文摘
帕金森病(PD)是一种常见的神经退行性疾病,特点是进步的机车缺陷和多巴胺能神经元的损失(DA神经元)。目前还没有有效的疗法治疗PD控制症状和药物仅仅支持。很难发展一种有效的治疗,因为PD的PD发病机制尚不清楚。氧化应激被认为是神经退行性疾病的主要原因,并有越来越多的证据PD和氧化应激之间的关系。因此,抗氧化治疗可能是一种有前途的治疗帕金森病。果蝇击倒的杜赫的相同器官UCH-L1透析相关基因,表现出PD-like表型包括先进机车障碍和DA神经元变性。此外,可拆卸的杜赫导致活性氧水平升高。因此,杜赫可拆卸的苍蝇可以用作治疗PD模型筛选潜在的抗氧化剂。先前的研究表明,姜黄素在1毫米和维生素C 0.5毫米可以改善PD-like表型诱导击倒。进一步调查的目的与维生素C在PD治疗的效率,我们使用杜赫可拆卸的果蝇模型检查的剂量和时间影响维生素C PD-like表型。结果表明,尽管维生素C对神经保护作用,高剂量的维生素C和长期治疗与抗氧化剂也导致生理上的副作用。建议剂量依赖性的影响时,应该考虑维生素C用于治疗帕金森病。
1。介绍
帕金森病(PD)是最常见的神经退行性疾病之一,影响1%的人口年龄在60岁(1]。帕金森病是一种进行性神经系统疾病,其特征是机车缺陷如地震、刚度、动作迟缓。此外,这种疾病也与nonmotor症状包括嗅觉减退、睡眠障碍、抑郁(2,3]。帕金森病的神经病理特征的丧失在黑质多巴胺能神经元(DA神经元)和大脑的路易小体的形成4,5]。遗传和环境因素之间的复杂的相互作用参与PD的发病机制。据报道,许多基因及其变体等α-synuclein,粉1,DJ-1,UCH-L1,LRRK2帕金森病相关。然而,PD的发病机制尚未完全阐明,(6- - - - - -8]。
氧化应激被认为是神经退行性疾病包括帕金森病的主要原因(9]。许多研究结果提供了氧化应激和PD之间联系的证据。的下降水平减少谷胱甘肽(GSH)和脂质氧化损伤的增加,蛋白质和DNA被发现在PD患者的大脑10- - - - - -16]。特别,有许多来源的自由基等大脑的氧气和葡萄糖的高消费和神经递质代谢,导致大脑氧化应激的敏感性17]。此外,DA神经元本身可以通过多巴胺代谢产生氧化应激(18,19]。因此,抗氧化治疗被认为是一种很有前途的治疗PD (20.]。抗氧化剂如姜黄素、白藜芦醇和维生素E已经被研究过,他们施加积极的帕金森病的神经保护效应模型(21- - - - - -23]。
维生素C是一个著名的和必要的抗氧化剂;然而,人类不能合成维生素C由于缺乏酶的消化酶。因此,这个必须通过饮食和维生素补充剂(24]。维生素C执行许多重要的生物功能。例如,它可以作为一种抗氧化剂清除自由基和活性氧和酶的辅助因子25]。的注意的是,维生素C是高度集中在大脑。在神经系统中,除了发挥抗氧化作用,维生素C还参与不同的过程包括神经元的分化、成熟和生存,儿茶酚胺生物合成(如多巴胺和去甲肾上腺素)和神经传递的调制(26]。PD患者的研究报道,缺乏维生素C与PD (27- - - - - -29日]。维生素C已经检查了几个在体外和在活的有机体内PD模型,表现出积极的效果30.]。例如,据报道,维生素C对glutamate-mediated神经保护作用会引起的在体外人类DA神经元模型(31日]。在果蝇模型表达人类α-核蛋白的神经元,维生素C治疗导致延误的损失攀爬能力(32]。
泛素羧基末端水解酶L1 (UCH-L1)属于deubiquitinating酶(配音)家庭中扮演着重要的角色在ubiquitin-proteasome系统(UPS)。特别,UCH-L1礼物在大脑和由神经元蛋白质总量的1 - 5% (33]。的第一个证据的参与在PD UCH-L1错义突变的识别UCH-L1 (I93M)在德国家庭与PD (34]。之后,几个变种UCH-L1包括E7A, R178Q, A216D已确定患者的神经退行性疾病(35,36]。在果蝇,泛素羧基末端水解酶(杜赫)编码的CG4265基因是人类的相同器官UCH-L1,分享43.7%的身份37]。苍蝇与特定击倒杜赫在DA神经元表现出PD-like表型包括逐步减少不仅运动能力,而且DA神经元的数量(37,38]。此外,杜赫击倒诱导氧化应激而姜黄素,一种抗氧化剂,减少ROS水平和改善PD-like这击倒[引起的表型39]。先前的研究还表明,维生素C的浓度0.5毫米减少机车缺陷和DA神经元的损失在幼虫阶段由DA特异性神经元击倒杜赫(37]。
在本研究中,我们使用果蝇模型检查的剂量和时间影响维生素C治疗PD-like表型由击倒杜赫。我们发现维生素C有可能改善PD-like表型特征的机车缺陷和神经退化杜赫可拆卸的苍蝇。然而,维生素C在高浓度也施加负面影响摄食行为和机车能力。明显,长期治疗维生素C可以预防DA神经元的变性,但导致的攀爬能力降低成年苍蝇。我们的研究结果表明,高剂量的维生素C和长期治疗与抗氧化剂可能导致生理上的副作用。
2。材料和方法
2.1。飞股票和准备食物
飞股饲养标准食品含1%琼脂、5%蔗糖、5%干酵母,3%奶粉25°C。RNAi线带UAS-dUCH.IR(v26468维也纳果蝇资源Center-VDRC)被用来击倒杜赫。野生型Canton-S(布卢明顿果蝇股票Center-BDSC)被用来创建控制苍蝇。RNAi线是由TH-GAL4(ple-GAL4)(8848年,BDSC)或ELAV-GAL4(8760年,BDSC)。
维生素C (L-Ascorbic酸、A0278西格玛奥德里奇,新加坡)溶解在蒸馏水,然后添加到标准食物最终浓度的0.5毫米,2.5毫米和5毫米。维生素C-containing食品一直在黑暗中,以防止氧化在实验过程。Nutrient-restricted食物含有低水平的营养是降低50%相比标准的食品。
2.2。饲养试验
如前所述(执行喂养试验39)做了一些调整。食物摄取被量化的间接测量染料幼虫食用。考马斯亮蓝g - 250染料(美国议员生化药剂808274)添加到飞食品2%的浓度。收集第三龄幼虫早期使用20%的蔗糖溶液和用PBS。这些幼虫被转移到含Coomassie染料和维生素C的食物在不同的浓度和允许吃30分钟。幼虫用70%乙醇和70%乙醇均质。匀浆被离心机9279×10分钟。上层清液的大量Coomassie OD595测量。单向方差分析的数据进行了分析并使用GraphPad Prism 6.01画。
2.3。体重和尺寸测量
男性第三龄幼虫后期阶段随机收集,用PBS洗净去除食物痕迹,转移到管每管八幼虫密度。我们包含幼虫用分析天平称量每一管。这些幼虫然后用4%多聚甲醛固定过夜。幼虫被数码相机捕获(奥林巴斯E-M10)和二维幼虫大小测量使用ImageJ(美国国家卫生研究院)。幼虫体重和大小的数据分析了单向方差分析和使用GraphPad Prism 6.01画。
2.4。爬行分析
如前所述执行爬行分析(37]。男性在第三龄幼虫阶段收集随机美联储与PBS维生素C和洗后丢弃食物的痕迹。之后,幼虫转移到2%琼脂板的密度每板3 - 4幼虫。幼虫的运动是由一个数码相机记录60秒钟。记录的视频被转换为AVI文件用MOV AVI转换器(Pazera Jacek、波兰)和分析ImageJ(美国国家卫生研究院)wrMTrck插件(Jesper彼得森Søndergaard博士发明的)。爬行速度的数据分析了单向方差分析和使用GraphPad Prism 6.01画。
2.5。攀登化验
如前所述(执行登山化验40]。40个新eclosed成年雄性果蝇收集和转移到圆柱管高15厘米,直径2厘米。管是利用五次收集苍蝇在底部,和苍蝇的运动记录持续时间1分钟。这些程序是重复五次,数码相机记录。攀爬的实验,每一个飞行的高度爬5秒后得分如下:0(小于2厘米),1(2到4厘米),2(4 - 6厘米),3(6 - 8厘米),4(8 - 10厘米),5(超过10厘米)。登山试验进行,直到所有苍蝇失去了运动的能力。攀登指数收集从一个重复测量平均爬分数大致相当于五个重复测量数据的平均值。攀登指数的数据分析了双向方差分析和使用GraphPad Prism 6.01画。
2.6。量化的多巴胺神经元免疫染色
多巴胺能神经元被染色了antityrosine羟化酶(anti-TH),一种酶催化酪氨酸左旋多巴(转换41]。从第三龄幼虫或成年苍蝇的大脑解剖在PBS和4%多聚甲醛固定20分钟。洗后0.3% PBS-T Triton x - 100) (PBS包含0.3%,样本被阻塞的解决方案(PBS包含0.15% Triton x - 100和10%正常山羊血清)25°C 30分钟。组织被孵化与稀释兔子anti-TH(1: 250年,微孔)的屏蔽解决方案在4°C 36小时。洗后,大脑被孵化与二次抗体共轭Alexa 488(1:50 0,英杰公司)25°C 2小时。组织被清洗和安装在Vectashield安装介质(向量实验室,日本)。样本观察使用ECLIPSE NI-U(尼康)。多巴胺神经元的数量被细胞计数器统计插件ImageJ 1.49°和分析单向方差分析使用GraphPad Prism 6.01。
3所示。结果
3.1。幼虫的食物摄取能力影响维生素C治疗是剂量依赖性的方式
维生素C可以改变食品的味道可能,反过来,影响消费食品和飞的健康。因此,我们测量的食物摄取能力控制(+;+;TH-GAL4/ +)和杜赫可拆卸的幼虫(+;+;TH-GAL4/UAS-dUCH.IR)当他们处理含维生素C的食物对幼虫进行饲养试验。添加了维生素C飞食物浓度的0.5毫米,2.5毫米和5毫米。控制幼虫,有增加(19%)的消耗食物当他们处理低浓度的维生素C(0.5毫米)与未经处理的幼虫。然而,当维生素C浓度增加到2.5毫米,控制幼虫的食物摄取能力下降比幼虫处理0.5毫米,这是相当于未经处理的幼虫。值得注意的是,在更高浓度的维生素C(5毫米),控制减少了60%的幼虫吃能力比未经处理的控制幼虫(图1(一))。根据维生素C-containing食品被幼虫的数量,我们估计的相对水平的维生素C的摄入量。数据显示控制幼虫摄入更多的维生素C水平(4.2倍和3.4倍)2.5毫米和5毫米的浓度,分别与0.5毫米(图1 (b))。杜赫可拆卸的幼虫可能比控制幼虫对维生素C更敏感。维生素C处理时,他们的食物摄取能力大大下降。食物被击倒的幼虫的数量下降了27%在0.5毫米和5毫米57%比未经处理的可拆卸的幼虫(图1(一))。维生素C被击倒的幼虫的相对水平高出4.7倍和5.9倍2.5毫米和5毫米的浓度,分别与0.5毫米(图1 (b))。结果表明,维生素C治疗影响幼虫的食物摄取能力以剂量依赖的方式。
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我们发现幼虫摄食行为是影响维生素C治疗。食物的减少量被第三龄幼虫早期阶段可能导致营养不良和减少幼虫体重和大小。因此,我们的体重和大小控制和评估杜赫击倒的幼虫被喂以含维生素c的食物时结果表明,体重没有显著差异的维生素C-treated和未经处理的控制幼虫(图1 (c))。的大小控制幼虫略有减少(图5毫米的浓度1 (d))。在杜赫可拆卸的幼虫,维生素C治疗0.5毫米导致幼虫体重略有增加比未经处理的可拆卸的幼虫。高浓度的维生素C(5毫米),观察无显著差异的权重处理和未经处理的可拆卸的幼虫(图1 (c))。此外,可拆卸的幼虫的大小没有显著改变当他们接受维生素C(图1 (d))。数据显示的体重和大小杜赫击倒幼虫没有减少维生素C治疗,表明击倒幼虫可能满足他们的营养需求。
3.2。剂量依赖性的影响维生素C的爬行能力杜赫可拆卸的幼虫
果蝇模型与特定的可拆卸的杜赫在DA神经元表现出机车缺陷和维生素C 0.5毫米改善受损引起的爬行这击倒37]。因此,然后又介绍了维生素C的影响在不同浓度的爬行能力杜赫可拆卸的苍蝇。我们发现,击倒的杜赫导致DA神经元减少(0.13 mm / s)爬行速度,这与先前的发现是一致的(37]。维生素C在0.5毫米的爬行能力并不影响控制幼虫;然而,这些幼虫的爬行速度降低时接受更高浓度的维生素C(2.5毫米和5毫米)。有下降了0.18毫米/秒和0.20毫米/爬行的速度控制幼虫接受2.5毫米和5毫米维生素C,分别,而未经处理的控制幼虫。在杜赫可拆卸的幼虫,0.5毫米维生素C改善机车缺陷引起的DA特异性神经元击倒杜赫。然而,之间没有显著差异的爬行速度治疗和维生素C-treated击倒幼虫的浓度(图2.5毫米和5毫米2(一个))。这些结果表明,维生素C的影响依赖于剂量。维生素C在低浓度可能会增加爬行能力。相比之下,维生素C展出副作用幼虫处理时更高的浓度。
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进一步证实维生素C的影响,我们也对幼虫进行爬行分析击倒的杜赫在pan-neurons使用ELAV-GAL4司机。在这种情况下,更多的神经元被击倒的影响杜赫。类似于特定击倒的杜赫在DA神经元,这pan-neuron击倒也导致减少(0.15 mm / s)的爬行能力杜赫可拆卸的幼虫(+;+;ELAV-GAL4/UAS-dUCH.IR)与控制幼虫(+;+;ELAV-GAL4/ +)。没有观察到显著差异的爬行速度控制幼虫对不同浓度的维生素C,可拆卸的幼虫,维生素C治疗改善机车缺陷诱导pan-neuron-specific击倒的杜赫。然而,击倒幼虫的爬行速度没有显著不同浓度的0.5毫米,2.5毫米和5毫米(图2 (b))。这些结果提供了更多的证据表明,维生素C治疗可以挽救机车障碍所致杜赫可拆卸的。
3.3。维生素C减少多巴胺神经元的损失杜赫可拆卸的幼虫
黑质DA神经元的损失是PD的标志,和杜赫击倒也导致DA神经元变性果蝇模型(37,42]。因此,我们评估了维生素C对DA神经元的数量的影响在幼虫阶段。基于爬行化验的结果,0.5毫米和2.5毫米的浓度选择执行实验量化DA神经元。Anti-TH(酪氨酸羟化酶)抗体被用于马克和可视化DA神经元。我们还发现,DA特异性神经元击倒的杜赫导致DA神经元的数量减少。杜赫击倒幼虫有更少的DA神经元的DM, DL1和所有的集群(分别为14日,11日,和37个神经元)比控制幼虫(分别为41神经元17日13日)(A1B1C在图3)。DA神经元的数量控制幼虫不受维生素C治疗。在杜赫可拆卸的幼虫,DA神经元的损失减少了维生素C治疗0.5毫米和2.5毫米。DA神经元的数量在DM, DL1和集群都击倒的幼虫用0.5毫米高维生素C(分别为16、13和41神经元)(B2和C在图3比维生素C-untreated击倒苍蝇(B)1和C在图3),在控制幼虫(类似1和C在图3)。同样,维生素C在2.5毫米也阻止了DA神经元的损失由击倒杜赫(A, B1B3C在图3)。结果表明,维生素C治疗可以减少DA神经元的损失在幼鱼阶段。这可能导致爬行的能力的改善杜赫可拆卸的幼虫在低浓度的维生素C(0.5毫米)。浓度的2.5毫米,尽管维生素C DA神经元减少损失,可拆卸的幼虫的爬行能力没有提高,表明可能有其他不良影响的维生素C浓度更高。有趣的是,我们发现幼虫美联储nutrient-restricted食物也表现出减少DA神经元变性(图S1)。然而,我们表明,维生素C治疗0.5毫米和5毫米不造成营养不良杜赫可拆卸的幼虫。这些数据提出,维生素C的影响PD-like表型没有介导通过饥饿的影响。
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3.4。维生素C在0.5毫米减少多巴胺能神经元的变性杜赫可拆卸的飞过衰老的进程
在PD患者中,DA神经元的变性是进步的老化(5]。苍蝇的DA特异性神经元击倒杜赫也表现出了进步DA神经元的损失(37]。因此,我们评估了维生素C对DA神经元的数量的影响在成年苍蝇在第一天,15日和30日。0.5毫米维生素C的浓度选择这个实验是基于最有效的改善PD-like表型杜赫可拆卸的幼虫对待这个浓度。结果表明,数量有减少DA神经元和神经退化的水平随着年龄的增加(数据4- - - - - -7)。集群的数量表现出DA神经元的损失从第一天增加到30天。在第一天,更高层次的DA神经元变性杜赫可拆卸的苍蝇与控制苍蝇仅仅发生在一个集群(PPM3)(图4)。在15天,有两个集群(PPM1/2和PPM3)体验更高水平的DA神经元损失杜赫可拆卸的苍蝇(图5)。在30-day-old苍蝇击倒的杜赫集群的数量表现出更高层次的DA神经元变性增加到5 (PAL, PPM1/2 PPM3, PPL1, PPL2,和PPL2)(数据6和7)。然而,维生素C治疗减速引起的神经退化的进展杜赫可拆卸的DA神经元。杜赫击倒苍蝇治疗维生素C的DA神经元数量较多PPM3集群在第一天,PPM1/2, PPM3,和PPL1 15天,和所有五个集群在30天比未经处理的可拆卸的苍蝇。此外,没有明显差异的DA神经元之间维生素C-treated击倒的苍蝇和未经处理的检查时间(数字控制苍蝇4- - - - - -7)。这些结果表明,维生素C可以预防DA神经元的变性引起的杜赫击倒的老化。
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3.5。长期食用维生素C的攀爬能力下降造成的杜赫可拆卸的苍蝇
上述数据表明,维生素C在0.5毫米可以减少DA神经元的变性在成年苍蝇,这表明机车的能力杜赫击倒苍蝇将提高0.5毫米维生素C,因此处理时,然后我们进行登山化验调查长期治疗的效果与0.5毫米维生素C在机车能力。结果显示有攀爬的能力降低杜赫击倒苍蝇与控制苍蝇(图8(一个))。维生素C治疗浓度的0.5毫米不影响控制苍蝇的流动(图8 (b))。然而,杜赫击倒苍蝇更敏感比控制幼虫和表现出减少维生素C在攀爬能力接受维生素C在羽化后第一天,之间没有显著差异在流动处理和未经处理的可拆卸的苍蝇。在第五天,第十天,维生素C-treated击倒苍蝇流动表现出低于未经处理的可拆卸的苍蝇(图8 (c))。结果表明,除了神经保护作用,长期治疗的维生素C也可能对飞行生理产生副作用。
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4所示。讨论
帕金森病是最常见的神经退行性疾病之一,在世界范围内(1]。然而,当前的治疗仅仅支持控制PD症状但不能治愈这种疾病43,44]。越来越多的证据表明氧化应激参与的神经退行性疾病包括帕金森病(45- - - - - -47]。因此,抗氧化剂是一种很有前途的治疗(48]。
以前的研究报道,果蝇模型与DA特异性神经元击倒杜赫的相同器官UCH-L1,展出PD-like表型特征的进步机车障碍,DA神经衰弱,损耗的多巴胺(37]。此外,最近的一项研究提供的证据表明,击倒杜赫诱导细胞内活性氧水平幼虫眼睛形象光盘和成人的大脑39]。抗氧化剂如姜黄素(1毫米)和维生素C(0.5毫米)可以防止机车缺陷和神经退化引起这击倒37,39]。这些建议杜赫可拆卸的飞是一个潜在的治疗PD模型筛选抗氧化剂。因此,在本研究中,我们使用果蝇模型的可拆卸的杜赫评估的剂量和时间影响维生素C治疗PD-like表型。
维生素C是一种重要的抗氧化剂和营养在人体中扮演许多重要的功能,尤其是在大脑。维生素C的生物功能包括抗氧化剂,酶的辅因子,神经调质(25,49]。人类已经获得维生素C通过食物和补品由于无法合成维生素C (24]。几项研究已经报道,缺乏维生素C与PD和膳食维生素C摄入量减少PD的风险(27- - - - - -29日,50]。此外,左旋多巴吸收提高老年PD病人当他们收到cotreatment维生素C (51]。此外,维生素C在几个研究PD模型和表现出积极的效果。在在体外人类DA神经元的模型,维生素C可以预防谷氨酸引起的细胞死亡(31日]。维生素C治疗也可以推迟攀爬能力在人类的损失α-synuclein-expressing飞行模式32]。然而,只有很少的研究没有提供足够的证据的维生素C治疗PD的潜力。
我们的研究结果表明,维生素C改善爬行能力和DA神经元的损失杜赫可拆卸的幼虫。维生素C在0.5毫米可以提高爬行能力击倒的幼虫;然而,没有改善机车能力更高浓度(2.5毫米和5毫米)。此外,尽管长期治疗与维生素C在0.5毫米可以改善进步的DA神经元的变性,这种治疗导致成人攀爬能力下降阶段。结果表明,除了神经保护作用,维生素C残留可能会影响飞生理学。证实了这个假设爬行化验的结果与特定击倒的幼虫杜赫在pan-neurons。在幼虫pan-neuron-specific击倒杜赫,爬行能力可以提高维生素C治疗和改善的程度并非所有检查中不同浓度。这个建议更多的神经元被击倒的影响杜赫;因此,更多数量的维生素C可能需要减少降价的影响,导致减少维生素C水平残留物和副作用。此外,维生素C的摄食行为也影响第三龄幼虫早期阶段,导致减少的食物摄取能力(5毫米)和控制杜赫可拆卸的幼虫(在0.5毫米、2.5毫米和5毫米)。
维生素C的副作用也观察到人类。通常,维生素C的饮食建议(RDA) 90毫克和75毫克/天为成年男性和女性,分别(美国医学研究所,IOM) [52]。高水平的维生素C的消费一直在报道负面影响生理(53]。例如,大剂量的维生素C管理导致肾衰竭和草酸肾病(54,55]。此外,维生素C也可以作为氧化剂导致氧化应激在病理条件下(56]。这些表明,维生素C不仅神经保护的影响也产生不利影响的过量消费这种化合物。因此,有必要考虑维生素C对治疗PD的影响存在剂量依赖的相关性。
数据可用性
本研究的所有数据都可以从相应的作者在合理的请求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
黄齐的人安和刀我的灵同样co-first作者这项工作。
确认
这项工作得到了国家科学技术发展基金会(NAFOSTED),越南,106 - y。06年-2014.14,越南国家大学在胡志明市(VNU-HCM)授予B2014-18-04数量。
补充材料
图S1:食品限制的影响幼虫体重和大小和DA神经元的数量。杜赫可拆卸的幼虫(TH-dUCH KD)喂养标准食品营养(100%),标准含0.5毫米维生素C的食物营养(100% + 0.5毫米vitC)或nutrient-restricted食品营养成分(50%)。(一)身体的重量杜赫可拆卸的幼虫时降低了18%美联储nutrient-restricted食物(单向方差分析与Dunnett测试,和 ,人口规模和生物的复制 ,误差线代表数据的标准差)。(B)的体型杜赫击倒nutrient-restricted食物喂养的幼虫时减少16%(单向方差分析与克鲁斯卡尔-沃利斯检验和邓恩的测试, , ,误差线代表数据的标准差)。(C)疣状脑叶的图像杜赫可拆卸的幼虫用anti-TH抗体。DL1集群都附上了白色虚线椭圆,和规模酒吧显示100µm。TH-dUCH KD (+;+;TH-GAL4/UAS-dUCH.IR)。(补充材料)