文摘
背景。复发性细菌感染支气管扩张的发病机制中起着关键的作用,但是传统的微生物学的方法在许多情况下可能无法识别病原体。我们的特点,比较了肺囊性纤维化(CF)的细菌群落和non-CF支气管扩张患者使用文化无关分子的方法。方法。细菌基因16 s rRNA图书馆是由肺组织10 non-CF支气管扩张和21 CF患者,紧随其后的是DNA测序每个库的隔离。社区的特点进行了分析和比较两组之间。结果。广泛的细菌多样性检测两组,与1 - 21细菌类群在每个病人。假单胞菌在两组最常见的属,包括49%的序列检测并控制数值在13个病人。虽然假单胞菌似乎是占主导地位的CF患者往往比non-CF病人,分析整个细菌社区不确定这两个团体之间的显著差异。结论。我们的数据表明重要的肺部细菌群落多样性的CF和non-CF支气管扩张患者和建议手术切除肺这个社区是相似的CF和non-CF支气管扩张患者。
1。介绍
支气管扩张是一种异构条件,其特征是慢性感染/炎症和不可逆转的异常扩张的航空公司。一般分为囊性纤维化(CF)和non-CF疾病、支气管扩张与高死亡率preantibiotic时代(1]。支气管扩张的结果,CF和non-CF有明显改善,non-CF支气管扩张(以下简称为支气管扩张)然而呼吸道发病率仍然是一个重要原因,需要手术切除,甚至在一些病人肺移植。
虽然CF的原因已经查明在单个基因突变,non-CF支气管扩张可能与各种不同的条件包括纤毛蠕动障碍症状,免疫缺陷,和慢性阻塞性肺病(COPD),在很多情况下,是特发性(2]。常见的潜在的致病机制,然而,似乎是复发性呼吸道感染和炎症导致疤痕和永久膨胀的航空公司。
鉴于气道感染的发病机制的中心支气管扩张,大量的研究努力识别细菌病原体存在于这些病人,利用传统微生物学的方法(3- - - - - -11]。这些研究通常nontypable发现最常见的病原体流感嗜血杆菌和铜绿假单胞菌,其次是少量的其他人包括莫拉克斯氏菌属复活,链球菌引起的肺炎,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌群。与变频Nontuberculous分枝杆菌也被报道。这样的研究表明,尽管看似相似的病理生理机制,可能会有不同的细菌感染CF和non-CF支气管扩张患者。例如,尽管流感嗜血杆菌是最常见的病原体在成人non-CF支气管扩张(大约40%的病例),这是更普遍在成人CF患者(1,12]。另一方面,铜绿假单胞菌更通常比从孤立的成人CF患者支气管扩张患者(约80%和18%,分别地。)1,12]。此外,伯克不过复杂,一群有机体与CF患者明显受损的结果,很少感染支气管扩张患者相当CF患者相比(13]。这些观察表明,尽管在航空公司类似的疾病形态学的变化,其他因素和机制可能在起作用在决定什么生物能够感染每一组的病人。
然而,这些研究几乎肯定低估肺支气管扩张患者的细菌多样性,鉴于30 - 40%的痰样本可能无法病原菌生长在传统文化中,尽管是质量好,脓性(2]。因此,这样的研究可能低估了在肺部菌群的多样性和变异程度与支气管扩张有关。应用程序的方法和策略的一个新兴的研究领域被称为宏基因组可能有助于解决这些问题。宏基因组研究的社区生物使用遗传物质直接取自他们的自然环境14]。宏基因组的权力来自评估群落结构和动态的能力无需第一隔离和传播生物实验室。约束和限制的免费培养的方法,它提供了一个社区的多样性的半定量的评估。社区可以在没有任何先验知识研究的成分和不需要特定的选择性条件下,通过隔离和描述DNA直接从metagenome-that,所有物种的基因组结合interest-bypassing需要实验室的标本中分离和培养。宏基因组研究的潜在力量与健康和疾病有关的问题近年来越来越多的认可,就是明证,例如,通过最近推出的国际人类微生物组联盟(http://www.human-microbiome.org/),人类微生物组计划(HMP),和世界各地的其他类似项目(15,16]。
越来越多的研究使用分子检测策略文化无关的细菌物种展示了惊人的CF患者肺部细菌群落的多样性(17- - - - - -27]。然而,几乎没有类似的研究已经完成描述肺支气管扩张的细菌社区。因此,我们努力概要肺部细菌群落的多样性支气管扩张患者通过基因测序的细菌16 s rRNA库构造使用手术切除支气管扩张患者肺组织从10;我们比较这些社区中所见21 CF患者。
2。方法
2.1。病人和样品收集
协议样本收集、存储和使用被批准的大学健康网络(UHN)研究伦理委员会。在无菌条件下,组织建立诊断患者的标本收集CF或non-CF接受手术切除支气管扩张(肺切除术)或肺移植在多伦多综合医院1998年至2007年之间。周围肺组织是在无菌条件下处理收集的,flash在液态氮冷冻,并存储在−80°C。标本10 non-CF支气管扩张患者和21个随机选择的CF患者进行了分析(表1)。所有标本处理进行盲病人数据。临床数据提取在UHN患者电子病历。
2.2。DNA提取和16 s rRNA基因扩增和测序
使用直接PCR基因组DNA提取的DNA抽提系统(Viagen生物技术、洛杉矶、CA)。PCR反应和消极的控制在一个单独的房间进行了放大。放大的16 s rRNA都使用了8 f (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和806 r (5′-GGACTACCAGGGTATCTAAT) PCR引物,如下:1循环(95°C, 5分钟);30周期(95°C, 30秒;55°C, 30秒;72°C, 30秒);1周期(72°C, 8分钟)。每个样品的扩增子库建立了使用助教克隆工具(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和镀上磅媒体。质粒使用纯链接快速从个人分离纯化质粒Miniprep工具包(表达载体)。DNA测序进行应用生物系统公司3130 xl音序器(分析遗传学技术中心,多伦多)48隔离最初,紧随其后的是多样性的初步评估使用爆炸[28]。标本包含不止一个分类单元受到额外的排序。嵌合体是被爆炸结束序列的分析和排除在分析之外。
2.3。数据分析
序列分析使用Qiime社区分析管道(29日]。序列被聚集到操作分类单位(辣子鸡)使用标识阈值的97%。一个序列代表从每个OTU被选为最丰富的分类学分类使用RDP分类器(30.]。分类分类支持水平大于或等于0.7保留;这导致了并不是所有的序列被分类(即最解决。,属)的水平。整个细菌社区比较包括所有序列不管他们的级别分类分配;然而,对于数字的识别和分析主要类群,我们只选择那些辣子鸡属级分类,因为这最实用的信息。OTU分类法分类被用来构造OTU表用于稀疏分析、热图建设、和距离计算。稀疏分析Qiime [29日),使用100复制序列的采样后续评估α多样性。计算UniFrac指标(31日和主成分分析在Qiime完成29日]。集群的热图进行演讲的R (32]。
3所示。结果
3.1。肺支气管扩张患者的细菌群落多样性和CF
总共有955 16 s rRNA基因序列得到从肺组织标本10支气管扩张患者的意思(sd)每名患者)和1387年16 s rRNA基因序列从21 CF患者的肺组织标本(的意思每个病人(sd)序列)。潜在病因的诊断支气管扩张包括传染病后(4例),免疫功能紊乱(3例)、慢性阻塞性肺疾病(1例)和特发性(2例)。分类学分类识别37独特操作分类单元(辣子鸡)代表20属支气管扩张患者和51独特的辣子鸡代表29属CF患者辣子鸡代表属在支气管扩张和每个病人辣子鸡代表属每个病人在CF(范围1日到21日)(表1)。这些辣子鸡代表4门,变形菌门在两组(表最多2),通常包括许多类群不报道作为呼吸道微生物区系的组成(表3)。
假单胞菌整体是最常见的属,共9辣子鸡在30 31名患者被发现,包括所有10支气管扩张患者,占49%的序列(表吗3)。然而,假单胞菌数值主要属(即。,the genus represented by the largest number of 16S rRNA sequences) in only 13 patients, with various other taxa predominating in the other 18 patients.假单胞菌数值主要更频繁地在CF患者在支气管扩张患者(11/21)比(2/10例),尽管这种差异没有统计学意义(双向的确切概率法)。已知序列从其他属殖民成人CF患者也发现,包括Stenotrophomonas和葡萄球菌在这两个病人组。嗜血杆菌CF患者中检测出只有2和1支气管扩张患者。有趣的是,洋葱序列被发现在4支气管扩张患者的低水平。
我们使用稀疏分析来确定序列的数量我们从每个病人获得足够的样本序列的多样性。稀疏重复采样的数据分析工作;这些样品,OTU多样性计算和绘制是否观察到的多样性增加更多的取样。如果抽样浸透在场的多样性,曲线将高原,而如果有额外的多样性有待发现,曲线将继续上升。考虑到相对较低的组合数我们为每个病人抽样,大部分的稀疏曲线表明足够的抽样的多样性(图1)。虽然有一些病人曲线undersampled(即。,that continue to increase), these are not restricted to bronchiectasis or CF patients alone, indicating that any potential differences in bronchiectasis versus CF community structure are unlikely to be due to insufficient sampling.
3.2。比较肺支气管扩张和CF的细菌社区
我们比较支气管扩张和CF患者之间的细菌社区三个方面:集群的社区概况、社区距离的聚类和主成分分析。社区的档案是集群和热图如图表示2。尽管有一小群bronchiectasis-derived社区(B188, B150 B366, B193),那些不夹杂CF聚集在一起的社区。
热图集群是基于他们的社区信息比较患者资料但不考虑序列之间的差异或辣子鸡。因此,我们也比较了序列差异在这些社区的档案系统发育框架内通过计算归一化加权UniFrac距离(31日和使用这些距离来推断UPGMA系统发育树(图3)。是明确不同分组的患者在树上,存在没有明确细菌社区从支气管扩张和CF患者之间的差别。事实上,当序列差异考虑在内,支气管扩张患者的小集群指出在图2不再存在(图3)。
最后,我们使用主成分分析(PCA)来识别支气管扩张和CF社区之间是否存在差异。PCA用于删除数据可能模糊检测的相关性存在差异,由于诊断支气管扩张和CF(如。、年龄的病人)。主成分分析的结果同意上述其他两种方法的结果,即无法发现的细菌群落结构存在很大差异,当比较支气管扩张到CF患者(图4)。
4所示。讨论
细菌感染发病率的主要原因是在个人与CF和non-CF支气管扩张。细菌感染的管理在历史上一直是主要基于文化隔离的有限数量的物种被认为是致病性,但越来越多的自然升值的幼童腹壁薄弱的肺部感染尤其是慢性疾病如CF的设置,和增加的证据表明,物种之间的相互作用会改变毒性属性或抗生素敏感性个别物种的33]。更好的理解这些相互作用及其潜在影响临床需要,作为第一步,更完整的描述的微生物群落的组成肺。我们在这里描述的应用文化无关metagenomic-based策略肺的细菌群落的研究。虽然许多研究类似的策略应用于CF患者呼吸道微生物群的研究(17- - - - - -27),本研究,据我们所知,第一个报告文化无关序列分析的细菌物种直接从non-CF支气管扩张患者的肺组织。我们的数据证明显著的多样性CF和支气管扩张患者的肺部细菌社区,但没有检测这些之间的显著差异在总体社区组成两组病人。
变形菌门成为主流CF和non-CF组(表2和3),假单胞菌总体上是最普遍的属。假单胞菌数值主要在2 10支气管扩张患者,这似乎与之前报道的隔离铜绿假单胞菌从支气管扩张患者大约18%4]。有趣的是,然而,尽管假单胞菌数值2支气管扩张患者的主导,它被确认为一个小的组成部分剩余的8中的细菌社区支气管扩张患者。另一方面,而流感嗜血杆菌通常培养从大约40%的支气管扩张患者,这是只有1中发现10支气管扩张患者的研究。我们的文化无关数据之间的这些差异的原因和以前培养的研究可能是多方面的。鉴于目前的研究调查了组织样本从肺切除标本从接受肺移植的患者,包括许多细菌社区档案生成最有可能代表在场在终末期肺部疾病,,一起在这里研究标本的数量相对较少,因此可能不完全代表微生物群落在早期阶段疾病的过程。此外,这项研究检查肺组织样本,而以前的研究的细菌物种在支气管扩张主要基于文化的痰样本。因为流感嗜血杆菌经常在上呼吸道,可能的情况以前sputum-based研究高估了的患病率流感嗜血杆菌在肺本身。最后,高频率的假单胞菌检测我们的支气管扩张数据集相比,文化研究可能是由于抑制增长假单胞菌在种间相互作用与其他文化,更普遍的物种现在在痰液样本。这样的抑制可能至少部分占大部分的支气管扩张患者的痰样本没有病原体检测到传统文化的方法(2]。类似的因素也可能占我们的检测洋葱10中4例支气管扩张患者,而以前培养的研究未能隔离任何洋葱从支气管扩张患者的痰样本13]。
比较肺细菌社区档案从支气管扩张患者获得使用三种不同的方法从CF患者没有发现显著差异在两组之间的群落结构。在这一点上,它是不确定这是否仅仅是一个函数的标本分析在这项研究来自终末期肺(CF和non-CF)和CF和支气管扩张患者的肺部细菌社区是否在早期阶段可能展示更多的显著差异。纵向研究分析支气管扩张患者的呼吸道样本与CF患者相比需要随着时间的推移来阐明这个问题。
总之,我们的数据显示显著的细菌群落多样性的肺部CF和non-CF支气管扩张患者但没有发现显著差异在这两组之间的细菌群落结构。文化无关的应用方法,比如这里描述,与传统文化的研究有助于大大推进bronchiectatic气道的微生物学的理解。
确认
作者感谢陈保罗沙特朗和吉米的技术援助和Sassan Azad寻求帮助和数据收集。这项研究的部分资金由安大略胸社会,j.p. Bickell基金会全国疗养院协会,加拿大卫生研究院的研究(CIHR) (chm - 94308)和安大略的医生通过医生的服务整合的基础。格特曼博士是支持由加拿大自然科学和工程研究理事会,CIHR和加拿大研究合作项目。莫恩博士是加拿大收件人囊性纤维化的奖学金。