文摘

我们现在新的数据表明PPAR的表达γ降低肺成纤维细胞从黑人SSc-ILD病人比白人患者。激活PPARγ受体激动剂罗格列酮增加金属蛋白酶- 1的表达和抑制胶原蛋白I型肺成纤维细胞分离白,但不是黑色,SSc-ILD病人。阻塞c-Met受体破坏罗格列酮对胶原蛋白的影响和金属蛋白酶- 1在肺成纤维细胞分离出白色SSc-ILD病人,增加c-Met受体的表达在成纤维细胞从黑色SSc-ILD病人复制罗格列酮在白人的影响。我们得出结论,PPARγ受体激动剂保证考虑作为潜在antifibrotic SSc-ILD患者的药物。微分疗效可能预期特别是相对于种族差异和c-Met受体的功能表达。

1。介绍

PPARγ是ligand-dependent属于核转录因子类固醇类维生素a /维生素D受体超家族,脂肪生成的调节中起着举足轻重的作用,胰岛素敏感性,葡萄糖体内平衡和免疫反应(综述(1,2])。激活PPARγ抑制脂多糖的促炎效应和各种细胞因子在免疫细胞。PPARγ是检测在正常肺上皮细胞中表达,平滑肌细胞、肺泡巨噬细胞(3- - - - - -5]。减少PPARγ核蛋白质和基因表达已经证明在真皮成纤维细胞和肺和皮肤活检患者SSc [6,7),在肺泡巨噬细胞结节病的患者和肺肺泡蛋白质沉积症(4,8),这表明PPAR不足γ活动可能导致持续的炎症和纤维化特异表达。

在正常皮肤成纤维细胞,细胞PPAR的配体激活γ已经被证明可以减少基底胶原基因表达和废除TGF -β全身的刺激(9]。PPARγ配体也废除TGF -β全身的表达αsma、myofibroblasts的标志和抑制刺激Smad-dependent转录反应TGF -β(9]。最近,卡普尔等人证明了PPAR的丧失γ在小鼠成纤维细胞导致增加易感性bleomycin-induced皮肤纤维化(10]。激活PPARγ与罗格列酮持续缓解显示纤维lesional硬皮病皮肤成纤维细胞的表型(6炎症)和变薄,皮肤纤维化和皮下脂肪萎缩在硬皮病小鼠模型(11),这表明PPARγ配体可能被视为潜在的治疗硬皮病的代理。

类似的影响已报告在研究肺成纤维细胞(12]。伯吉斯等人表明,内生和合成PPARγ受体激动剂(15 d-pgj₂和ciglitazone或罗格列酮、职责)能够阻止关键TGF -β介导profibrotic效果在体外,包括肺myofibroblast分化和胶原蛋白的生产过剩,而不影响细胞的生存能力。15 d-pgj₂抑制> 95%的TGF -β刺激αsma感应,而罗格列酮抑制40%的TGF -β刺激αsma (12]。SSc-ILD这些发现可能特别相关,因为我们和其他人已经演示了高浓度的TGF -β(13,14),以及存在myofibroblasts表达水平的提高αsma (15在支气管肺泡灌洗液(BALF)。目前的研究表明在体外antifibrotic PPAR的影响γ受体激动剂罗格列酮在肺成纤维细胞来源于SSc-ILD患者,提供额外支持PPAR的潜在的新角色γ受体激动剂SSc-ILD antifibrotic治疗患者。

2。材料和方法

2.1。材料

罗格列酮和9662 GW从开曼群岛购买化学,安阿伯市,密歇根州,美国;EnzoLytePlus 520金属蛋白酶- 1试验装备获得AnaSpec(美国加州圣何塞);NoShift转录因子试验装备,NoShift NF -κB (p65)试剂,NucBuster蛋白质提取设备买来Novagen(威斯康星州麦迪逊);MMP抑制剂GM1489 EMD得到生物科学(加州圣地亚哥)。Anti-PPARγ多克隆抗体是购自细胞信号技术(丹佛,大众);反αsma和反β肌动蛋白抗体购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州);原型我胶原蛋白抗体购自SouthernBiotech(伯明翰,阿拉斯加)。Anti-CTGF抗体和anti-Met(技术)抗体来自圣克鲁斯生物技术(加州Santa Cruz)。c-Met-pLXSN cDNA Morag博士提供的请公园(加拿大蒙特利尔麦吉尔大学)。罗格列酮制备20毫米,9662 GW 2毫米,和GM1489 1毫米股票在DMSO,和同样数量的DMSO罗格列酮,瓦9662 -,GM1489-treated细胞被添加到控制细胞培养。

2.2。细胞培养和转染

肺成纤维细胞来源于尸检肺组织获得从5白色和5晚期SSc肺部疾病患者非裔美国人(1男,4女性每组)和正常的受试者(1男,2女/每组)如前所述[16]。肺成纤维细胞之间使用第二个和第四个段落在所有实验。均值±SD SSc患者为57.8±10.2岁白组和42.2±9.7,非裔美国人团体。均值±SD正常受试者为53.3±4.7岁的白人和非洲裔美国组的46.3±5.6。白人和非洲裔美国人之间的年龄差异无统计学意义在控制或硬皮病患者()。在一组实验中,细胞转染与c-Met-pLXSN cDNA Effectene试剂(试剂盒,瓦伦西亚,加利福尼亚州)根据制造商的指示如前所述17]。

2.3。酶联免疫吸附试验(ELISA)对肝细胞生长因子(HGF)

HGF水平测定在50μL细胞培养基的样本使用Quantikine人类HGF酶联免疫试剂盒(R & D系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州)根据制造商的指示如前所述16]。

2.4。EnzoLytePlus化验

100年样本组成的金属蛋白酶- 1活性测定μ520年EnzoLytePlus L细胞培养基测定根据制造商的指示如前所述18]。

2.5。NF -κB dna结合活性测定

核蛋白质从肺成纤维细胞提取准备孵化与罗格列酮(20μ米)24小时使用从Novagen NucBuster蛋白质提取工具按照制造商的指示。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(皮尔斯,罗克福德,生病了)。核提取物(25μ每g)从肺成纤维细胞或HeLa-positive控制细胞由制造商提供的孵化与生物素化的各种组合NF -κ野生型dsDNA,特定的NF -κB竞争者dsDNA缺乏生物素结束标签,和非特异性,nonbiotinylated dsDNA突变NF -κB共识约束力的主题。dna结合活性的NF -κB是决定使用NoShift转录因子试验装备和NoShift NF -κB (p65)试剂如前所述18]。

2.6。制备细胞提取物和免疫印迹

肺成纤维细胞培养融合在100毫米的菜肴,保存在无血清DMEM一夜之间,然后有或没有罗格列酮治疗。在一些实验中,细胞使用中和anti-c-Met抗体(R & D系统,明尼阿波利斯,明尼苏达州),PPARγ对手瓦9662或GM1489 MMP抑制剂。正常山羊免疫球蛋白作为负控制c-Met中和抗体。肺成纤维细胞与冰冷的PBS和细胞溶解洗冰冷的裂解缓冲(10毫米三,10毫米EDTA, 1%诺乃清洁剂p 40,脱氧胆酸盐0.5%,0.1% SDS,)。蛋白质浓度由BCA决定试验按照制造商的指示(皮尔斯,罗克福德,生病了)。对于每一个样本,40岁μ克蛋白质变性,受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳,分析了以适当的抗体免疫印迹。免疫印迹被剥夺了与反reblottedβ肌动蛋白抗体作为加载控制。如前所述(执行为CTGF蛋白免疫印迹19]。

2.7。c-Met受体磷酸化

硬皮病肺成纤维细胞培养融合在six-well盘子,保存在无血清DMEM一夜之间,然后有或没有罗格列酮治疗不同时期。细胞转移在冰,用冰冷的PBS,收集1×SDS示例缓冲区(100μ信用证)的变性凝胶电泳(sds - page 4 - 20%),和免疫印迹anti-phospho-c-Met [pYpYpY^{1230/1234/1235})多克隆抗体(BioSource国际公司,贝南加利福尼亚州)。在每个实验中,用于免疫印迹膜转移进行评估的总量c-Met受体通过与anti-Met reblotting(技术)多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术)。

2.8。统计分析

统计分析与KaleidaGraph 4.0(协同软件、阅读、Pa)。所有数据使用非参数Wilcoxon-Mann-Whitney测试分析和方差分析图基HSD事后测试。结果被认为是重要的如果。

3所示。结果

3.1。PPARγ肺成纤维细胞中表达

为了更好地理解PPAR的角色γ在SSc肺部疾病的发病机制中,我们调查了PPAR的表达γ肺成纤维细胞与SSc-ILD患者隔离和控制。我们测量PPARγ表达蛋白免疫印迹的6个控件(3白色和黑色)和10 SSc纤维母细胞细胞系隔绝终末期患者SSc-ILD(5个白色和黑色)。PPARγ在SSc含量显著降低肺成纤维细胞(43.5±18.3和101.1±7.9,)(图1)。我们下一个PPAR相比γ表达成纤维细胞来源于白人和黑人之间的正常对照组和SSc的病人。我们发现肺成纤维细胞从白色SSc-ILD患者有更高的PPAR -γ表达相比,黑色SSc-ILD成纤维细胞(57.4±11.8和29.6±11.3,)。

3.2。PPAR微分的影响γ成纤维细胞在白人和黑人SSc-ILD病人

我们试图比较罗格列酮的影响在不同的行肺成纤维细胞。我们测试了10 SSc-ILD细胞系(从黑人和白人患者5 5)和6个正常的肺成纤维细胞(3从白色黑色和3)。当肺成纤维细胞治疗与罗格列酮的浓度20μ24小时,金属蛋白酶- 1活动增加肺成纤维细胞从白色SSc-ILD病人;这样的待遇,但是,没有影响金属蛋白酶- 1活动SSc-ILD黑人患者成纤维细胞(图2(一个))。罗格列酮明显减少胶原蛋白治疗48小时后从白色而不是黑色SSc-ILD患者肺成纤维细胞(图2 (b))。罗格列酮的影响金属蛋白酶- 1和胶原蛋白被PRAR抑制γ拮抗剂,指示PPAR GW, 9662年γ端依赖机制(数据2(一个)和2 (c))。罗格列酮没有影响金属蛋白酶- 1和胶原蛋白在白色或黑色的正常的肺成纤维细胞。

3.3。罗格列酮对PPAR的影响γCTGF表达,αsma和NF -κB在肺成纤维细胞DNA结合活性

探讨罗格列酮是否会增加PPAR的水平γ肺成纤维细胞,培养细胞与罗格列酮不同时间然后PPAR分析γ通过免疫印迹表达。我们观察成纤维细胞暴露在罗格列酮≥12个小时导致显著增加的PPAR水平γ在这两个白人和黑人SSc肺成纤维细胞。不过,罗格列酮对PPAR没有影响γ在正常的肺成纤维细胞(图表达3)。

罗格列酮抑制CTGF和报道αsma蛋白表达在lesional SSc皮肤成纤维细胞(6]。确定罗格列酮抑制CTGF的表达αsma在各种SSc肺成纤维细胞,蛋白质CTGF的表达和调查αsma与罗格列酮在所有测试细胞系。我们发现,罗格列酮减少CTGF和αsma表达SSc细胞株在24小时内处理。没有白人和黑人观察肺成纤维细胞的区别。此外,罗格列酮对CTGF和没有影响αsma在正常的肺成纤维细胞(图4(一))。

自从PPARγ受体激动剂抑制NF -κB (20.),我们检查在NF -罗格列酮的影响κB在肺成纤维细胞活化。NF -κB dna结合活性被绑定的NF -化验κB包含共识寡核苷酸结合位点。核提取物与TNF -海拉细胞刺激α作为一个积极的控制。评估sequence-specific绑定活动,核提取物和NF -孵化κ野生型基因,要么有或没有一个特定的NF -κDNA或非特异性突变NF - B竞争对手κB consensus-binding图案。核提取物和NF -孵化κB野生型基因表达实际NF -κB的活动。具体的NF -κB DNA竞争对手减少绑定活动在所有细胞系确认分析的序列特异性NF -κB绑定,绑定活动的特异性的突变却不明显在各种不同条件下实验(图中使用4 (b))。符合我们的以前的观测(18NF -),基础水平的活跃κB在SSc-ILD成纤维细胞是高于TNF -α全身的海拉细胞作为一个积极的控制。核提取准备从白色或黑色SSc-ILD成纤维细胞用罗格列酮治疗了NF -的显著减少κB DNA结合(图4 (b))。NF -κB DNA结合活性的正常的肺成纤维细胞明显减少与绑定SSc肺成纤维细胞的活动,不受罗格列酮(图4 (b))。

3.4。罗格列酮的影响在肺成纤维细胞与HGF和c-Met SSc-ILD病人

自从PPARγ过氧物酶体扩散国的反应元素结合HGF启动子区域和诱发HGF表达在肾系膜细胞(21),我们测试了罗格列酮对HGF表达肺成纤维细胞的影响。我们发现罗格列酮诱导的分泌蛋白在细胞胶质瘤浮在表面的相似程度上来自白人和黑人肺成纤维细胞(图5(一个))。接下来,我们测试是否通过PPAR HGF诱导γ受体激动剂足以使磷酸化c-Met受体在肺成纤维细胞。我们测量的总水平和磷酸化c-Met受体使用anti-Met或anti-phospho-c-Met [pYpYpY^{1230/1234/1235})多克隆抗体,发现罗格列酮没有影响的总量c-Met受体蛋白质,但它诱导c-Met受体磷酸化SSc-ILD白人患者肺成纤维细胞(图5 (b))。我们之前证明肺成纤维细胞从黑色SSc病人对HGF信号和c-Met受体磷酸化16]。在与这些数据,我们发现罗格列酮并不影响c-Met受体磷酸化在黑色SSc-ILD患者肺成纤维细胞(图5 (b))。

3.5。HGF c-Met受体介导罗格列酮的影响在肺成纤维细胞胶原蛋白与白色SSc-ILD病人

调查是否rosiglitazone-induced抑制金属蛋白酶- 1和胶原蛋白类型我是介导通过c-Met receptor-dependent机制,我们采用了反HGF R (c-Met)抗体。这种抗体被选为中和receptor-ligand交互的能力。我们观察到的预处理与中和抗体anti-c-Met肺成纤维细胞(2μg / mL)防止rosiglitazone-induced金属蛋白酶- 1活性和降低罗格列酮的抑制作用在胶原蛋白表达(数字5 (c)和5 (d))。我们还发现MMP抑制剂,GM1489,减少胶原蛋白(图罗格列酮的抑制效果5 (d))。

过度的c-Met肺成纤维细胞与白色SSc-ILD患者隔离导致增加基底和金属蛋白酶- 1的rosiglitazone-induced活动;然而,向量和c-Met-transfected细胞间差异不显著(图6(一))。相比之下,我们观察到显著变化与向量和c-Met肺成纤维细胞转染细胞之间隔绝黑色SSc-ILD病人。此外,罗格列酮显著增加肺成纤维细胞来源于黑色金属蛋白酶- 1活动患者转染后c-Met受体(图6(一))。过度的c-Met肺成纤维细胞分离出白色或黑色硬皮病患者导致胶原蛋白的积累。与罗格列酮治疗的细胞进一步减少胶原蛋白在这些细胞(图的数量6 (b))。

4所示。讨论

间质性肺病(ILD)是一种不可逆转的、递进的疾病过程和硬皮病患者死亡的主要原因(SSc-ILD)。表现为微血管损伤和炎症,SSc-ILD高潮在细胞外基质过度沉积蛋白质,经常导致严重肺功能障碍和死亡(22,23]。非裔美国人(黑)发展中SSc-ILD SSc患者有更高的风险,倾向于发展肺纤维化早期的疾病和患者有更高的死亡率比白人SSc [24]。黑SSc病人也有更高的患病率的严重的散射类型的SSc和较高的反- sci - 70自身抗体(antitopoisomerase我),这似乎与风险增加有关SSc肺病严重肺纤维化(25- - - - - -27]。尽管有这些著名的协会,一个潜在的病理生理的黑人种族和肺纤维化SSc之间的联系还没有被确认。我们以前报道,白色SSc-ILD病人相比,黑色SSc-ILD病人缺乏c-Met受体表达和产生更少的多功能和antifibrotic细胞因子,肝细胞生长因子(HGF) [16]。因为HGF的表达是PPAR引起的γ,本研究调查antifibrotic PPAR的潜在影响γ受体激动剂在肺成纤维细胞与SSc-ILD隔离病人,包括黑色和白色主题。

PPAR的机制γ发挥其antifibrotic影响尚未完全了解。据报道,PPARγ受体激动剂抑制TGF -β介导myofibroblast表型分化的成纤维细胞,可能通过抑制Smad3磷酸化和核易位(28- - - - - -31日]。PPAR -γ配体也块PDGF-dependent核扩散和prolyl4-hydroxylase mRNA (32)和诱导肿瘤抑制磷酸酶tensin同系物删除10号染色体上(PTEN)在体外已表现出抑制αsma和胶原蛋白在肺成纤维细胞(33]。最近,李等人证明了PPARγ过氧物酶体扩散国的反应元素结合HGF肾系膜细胞启动子区域,从而诱导胶质瘤mRNA表达和分泌蛋白(21]。在目前的研究中,我们证明在体外治疗PPARγ受体激动剂罗格列酮导致增加HGF蛋白质发生与c-Met受体酪氨酸激酶的磷酸化肺成纤维细胞与白,但不是黑色,SSc-ILD病人。

白种人之间的差异和非裔美国人肺成纤维细胞细胞来源于SSc患者的观察而不是控制。这将表明,其他种族特定因素在SSc-ILD硬皮病相关发挥作用。最近,星野等人已经展示了协会启动子多态性与胶质瘤的严重性ILD系统性硬化患者在日本(34]。我们之前显示HGF antifibrotic效果显著降低肺成纤维细胞分离从黑色主题16]。我们的研究结果是一致的在不同细胞系SSc-ILD成纤维细胞或正常的肺成纤维细胞刺激TGF -β(16]。HGF持续抑制胶原蛋白I型和CTGF积累在肺成纤维细胞来源于白色主题。然而,HGF没有影响胶原蛋白或肺成纤维细胞从黑人患者CTGF的表达,以前我们所示的结果缺乏HGF-receptor (c-Met)磷酸化16,18]。

在目前的研究中,我们比较PPAR的激活γ肺成纤维细胞与白人和黑人SSc-ILD病人。正如所料,PPARγ受体激动剂未能诱导c-Met受体磷酸化在肺成纤维细胞从黑色SSc-ILD病人和控制。另外,我们观察到,PPARγ受体激动剂罗格列酮活性金属蛋白酶- 1和减少胶原蛋白I型SSc-ILD成纤维细胞来源于白色主题;然而,它没有影响金属蛋白酶- 1在SSc-ILD成纤维细胞和胶原蛋白I型黑色的病人。此外,有条件的消融c-Met受体的中和抗体废除了罗格列酮的抑制作用在金属蛋白酶- 1和胶原蛋白I型,而过度c-Met受体恢复罗格列酮的影响在肺成纤维细胞胶原蛋白我和金属蛋白酶- 1孤立从黑色SSc-ILD病人。相比之下,αsma、CTGF和NF -κB被罗格列酮治疗类似的程度上减少SSc-ILD成纤维细胞来源于黑色或白色的主题,这表明PPARγ受体激动剂可以降低αsma、CTGF和NF -κB HGF的机制(s)独立。

5。结论

我们得出结论,PPARγ受体激动剂调节重要的肺成纤维细胞和纤维发生的事件可以被视为一个潜在的治疗方法治疗SSc-ILD患者。我们还提供额外的基础生物区别从白人和黑人患者肺成纤维细胞,这或许可以解释观察到的差异在这些种族SSc-ILD严重程度和死亡率。最后,根据这些结果,PPAR微分的影响γ受体激动剂治疗的患者可能会由于不同的表达功能c-Met受体。

确认

这项工作的部分支持由一个多学科的临床研究中心授予p60 - ar - 049459 - 01 (r . m .银)和职业奖项K01AR051052 (g . s . Bogatkevich)来自美国国立卫生研究院的。k . b .高地博士的工作是由飞行员从南卡罗来纳医科大学的资助,教务长办公室。作者要感谢c·贝丝单给她优秀的技术工作。