Perfluorochemical Liquid-Adenovirus悬浮液提高基因传递到远端肺

文摘

我们比较肺重组腺病毒(rAd)的交付方法:(1)rAd悬浮在盐水,(2)rAd悬浮在盐水紧随其后的脉冲追踪perfluorochemical (PFC)液体混合物,和(3)PFC-rAd悬挂。细胞吸收、分布和时间表达式使用rAd的A549细胞,小鼠模型使用荧光素酶生物发光,和组织学分析。相对于生理盐水,转导效率增加4 x在A549细胞暴露于PFC-rAd观察2 - 4 h。rAd转基因表达在肺泡上皮细胞,改善和荧光素酶表达的水平和分布在交付PFC-rAd悬浮液一直在24小时达到高峰。这些结果说明PFC-rAd悬浮液改善分布和提高rAd-mediated基因表达的基因治疗在改善肺功能有重要意义。

1。介绍

基因传递到远端肺上皮细胞已经证明困难,因为广泛系统的大型和小型航空公司、黏膜纤毛的清除,密集的存在glycocalyx衬里气道腔。肺表面活性剂作为屏障和表面活性剂蛋白质作为collectins去除重组蛋白和病毒基因治疗(1,2]。coxsackie-adenovirus受体的分布(汽车)基底表面的细胞导致的提议使用试剂破坏紧密连接,提高传导气道上皮细胞(3- - - - - -5]。作为一种替代方法来提高分布,几项研究已经使用了一个气管内的脉冲追踪方法在肺部提供重组腺病毒(rAd)和腺相关病毒载体在小体积的生理盐水注射了大量perfluorochemical (PFC)液体(3,6- - - - - -11]。这些研究表明肺总基因表达增加,基因表达的分布,提高交付的远端肺/生理盐水。然而,与增加肺泡吸收均匀分布并没有证明一致。此外,这些技术的功效对总体差异表达随时间尚未阐明。

PFC惰性液体综合生产氟碳氢化合物,能够携带溶解气体,密度足够开放领域的崩溃的肺。PFC液体一直提出作为一个通气的治疗方法以及均匀传递生物活性代理到肺。液体通风的研究在动物模型和临床设置的急性肺损伤证明PFC液体在受伤的肺部有很多有益的影响。液体通风后,动物实验诱导急性肺损伤演示改善气体交换,肺的依从性,减少出血,水肿、炎症和氧化相比,同样受伤的动物进行常规天然气通风(12- - - - - -20.]。病理损伤和支气管肺泡灌洗(BAL)流体的内容总白细胞、中性粒细胞、促炎细胞因子在动物或减少急性肺损伤患者进行液体通风相比,气体通风(19,21]。这些影响被归因于mechanoprotective和cytoprotective机制(22,23]。几个在体外PFC改变行为的研究已经证明,细胞内吸收的肺泡上皮细胞和炎症细胞,尤其是中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞,导致抗炎作用[24- - - - - -27]。然而,PFC液体的物理化学性质如粘度、蒸汽压、脂溶性程度上取决于氟的化学成分和安排债券。这些特征是重要的决定因素的程度PFC液体分配整个肺部,从肺蒸发,跨越细胞膜(14,25,28- - - - - -31日]。

对最佳生理概要文件和消炎作用,最治疗PFC液体蒸汽压相对较高的粘度和低(13,15]。这些特征让PFC液体抵抗再分配和快速消除。这些PFC液体往往保持最初的管理,和额外的剂量(不太可能需要14]。最近,新方法将不同的PFC液体工程师所需的粘度和蒸汽压力。系统比较的消炎PFC液体的数量在活的有机体内模型表明,1:3 PP2比和PP9对肺部影响最大的抗炎(13,15]。

在本文中,我们使用的混合物PP2: PP9作为基因运载工具使用rAd在体外和在活的有机体内交货和比较各种方法:(1)rAd悬浮在盐水,(2)rAd悬浮在盐水,后跟一个脉冲追踪PFC的液体,和(3)rAd PFC液体悬浮。来测试假设rAd交付作为PFC悬架将导致更高水平的转基因表达肺实质,我们对A549细胞的表达。在活的有机体内研究在小鼠模型中使用rAd-LacZ构造表现出比当均匀分布在盐水或脉冲追踪方法。这种方法的效果在时间表达式在活的有机体内确定使用rAd-luciferase构建在一个小鼠模型。这些数据表明利用PFC悬浮液的rAd增加肺外围表达式,给出了一个更可靠的时态的表达模式。

2。方法

2.1。rAd构造

Replication-deficient 5型腺病毒编码LacZ (rAd-CMVntLacZ),得到的基因转移载体的核心在爱荷华大学(32]。萤火虫荧光素酶基因的重组腺病毒编码(rAd-CMVLuc)得到的向量匹兹堡大学的核心设备。

2.2。PFC-rAd悬浮液

本研究中使用的perfluorochemical perfluorocyclohexane 25% (PP2) / 75% perfluoromethyldecalin [PP9]获得F2的化学物质,有限公司,英国兰开夏郡。PFC悬浮液是准备使用修改后的前面描述的方法,以确保稳定和均匀分布(33,34]。简而言之,rAd盐构造(病毒颗粒在2毫升/公斤)和PFC流体(25% PP2/75% PP9;10毫升/公斤)是用(布兰森2510,丹伯里,CT) 5 - 10分钟。

2.3。rAd转导效率在体外

人肺泡上皮细胞A549细胞(ccl美式文化集合- 185)是生长在火腿F-12-K介质(GIBCO BRL,生活技术,马里兰州)补充heat-inactivated 10%胎牛血清,2毫米谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。细胞()室内空气保持在37°C 95% - 5%的股份有限公司₂调湿室,播种在6-well板包含盖玻片和一夜之间可以遵循。Subconfluent A549细胞孵化与rAd感染复数(MOI) 100年的病毒颗粒/细胞0.6毫升的完整的媒体或PFC液体摇摆平台2-48 h在37°C。孵化项目超过8 h, 0.6毫升的媒体是添加到PP2: PP9井防止PFC液体蒸发,从而保护细胞免受脱水。在转染的最后时期,PFC液体被吸走,与介质细胞被刷新。

量化转导效率在文化、评估β牛乳糖(β-加)活动进行48 h后转导附近汇合的细胞生长在盖玻片按照制造商的指示(σ化学品,圣路易斯,密苏里州)。短暂,细胞与磷酸盐(PBS)冲洗,然后在0.1%的戊二醛固定在室温下5分钟。与PBS三洗后,细胞染色1毫克/毫升半乳糖苷(表达载体)2 h在37°C。在转染细胞中,β-加裂解半乳糖苷生产蓝色污点。盖玻片被清洗和安装在显微镜幻灯片以供查看。连续十个字段被抓获使用尼康TL300倒置显微镜配备了索尼3 ccd进步相机,电脑电脑,Adobe Photoshop 7.0版本与适当的导入插件使用相同的设置。图像被认为在Metamorph(分子动力学),手工和半乳糖苷阳性细胞数。

2.4。rAd的滴注法在活的有机体内

自然呼吸,C57BL / 6和Balb / c小鼠(6 - 8周内;15 - 20 gm)随机分配给车辆和时序组,然后由腹腔内注射麻醉(氯胺酮:40毫克/公斤;甲苯噻嗪:8毫克/公斤)。一旦镇静,局部麻醉的应用(利多卡因),气管被隔离在一个肤浅的切口。滴注法进行自主呼吸时通过气管穿刺使用0.50毫升注射器,29日G针,大约2环状软骨环下面。滴注法后,动物被旋转不断增强分布到老鼠了正常的运动活动和梳理(即。在30分钟内)。机构批准的所有程序都是动物保健和使用委员会天普大学医学院,并按照美国国立卫生研究院的指导方针。

2.5。rAd转导效率在活的有机体内

空间分布的C57BL / 6小鼠基因表达评估(在生理盐水),收到rAd-CMVLacZ (病毒颗粒在2毫升/公斤),rAd-CMVLacZ在盐水(2毫升/公斤)PFC(10毫克/公斤)(脉冲追踪方法),或rAd-CMVLacZ盐水(2毫升/公斤)悬浮在PFC(10毫升/公斤)暂停(PFC)。其他动物()灌输单独使用生理盐水(2毫升/公斤)或独自PFC(10毫升/公斤)被用作控制。基因表达的时间分布评估生物荧光在Balb / c小鼠()接受rAd-Luciferase盐水(10¹⁰或病毒颗粒)悬浮在PFC(2毫升/公斤)。

2.6。空间分布

在这些动物的肺,空间分布评估48 h后气管内的管理。气管插管,肺在15厘米pressure-clamped H₂O,血管灌注冷Millonig的缓冲区,和全体删除。肺被固定在戊二醛,半乳糖苷反应溶液中孵化(1毫克/毫升的半乳糖苷)在37°C 4 h,和福尔马林的后缀。肺坐骑然后石蜡包埋的成像和组织学分析做准备。石蜡包埋组织块的肺被认为在一个尼康SME10解剖显微镜;捕获图像尼康E5000消费级数码相机摄像机和数字输出导入Adobe Photoshop。薄片(5μ米)被安装在幻灯片,与苏木精染色(H)和伊红(E),并通过光学显微镜检查。组织部分在尼康Optishot显微镜观察;捕获的图像点见解相机和导入图像ProPlus数字输出。

2.7。时序基因表达

时序基因表达rAd-CMV向量评估天1,2,4,7,10后管理rAd编码萤火虫荧光素酶基因(rAd-CMVLuc)。这种生物荧光检测系统用于间接测量感兴趣的基因的荧光素酶基因被放置相关启动子的下游。衬底、荧光素与氧气反应的酶荧光素酶,导致光的形成。在活的有机体内荧光素酶表达可视化在麻醉Balb / c小鼠(动物/组)。动物管理100μL(150毫克/公斤)的荧光素腹腔注射(IP),置于气体麻醉(异氟烷)和成像15 - 20分钟后政府新50成像系统(创建Xenogen Corp .)、阿拉米达Callif)和生活形象软件包(卡尺生命科学,数据质量)。初始剂量反应曲线确定信号的峰值在肺15分钟开始消退,25分钟(数据未显示)。图像设置一个3分钟的曝光灵敏度高(装箱)除非使用这些设置导致饱和的形象。使用相同的区域大小的图像量化。背景值测定sham-treated动物的IP荧光素以相同的方式交付。

2.8。统计分析

对病毒转导细胞,一个学生的每个时间段内执行以及比较组。微分β加在肺部和荧光素酶表达是用单向方差分析费舍尔相比——或者Bonferroni-adjusted posthoc比较组之间的手段。所有分析使用SAS软件包版本8.1 (SAS研究所,卡里数控,2001)。结果报告为平均值±标准偏差。

3所示。结果

3.1。PP2: PP9改善rAd体外转导效率

肺上皮细胞的转导rAd盐水与rAd悬浮在PFC相比首次检查使用A549细胞,人类肺癌II型细胞系。rAd-CMVLacZ添加A549细胞为2、4或8 h,和β-加活动化验后48 h的rAd时间点。A549细胞转导的时间段是不同的rAd交付PFC液体而rAd在盐水(图1)。转导在PFC液体发生早于生理盐水;在2和4 h多五倍β加(+)细胞与PFC液体(盐水控制相比)。通过8 h, > 95%的细胞在两种文化β-加(+)(数据没有显示)。

3.2。PP2: PP9: rAd悬浮液提高小鼠远端肺分布

转导在活的有机体内测试使用三种不同的rAd-CMVLacZ管理方法:(a)在盐水中,(b) pulse-chase-in盐水紧随其后PFC液体,或(c) PFC液体悬浮。48小时后滴注法肺被全体和染色β-加活动(图2:左面板)。半乳糖苷彩色肺被嵌入在石蜡和检查光学显微镜比较rAd-CMVLacZ-mediated的程控分布β-加表达式产生的交付(图的不同的方法2:右面板)。代表肺(图2)表明,rAd-CMVLacZ仅在盐水(图交付2(一个))导致β-加活动中心和近端大航空公司。没有染色观察肺的saline-alone或PFC-alone控制老鼠(数据未显示)。低放大照片的肺灌输脉冲追踪(图2 (b):中间面板)和PFC液体悬浮(图2 (c)举例说明:中间面板)表达在大型航空公司(见箭头)。当由脉冲追踪方法(图2 (b)),更多的细胞表达β-加,表达水平的提高远端航空公司;然而,几乎没有证据的表达式外围肺,尤其是肺泡上皮细胞。相比之下,当交付作为PFC液体悬浮(图2 (c)),半乳糖苷染色显然更强烈、更均匀,达到了极端周边肺部因此反映最统一的,最高的,广泛的分布β-女孩的表情。补充的图片转染小鼠的肺三种技术在图所示2 (d)。

β-加表达在不同的细胞类型检查在组织部分下更高的放大(图2:右面板)。气道上皮细胞衬气道被确定位置。虽然没有执行特异性染色,转基因表达明显出现肺泡上皮细胞的形状和位置在肺泡;I型细胞细长的外形和II型立方形的外观位于角落。的分布β-加表情出现不同根据交付的方法,尤其是在肺的远端部分。rAd-CMVLacZ交付通过脉冲追踪似乎导致气道和更少的表达主要在肺泡与大多数肺泡表达发生在I型细胞(图2 (b))。相比之下,政府在PFC液体悬浮似乎导致更大的表达式在肺泡上皮细胞(图2 (c))。

3.3。PP2: PP9改善分布和rAd的早期表现

光学显微镜数据展示更好的交付外围肺实质与病毒悬浮在曼宁决定如果这可以转化为更多的转基因表达的肺癌,我们使用荧光素酶作为一个记者,有两个原因:(1)转基因表达可以测量无创和不断随着时间的推移,(2)荧光素酶的半衰期很短(~3 h)新的转基因表达,而不是蛋白质积累,是测量。在这些研究中,rAd-luciferase在盐水或灌输intracheally PFC悬挂,和一个使用光线成像系统进行纵向研究。Balb / c小鼠被用于这些实验,因为他们的白色外套颜色最小化absorbsion发出的光从向量。两个病毒滴度测试(病毒颗粒,病毒颗粒);图像获得的在不同时期政府后,量化和荧光素酶的活动。从每组如图代表动物3。动物收到病毒在PFC最好暂停双边分布在低和更大程度上更高的病毒滴度(图3(一个))。在以后的时代里,荧光素酶的出现隔膜地区活动的老鼠从saline-delivery组表明,该病毒是由黏膜纤毛的清除运输然后摄取(见箭头在图3 (b))。而50%的生理盐水组信号在腹部,没有检测到表达动物的腹部从PFC组肺显示更少的间隙和更好的记忆力。定量的表达被用来比较转基因表达胸地区的老鼠。图4展示了动物个体的时间模式和表1提供了表达当作为一个整体分析。生理盐水组(显然没有一致的模式数据4(一)和4 (c))和胸表达达到4 d、2 d,和1 d鼠标4中,鼠标5,分别和鼠标6(图4 (c))。高病毒效价组动物的PFC液体组一致的模式表达式1天然后每天递减(图达到顶峰4 (d))。PFC液体动物病毒效价较低组(图4 (b))表现出同样的模式表达病毒效价高组(图一个例外4 (b)查看和分析时,鼠标3)。作为一个团体,最引人注目的差异观察PFC液体和生理盐水组相比,高病毒效价(表1)。由于时间的变化模式的生理盐水组病毒效价较低(图4(一)),没有统计PFC液体和生理盐水组之间的差异被发现在任何的时间点(表1)。

4所示。讨论

这项研究表明一个特定的组合PFC液体(PP2: PP9),之前我们有显著改善气体交换,肺功能,减弱炎症肺损伤的动物模型13,15,35),也极大地提高了效率的rAd基因传递到周围的肺。PFC的生成液体/ rAd悬浮液具体改善肺泡上皮细胞中的表达。

重组腺病毒可诱导高水平的瞬态转基因表达。几个重要的中已经作了一些改进这个向量导致增强的基因传递到肺。最早的改进之一就是从血清型7改为5个血清型。因为血清型5结合汽车受体在航空公司更有效地发现,基因表达减弱,所需的病毒效价和炎症明显减少了。接下来,试剂如EGTA破坏紧密连接已被证明改善航空公司的表情,让汽车气道上皮的基底外侧表面。各种PFC液体被利用来提高表达的远端航空公司健康和病变的肺3,6- - - - - -10]。我们的研究结果反映了至少两种机制被认为是参与改进的表达式。首先,它曾经表明PFC液体促进紧密连接的瞬态干扰,增加接触汽车,分布于整个A549细胞薄膜(3]。其次,基于这个特定的物理化学性质PFC液体组合(具有独特的运动粘度,蒸气压,亲油性概要文件)(14,36、PFC悬浮培养病毒的增加和穿制服的分布相对于生理盐水,这样更多的细胞暴露于病毒。因此,临床使用的PFC的液体rAd能减少病毒治疗肺部疾病所必需的。这可能是一个重要的考虑固有的炎症反应与腺病毒有关。PFC悬挂的独特的物理化学性质可能支持进一步改善了粘弹性凝胶已被最近显示改善rAd和AAV表达只在中央航空公司没有增加肺泡表达式(37]。我们的数据文档在转基因表达显著差异rAd在PFC和盐在早期的时间点在体外和在活的有机体内。在体外我们将演示一个更高的转导效率和早些时候在活的有机体内更一致的时间表达模式。我们演示了不同的PFC液体膜流动性的影响和包装使用脂质体作为模型系统(28]。荧光素酶活动的数量评估时在目前的研究中,显著差异表达1 d后只发现政府在PFC液态悬浮液与其他方法相比。我们推测,时间管理的方法之间的差别(支持PFC悬挂)可能会大于目前的分析;然而,我们相信,更详细的分析可能是困惑的焦点表达高水平的上呼吸道与盐水滴注法相比,更外围的分布与PFC悬挂。因此,这份报告表明,rAd的PFC液态悬浮交付的主要优势是提高早期表达(图4、表1)、远端肺更好表达和更好的记忆力在肺(图3)。

尽管这项研究并不是为了全面评估异位表达,我们的方法的介绍minitracheal穿刺可能会反对这种可能性因为这个方法绕过鼻腔上皮以及最小化潜在的病毒转导肠道向上mucocililiary道。此外,肺泡表面似乎完好无损为异位表达从而减少访问通过整个alveolar-capillary膜易位。此外,有很少的异位表达荧光素酶检测单独建设。

先前的研究利用PFC液体rAd-gene交付车辆利用脉冲追踪的管理方法,也就是说,在盐水后立即交付rAd PFC液体的滴注法7,9,11,38]。我们认为,创建一个悬架应该提高效率增加的分布向量相比脉冲追踪方法。我们之前已经证明,纳米晶体的形成悬浮液与PFC液体提高交付生物制剂(重组蛋白和抗生素)肺(33,35,39]。然而这项技术是依赖于药物的能力形成粉/感兴趣的蛋白质。由于rAd是相对不稳定,冻干后就失去生存能力,我们有限的方法来创建液态悬浮液。有报道称稳定rAd对冷冻干燥方法的公式,但我们试图使用这个方法创建纳米晶体最终失败(数据没有显示)。更稳定的基因传递载体或化合物(质粒DNA, rSV40 siRNA)将可行的候选PFC液体纳米晶体悬浮形成。小干扰rna策略的有效性,作为寡核苷酸或其他基因载体系统,提供了抑制基因表达的可能性。

没有理想的基因传递方法,还有使用rAd相关重大问题(如炎症;细胞特异性仅限于细胞表达适当的受体为病毒条目),特别是在临床设置。已经实现了一些策略来减少这些问题,包括生成“摧毁病毒”(40)和嵌合纤维的使用(41,42]。尽管rAd的潜在困难,这些向量仍承诺提供瞬态超表达的基因。作为本研究证明,PFC液体促进统一交付到肺和可能减少炎症反应rAd基因产物(9]。这将是特别重要的非齐次和炎症类型的肺损伤过程中PFC液体可以促进基因的分布或其他生物制剂而促进气体交换和改善肺功能(即管理/治疗。、囊性纤维化、慢性阻塞性肺病或ARDS)。相反,在疾病影响中央或近端航空公司交付通过生理盐水或脉冲追踪方法可能是有利的。

PFC液体配方用于选择目前的研究是基于最大的改善气体交换和肺力学和衰减的肺部炎症的急性肺损伤模型(13,15,35]。在这种背景下,利用PFC悬浮液增强基因表达的观念挑战需要轻微的炎症基因吸收。基因表达的主要改进在活的有机体内似乎是交付的病毒远端肺的肺泡上皮细胞。为什么这个增加是观察这些细胞类型仍不清楚。最可能的解释是,特定的物理化学性质(如运动粘度、蒸汽压、亲脂性的本质)PFC液体提升交付并帮助细胞转导的肺泡(即。,类似于表面活性剂是如何回收,改变膜动力学)。我们建议交付到这个舱防止肠道黏膜纤毛的清除。

总之,PP2: PP9 PFC rAd悬浮液增加表达的远端部分肺。会促进受体介导和独立病毒转导率显著增加。这具有重要的治疗对疾病的影响表现在中央航空公司是不够的在肺泡和表达是必需的。PFC的使用液体持有承诺作为车辆提供基因传递载体和其他生物制剂为了更直接和具体预防和治疗高危危重患者的肺部疾病过程。其他人则涉及“表面活性剂”介导的PFC进入肺泡II型细胞,表面上与内部相关流程(31日,36,43]。如果这些粒子被分泌到肺表面,这将促进循环的病毒转导额外的或邻近的肺泡上皮细胞。如果这个理论是正确的,使用基因向量PFC悬浮液交付使小说和前瞻性对基因治疗领域的贡献。PFC-assisted基因的进一步研究向量交付方法,包括雾化的PFC液态悬浮液,目前有可能克服许多障碍相关基因传递到肺上皮细胞。

确认

作者要感谢西波拉克,他的援助与统计分析。这项工作是支持由美国国立卫生研究院的一部分(HLBI 64158和1 P20 RR020173), PA卫生部(我- 01 - 328)和Shulsky基金会。

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