3)有显著提高中性粒细胞计数的肋膜胸膜液体从病人的治疗是成功的。不清楚的存在增加了中性粒细胞在胸膜空间有助于胸膜联合的成功,但它确实表明,中性招聘的第一步是至关重要的。炎症的到来吞噬细胞通过释放趋化因子介导的细胞因子激活间皮的细胞(4]。事实上,间皮的细胞的能力由LPS刺激后释放趋化因子,il - 1、TNF -α据报道(4]。胸膜腔积液继发于各种疾病与不同的炎症细胞的存在相关联,但胸膜粘连的形成是缓慢而粘附后滑石和其它硬化性剂的滴注法。四环素,广泛应用在过去的硬化剂,增加引发,为成纤维细胞(中性粒细胞growth-factor-like活动的优势和释放5,6]。高效纤维蛋白的沉积在胸膜恶性肋膜积液诱导空间极为有限。相比之下,积液损伤和炎症引起的纤维蛋白的沉积往往被证明(7- - - - - -10]。由Kuwahara等人提出,胸膜损伤后胸膜纤维化的发病机制是通过纤维母细胞招聘胸膜间皮的网站的损害细胞(11]。这些研究人员使用纤连蛋白chemotaxin和他们进步的时间增加纤维母细胞化学引诱物活动胸膜间皮的细胞在96 h的文化。这分泌间皮的细胞来源成纤维细胞化学引诱物可能发挥作用的响应胸膜损伤和胸膜纤维化的发病机制(11]。成纤维细胞在纤维蛋白血纤维蛋白肽形成刺激当地的间皮的再生和扩散所示由格里菲斯et al。12]。纤维蛋白和胶原蛋白沉积在胸膜结缔组织和胸膜腔内粘连Hurewitz等人报道了之后慢慢灌输肋膜四环素和强力霉素(13]。他们还显示,成纤维细胞是主要的炎性细胞在肋膜尸体解剖2周后成功的兔子。增强扩散石棉暴露后的成纤维细胞(14和四环素15也被报道。
肋膜滑石尚未划定的机制,提高许多悬而未决的问题。滑石的角色在肋膜过程局限于一个刺激物(异物)效应,仅仅诱发炎症还是有直接影响间皮的和成纤维细胞细胞吗?间皮的细胞的激活的炎症过程关键招聘和成纤维细胞的增殖,并负责纤维母细胞增殖的细胞间皮的吗?间皮的细胞从癌症患者对滑石相同程度的间皮的细胞从正常课程?
1.1。临床意义
在疾病的发展,癌症患者患有复发性胸腔积液,危及他们的生活和显著降低他们的生活质量。他们需要的医疗支持,经常需要立即治疗。尽管肋膜talcage是有效的,它会导致副作用和发病率。通过了解滑石生产的纤维化的过程,我们将能够防止大部分的副作用和降低受伤的风险已经损害患者的健康。
肋膜我们假设成功诱导包括级联机制中存在早期增强招聘胸膜的炎症细胞通过分泌趋化因子(主要是引发)的空间。这个炎症“汤”允许登记和成纤维细胞的增殖submesothelial空间复数空间由纤维母细胞生长因子的分泌生产间皮的细胞。这些步骤引起的直接和主要由滑石。
2。方法
2.1。临床协议
2.1.1。研究人群
20复发性恶性胸腔积液患者和10例良性的胸膜腔积液。遵循病人在住院期间talcage过程和出院后门诊肺和肿瘤诊所。胸部x光检查执行之前和talcage后不久,在排放之前。肺功能测试也talcage之前和之后执行。临床图表是用来跟踪任何失败的肋膜归纳。
2.1.2。胸腔穿刺术
执行诊断胸腔穿刺术在局部麻醉下,使用巴德* I-Cath静脉放置单元16号(英国诗人有限公司)通过三方连接注射器的活塞。
2.1.3。胸膜液检查
液细胞学检查通常,葡萄糖水平,LDH、蛋白质、胆固醇,和文化。从诊断胸膜液体收集胸腔穿刺术talcage之前,立即在talcage后6 h和24 h和冻结在−70°C到细胞因子测量。
2.1.4。Talcage浆过程
通过管滴注法的滑石(浆过程)胸廓造口术(舍伍德医疗、爱尔兰)后执行完整的肺的扩张。两个2 g认证USP了无石棉滑石(生物学实验室,以色列)消毒在150°C和100毫升生理盐溶液在无菌条件下,执行和滴剂通过管子胸廓造口术在床边。2 h管夹和病人进行旋转动作。排水监测和卷记录直到排水低于150毫升/ 24小时此时胸廓造口术管可以提取16]。
2.2。在体外协议
2.2.1。il - 1的中介
以下实验旨在澄清是否引发生产是主要由il - 1的激活。细胞从胸膜胸腔穿刺术是培养24 h RPMI 1640年的10%的边后卫存在与否的il - 1受体拮抗剂(1μg / mL / 106细胞)和滑石(1μg / mL / 106细胞)。上层清液收集引发测量。
2.2.2。滑石的研究
正常的间皮的细胞恢复棘手的充血性心力衰竭患者的胸腔穿刺术在同等浓度培养RPMI 1640年的20%的边后卫,直到融合。细胞生存能力测试通过台盼蓝染料排斥。Cytospin准备胸膜液细胞是由计数细胞之前文化cytospins和重组他们的浓度7.5×10−5FCS mix-cell /毫升rpmi - 20%。他们暴露于浓度梯度的滑石在无血清培养基浓度增加从100 ng / mL到1毫克/毫升24 h,以建立一个剂量反应曲线。上层清液离心后收集测量细胞因子和生长因子以去除多余的滑石和细胞。
2.2.3。细胞因子测定
引发人类纤维母细胞生长因子水平量化和夹层酶联免疫测定ELISA (R & D系统,美国)。
引发和hFGF elisa,平底的96孔微量滴定板涂上过量引发或hFGF小鼠单克隆抗体。胸膜液体从诊断胸腔穿刺术和浮层间皮的细胞培养基刺激系列稀释的滑石然后补充道。孵化后,删除了所有的蛋白质通过洗涤磷酸盐(PBS)和酶联多克隆抗体针对引发或hFGF添加。抗体结合的抗原固定在第一个潜伏期。底物溶液添加到井与PBS另一个洗后,。引发的存在或hFGF量化的光学密度(OD)通过比较样品与标准曲线。
2.3。统计分析
数据分析与SigmaStat统计软件包(美国苹果电脑,库比蒂诺,CA)和用平均数±标准差表示。组之间的差异意味着分析方差分析(方差分析),使用的Student-Newman-Keuls测试。数据被认为是具有统计学意义。
孤立的胸膜液细胞特征为胸膜间皮的细胞(pmc)。一般来说,大约500毫升的离心机transudative胸膜液体产量12汇合的3.5厘米直径5 - 12天内间皮的细胞培养皿培养时所描述的。间皮的细胞积极为波形蛋白染色,细胞角蛋白,透明质酸粘蛋白(17]。细胞形态学的定义通过相差显微镜检查有鹅卵石模式,和大量的微绒毛指出透射电子显微镜。所有细胞都是利用在第二段3.5厘米直径的培养皿。
3所示。结果
3.1。在恶性胸腔积液引发生产
我们发现胸膜液体从患有复发性恶性胸腔积液引发水平升高(4.52 ng / mL±4.4)相比,胸膜液体从非癌症患者获得良性的,非传染性的胸腔积液(0.2 ng / mL±0.4) ()(图1)。
3.2。肋膜滑石刺激引发的分泌在早期步骤过程
引发水平在恶性胸腔积液显示早期(6小时)显著增加三倍由于滑石滴剂(2.26 ng / mL 0.1±0.7到6.5 ng / mL)。(图2)。
3.3。滑石刺激支流间皮的细胞释放C-X-C Chemokine-IL-8
PMC文化刺激不同剂量的滑石(2到64毫克/厘米2)组织培养24小时的盘子。细胞生存能力被台盼蓝染料排斥和记录vi-intensity character-visual检查与相差显微镜检查。可行的细胞百分比表示为可行的细胞的细胞。PMC生存能力随滑石浓度增加而降低。PMC可行性的滑石浓度64毫克/厘米2是75%左右。培养间皮的细胞释放少量。
有一个重要的()增加了十倍,FGF-b水平(0.05 ng / mL 0.6±0.02到0.44 ng / mL)后24 h滑石滴剂(图3)。
此外,正常的间皮的细胞培养在体外滑石为了确定间皮的细胞是负责FGF-b水平上升后talcage:他们产生显著水平的FGF-b剂量依赖性的方式()(图4)。
4所示。讨论
在这项工作中,我们展示了细胞因子引发海拔在肋膜滑石的早期阶段相比,碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)增加在后面的阶段。我们还表明,胸膜间皮的细胞被部分或完全负责引发和bFGF高程。
目前考虑肋膜化学(18- - - - - -20.发起]表明,急性炎症反应在胸膜空间滑石管理后,大量的中性粒细胞和单核细胞与增加interleukin-8和其他细胞因子在胸膜液体。在接下来的步骤中,胸膜间皮的细胞分泌大量的bFGF刺激纤维母细胞增殖。成纤维细胞合成胶原蛋白,导致胸膜脏层和壁胸膜之间的粘连,和bFGF同时促进分泌的TGF -β和VEGF,强调了纤维化。
我们的研究结果表明,从恶性胸腔积液患者胸膜引发水平高于引发水平良性的患者,非传染性的胸腔积液()。我们还增加了三倍,引发talcage(在6小时后)。大量的调查表明,间皮的细胞积极贡献肋膜滑石的急性炎症过程。Genofre et al。21)评估的亚微观的特点积极胸膜重构与肋膜滑石和声明,滑石敏锐地引发一个突出的间皮的细胞损伤。
间皮的细胞暴露于滑石可以积极地产生促炎细胞因子,如引发(18,22),VEGF (18],和bFGF [20.]。马奇et al。19)表明,白细胞、中性粒细胞百分比和引发水平增加滑石曝光后在第一个24小时。Acencio et al。23]研究兔的急性反应胸膜间皮的细胞与滑石的挑战。培养兔胸膜间皮的细胞暴露在和评估生产引发的VEGF, TGF -β。在6小时,引发、VEGF和TGF -β水平由talc-exposed间皮的细胞显著增加,仍然可以提高到48 h。调查人员得出的结论是,胸膜间皮的细胞可能积极调解的主要炎性胸膜反应肋膜talc-induced注入,而VEGF和TGF -β1最初水平低,随着时间的增加。因此,我们的研究结果证实了其他研究数据的早期参与细胞因子引发talcage过程,诱发炎症细胞的招聘过程。
肋膜我们假设一个成功诱导包括炎症细胞的早期增强招聘通过胸膜的崛起引发其次是招生的成纤维细胞浓度submesothelial空间通过增加间皮的bFGF生产。我们发现的调节力bFGF在胸膜液体talcage后24小时,证实了上述假设。
bFGF肋膜被特征是成功的关键因素以及胸膜腔积液的形成。FGF家族的一员。这群分子,TGF相类似β总科,是多向性的监管者的细胞反应,参与多种多样的生物学功能,包括增殖、分化和伤口愈合。像TGFβ,bFGF也被卷入胸膜纤维化和可以刺激间皮的细胞增殖在体外和在活的有机体内。
我们推测,滑石诱发pleurodesis-fibrosis间皮的细胞分泌bFGF的直接刺激。我们建立了间皮的细胞培养从瑞郎CHF患者复发性胸膜积液和孵化用不同浓度的滑石。bFGF细胞水平产生显著的剂量依赖性的方式。这些结果支持数据的安东尼et al。20.)表明,滑石可以诱导释放bFGF细胞间皮的。胸膜液体bFGF程度更高的患者在肋膜肋膜滑石更有可能开发成功。增加纤维母细胞增殖刺激了孵化在胸膜液体从这些患者,这是减少antibFGF抗体。安东尼et al。20.肋膜]证明了滑石在一定程度上是由mesothelial-derived bFGF。此外,作者证明了广泛胸膜癌症患者和最小干预正常的间皮的数量有显著降低的bFGF胸膜液体相比,那些有限的疾病随后胸膜联合开发成功。这些发现表明,间皮的肋膜肿瘤是必要的成功(19]。最近的一项研究还显示,一个完整的胸膜间皮是至关重要的在调节肿瘤细胞的转移潜力胸膜内空间。恶性肿瘤细胞分泌血管生成因素,促进肿瘤的生长,内皮细胞扩散和侵犯周围组织的新生血管形成。Talc-treated胸膜间皮抵消这些影响通过释放血管内皮抑制素,这可能是一个抗血管生成因素负责肿瘤控制胸膜内空间和占恶性胸腔积液患者的改善临床结果成功肋膜滑石(24]。李等人。25)表明,滑石导致的肺癌细胞凋亡剂量和时间的方式。然而,这个过程是有选择性和备件正常间皮。
机制,决定了胸膜联合涉及不同的生长因子的作用,如bFGF和TGF -β,特别是血管内皮生长因子(VEGF)。里贝罗et al。26]研究VEGF封锁的急性效应对炎性细胞因子的表达和胸膜积液胸膜腔内注射兔子接受滑石或硝酸银。动物使用抗vegf抗体显示显著减少胸膜液体卷滑石或硝酸银后注入。引发水平、血管渗透性和宏观胸膜粘连分数也减少了在组织接受贝伐单抗。研究表明,贝伐单抗干涉胸膜炎症诱导的急性期硝酸银或滑石,增强VEGF的作用作为一个关键的中介在胸膜腔积液的生产。
特谢拉et al。27)评估抗vegf抗体(贝伐单抗)的影响引起的肋膜滑石或银在兔子:抗vegf抗体干涉肋膜诱导的代理,和抗vegf抗体抑制层胸膜之间的粘连。
总的来说,我们的研究结果提供实验证据,引发细胞因子水平升高在凌晨后胸腔积液滑石滴剂,这之前的外观在胸膜腔炎症细胞。肋膜Profibrotic生长因子bFGF水平增加24小时后成纤维细胞开始扩散时胸膜和生产胶原蛋白(19,20.),我们还发现,胸膜间皮的细胞分泌引发和bFGF。我们目前密切同意先前的别人的作品,结果显示居民之间的交互和炎症细胞和细胞因子和生长因子在肋膜期间组织纤维化的发病机制18,20.,22,23]。这些相互作用导致过度矩阵生产在胸膜腔与纤维化和瘢痕形成。虽然成纤维细胞牵扯胸膜纤维化的效应细胞,其他居民细胞,其中最重要的是,间皮的细胞,可能直接或间接地也发挥了重要的作用。
胸膜损伤和纤维化的特点是纤维蛋白过度生产。胸膜形成小腔演变成纤维蛋白粘连的影响下profibrotic介质,如bFGF和TGF -β,导致胶原蛋白的沉积和脏层和壁表面之间的粘连的形成。说明的具体步骤参与炎症和纤维蛋白肋膜营业额在胸膜损伤将导致更好的理解这一过程,为小说的发展硬化剂和潜在的临床应用。
至少有两个机械的途径可能参与talc-induced胸膜纤维化:(i)的产生细胞因子和炎症和(2)的生产生长因子刺激成纤维细胞增殖和胶原合成。bFGF被认为是最有效的profibrotic中介,但其他纤维发生的调解员的角色需要进一步研究肋膜目标。尽管胸膜纤维化的机制尚不清楚,最近的证据表明,他们可能与基因的upregulation profibrotic介质,如bFGF和TGF -β(28]。然而,需要进一步的研究来建立一个分子机制在胸膜纤维化的发展。
总之,肋膜滑石的后果是sclerosant滴剂,可以表现为弥漫性胸膜增厚和纤维化。尽管它的发病机制并不完全知道,很可能复杂的居民和炎症细胞之间的相互作用和profibrotic介质是胸膜纤维化的发展不可分割的一部分。人们普遍认为胸膜纤维化的主要靶细胞是胸膜下成纤维细胞,然而,我们的研究结果以及其他研究表明,间皮的细胞也可能扮演了一个重要的角色在这种疾病的发病机理,通过启动炎症反应和生产profibrotic生长因子。更大的理解这些生长因子可能允许的生物学治疗肋膜操纵这些细胞因子来创建和刺激胸膜粘连、纤维化。