文摘

目标。来确定潜在的线粒体和氧化改变结肠活检从特发性REM睡眠行为障碍(iRBD)和帕金森病(PD)的主题。方法。结肠活检从7 iRBD科目,9例临床诊断PD,和9健康对照组均质5% w / v甘露醇。柠檬酸合成酶(CS)和复杂的我(CI)是spectrophotometrically分析。氧化损伤是评估通过脂质过氧化作用,通过分光光度法,丙二醛和hydroxyalkenal内容或通过抗氧化酶水平的超氧化物dismutase-2 (SOD2)、谷胱甘肽peroxidase-1 (Gpx1)和过氧化氢酶(CAT)的免疫印迹。线粒体DNA的存在(mtDNA)删除评估长PCR和电泳。结果。无意义的下降趋势CI iRBD (;下降23%)和PD患者(;控件(相比下降37%)被发现,:NS)。脂质过氧化是维护组间(iRBD:帕金森病:和控制:;:NS)。抗氧化酶SOD2 (iRBD:帕金森病:和控制:)和Gpx1 (iRBD帕金森病:和控制:组间差异不显著。猫只检测到2控制和1 iRBD主题。一个iRBD病人提出一个mtDNA删除。

1。介绍

帕金森病的主要病理特征(PD)的损失nigral多巴胺神经元的中枢神经系统(CNS)和聚合的异常的存在α所谓的路易小体和神经突路易-核蛋白,剩下的神经元。路易病理类型也出现在外围自主神经系统(锅)1,2),是发生在早期,前驱的阶段。异常聚集-核蛋白并不少见的PD患者的肠神经元和prion-like -核蛋白的行为的证据3]集中注意力在PD的肠神经系统评估的假设-核蛋白的肠道是初始站点聚合(4- - - - - -6]。自-核蛋白在肠神经元的异常聚集在PD,结肠活检可以提供一个独特的组织研究病理生理方面的疾病(4- - - - - -6]。

线粒体代谢功能异常、呼吸、生物能学和动力学提出发挥重要作用的发展和特发性帕金森病的遗传形式(7- - - - - -9]。已发现线粒体改变这个条件相关的中枢神经系统也在成纤维细胞等其他组织和结构描述(10),血小板(11),和骨骼肌12,13]。

复杂的我(CI)线粒体功能障碍是第一个描述关联和PD (14,15]。抑制CI可导致神经元的变性的机制(16]。虽然在线粒体电子传递链是一个高效的系统,电子可以从链泄漏,特别是从CI (17)的线粒体呼吸链(MRC)和与氧反应,生成活性氧(ROS)。ROS生产导致氧化损伤和神经元死亡PD (18]。ROS-derived细胞损伤的主要机制之一,包括破坏细胞膜的脂质过氧化作用。此外,α-核蛋白寡聚物可以促进脂质过氧化,减少内源性抗氧化剂19]。失败的抗氧化酶机械,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)过氧化物酶(Gpx)和过氧化氢酶(CAT),也可以参与PD,抗氧化酶等不足直接关系到这个障碍(16]。最后,线粒体基因改变也被描述在PD (20.),如线粒体DNA的存在(mtDNA)删除,经常与ROS生成有关。

虽然剩下的主要分子特性的核心PD发病机理是线粒体改变(我),(2)氧化损伤,(iii)处理降解的蛋白质(21- - - - - -23),只有展开蛋白质在锅级别评估(4- - - - - -6从受试者患有特发性REM睡眠行为障碍(iRBD),一种深眠状态,其特征是梦想制定在REM睡眠行为和弛缓。iRBD病人被认为患有前驱的synucleinopathies自多达80%的病人发展神经退行性疾病,与路易体病理(24- - - - - -26]。

公布了强劲的线粒体协会的变化和PD带领我们去探索一些线粒体和氧化参数在外围肠组织可能有助于研究最早的机制在PD神经退化。这种类型的研究可能提供的证据外围线粒体功能障碍的早期PD。

我们假设线粒体氧化改变可能存在于结肠组织与特发性iRBD科目和PD,因此,在前驱症状和临床表现PD患者。这项研究的目的是探索外围线粒体氧化功能理想作为PD的假定的线粒体生物标志物。

2。材料和方法

在运动障碍患者的访问单位和睡眠单位医院诊所的巴塞罗那。人口统计学和临床数据的收集。PD患者和iRBD(后者经多导睡眠图和缺乏临床症状的帕金森症或认知功能障碍)进行了研究。

对照组没有证据的神经疾病或dream-enacting行为是前瞻性和连续参加这项研究。结肠活检的结肠镜检查。控制从胃肠病学服务参与者招募和结肠镜检查的适应症包括常规预防癌症筛查和随访的结肠腺瘤,以及引起腹泻。协议是经医院伦理委员会批准前的人体实验研究研究起始和书面知情同意是获得所有个人参与这项研究。

Nonmotor关于消化系统症状进行评估使用非症状问卷(NMSQuest)项目19 - 21。年龄活组织检查和疾病持续时间(motor PD患者的发作和异常dream-enacting暗示iRBD iRBD患者)也被记录。

神经系统评估的参与者进行了通过运动障碍Society-Unified帕金森病评定量表(MDS-UPDRS)部分我三世,蒙特利尔认知评估排除认知障碍iRBD和对照组。

结肠活检是在病人的胃肠病学部门的标准程序医院诊所的巴塞罗那。

标准的结肠镜检查和3到5活检获得提升,横向,下行,并使用标准的活检钳、乙状结肠如前所述[27]。升序和降序结肠外植体被用于文化和乙状结肠片段在−低温贮藏80°C进行进一步分析。

2.1。样品处理

组织外植体减少了大约4块1毫米²和消毒清洗3 - 5次1 x PBS补充10%青霉素、链霉素、二性霉素b (PSF)。化的低温贮藏乙状结肠活检是使用5% (w / v)甘露醇缓冲区在波特玻璃850 rpm,进一步离心机在650在20分钟。上层清液一直和颗粒再次resuspended 5% (w / v)甘露醇缓冲区,均质,和离心条件。上层清液从离心喜忧参半获得mitochondrial-enriched悬挂。

2.2。实验分析

总蛋白质含量是衡量bicinchoninic酸(BCA)工具分析量化和运行在微型板块,由独立测量样本稀释副本。一组内部标准并行读一起参考样品内部控制。

量化的酶化验(柠檬酸合成酶(CS)和CI)一个内部参考猪肉肌匀浆使用2毫克/毫升。这是黄金标准材料确认验证这样的光谱光度测量的测量,为了更好的描述最优速度,同时保持线性动力学相对于时间和酶浓度。

线粒体含量测定spectrophotometrically通过CS酶活性在比色皿参与三羧酸循环,认为是一个可靠的标记线粒体质量(28]。这个试验是由产品的量化手段反应5、5′dithiobis 2-nitrobenzoic酸在412 nm和37°C。

MRC的CI酶活性测定在量化后的比色皿spectrophotometrically NADH氧化底物和使用特定抑制剂鱼藤酮在340 nm和37°C,其他地方的报道(29日]。

蛋白质含量或CS或CI酶化验后被标准化的程序执行协议的国家西班牙网络CIBERER(未公开协议)。

氧化损伤是由脂质过氧化作用的量化衍生产品:丙二醛和4-hydroxyalkenals,使用分析工具OxisResearch LPO586在586 nm,制造商的指示后(30.]。

SOD2 Gpx1,猫抗氧化酶蛋白水平评估免疫印迹如下。样本DTT-reduced匀浆是加载同样使用sds - page(预制凝胶12%,Novex;热费希尔科学)和湿转移到PVDF膜转移(Amersham Hybond, 0.45µM:通用电气医疗集团)。膜被封锁使用5%脱脂milk-PBS粉解决方案1小时(RT)然后孵化主要抗体1:1阻断缓冲区:PBS 0.4%渐变20的解决方案。SOD2(σ),猫(AbCam)和Gpx1(细胞信号)被用于免疫染色小时孵化(RT),其次是1:2000辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(Biorad) 1小时1:1阻断缓冲区(PBS 0.4%渐变20的解决方案)。增强化学发光(ECL)衬底(热费希尔科学)是用于检测免疫反应性的蛋白质x射线胶片扫描进一步量化带强度。

MtDNA删除长PCR测定使用长COX-F 5′-TTAGCAGGGAACTACTCCCA-3′H和长5′-CGGATACAGTTCACTTTAGCTACCCCCAAGTG-3′10.2 Kb扩增子的引物。线粒体基因组扩增后,在0.8%的琼脂糖凝胶电泳是用红色的安全。

使用SPSS进行统计分析。正常的数据被Kolmogorov-Smirnov测试评估。非参数Mann-Whitney测试使用了独立样本。显著性水平是设定在。

3所示。结果

参与者的人口和临床数据表进行了总结1。总共25成人受试者参与研究包括9 PD (2) Hoehn-Yahr量表得分最高,7 iRBD, 9健康受试者。iRBD患者PD(以上,Mann-Whitney),而对照组相比差异不显著(,Mann-Whitney)。正如所料,UPDRS iRBD相比表现出更严重的参与PD和控制对象。iRBD和对照组得分高于0汽车评估(UPDRS III)患有神经运动障碍,主要是由于关节。PD患者更有可能遭受比iRBD胃肠道症状(,Mann-Whitney)。

低温贮藏匀浆被用于实验程序。神经元轴突的存在证明组织外植体的荧光共焦显微镜(图S1a补充材料,,网上https://doi.org/10.1155/2017/9816095)。

线粒体酶的活动,氧化损伤,由脂质过氧化和抗氧化水平和删除在线粒体基因组测定在低温贮藏乙状结肠匀浆。

CS酶活性显示等效线粒体质量在所有团体(数据未显示)。

没有显著差异趋势也发生在组间的一些参数。有趣的是,线粒体的CI MRC略减少iRBD和PD患者相比,控制。这一趋势降低更明显临床诊断PD患者(图1(一))。氧化损伤测量通过丙二醛和脂质过氧化水平hydroxyalkenal内容略高于PD但不是iRBD学科,相比控制(图1 (b))。线粒体的量化参数并没有呈现显著差异在任何情况下。

没有SOD2的抗氧化酶水平变化和Gpx1被发现之间的组(数字2 (b)和2 (c)、职责)。抗氧化酶的猫只检测到2控制和1 iRBD病人。没有一个PD患者显示猫活性染色。

MtDNA删除缺席,尽管存在一个独特的MtDNA删除iRBD主题是非凡的,如图3。

4所示。讨论

研究替代体内外围预后标记的识别为PD迄今为止有关他们可能允许微创诊断程序,并提供一个窗口进行早期临床诊断和假定的神经保护治疗PD的前驱阶段期间(31日]。便秘是很常见的在PD的前驱阶段和客观的PD患者的结肠功能紊乱最近确定(32]。在分子水平上,存在-核蛋白聚集在结肠活检PD的主题已被广泛讨论为主要诊断因素PD发病前临床运动特性,虽然提供有争议的结果(5,33),和其他差因素,如肠道乙酰胆碱酯酶活性下降,在早期PD(已报告34]。尽管越来越多的关注都集中在寻找预测预后的生物标志物在肠神经系统疾病,没有黄金标准已经达到共识,在结肠和线粒体氧化标记样本iRBD和PD患者尚未探索。

尽管广泛的数据量在线粒体功能障碍与帕金森病有关,我们的研究报告,在前驱症状和临床诊断PD患者的结肠活检没有发现确凿的线粒体的改变。

结肠组织的研究对象线粒体质量,估计CS酶活性,保持在所有组相似,表明没有相关的线粒体生物起源的样品发生的变化。

尽管CI组间的MRC没有出现任何重大的改变,减少的趋势这个活动是可观测的前驱症状和临床诊断PD组控制。这些词酶活性水平略低PD患者的清单。另一方面,氧化损伤的脂质过氧化作用往往不显著增加患者的肠组织而不是iRBD受试者相比,控制。这些趋势可能表明,减少CI酶活性在PD之前可能发生氧化损伤。众所周知MRC功能障碍,尤其是在词的层面上,由于电子泄漏可能导致氧化损伤MRC和随之产生的活性氧的形成,促进氧化应激。在当下研究轻微CI酶活性变化趋势观察iRBD和PD患者,表明氧化损伤的变化随着时间的推移可能继发CI功能障碍。PD的注意的是,先前的研究已经指出在结肠黏膜下层的存在氧化损伤在生理和病理条件下(35]。

抗氧化剂酶蛋白质含量没有显著变化和线粒体SOD2之间Gpx1酶水平组和猫之间没有检测到在大多数情况下,留下一个打开的问题是否这是由于一种艺术事实问题或由于潜在的相关分子等微分意义传递数据。虽然我们的研究结果指出缺乏内源性抗氧化剂之间的关联变化PD外围组织,最近的一项研究描述了特定的血浆的抗氧化水平和脂质过氧化反应的变化作为潜在的有前途的PD生物标记(36]。

MtDNA删除被发现黑质的PD患者或体外PD模型,但是他们并没有被发现在大脑的其他区域和罕见找到mtDNA删除在外围组织。鉴于结肠活检的使用在目前的研究中,毫不奇怪,大多数患者没有任何mtDNA删除,实际上,存在的一个独特的mtDNA删除iRBD主题值得关注。

在目前的研究中,包括群体的一部分,一个以前的工作27),只有一个病人积极磷酸化-核蛋白聚集在黏膜下神经突被包括在内。所讨论的斯派格et al .,低比例的阳性病例可能与活检的部位(如rostrocaudal梯度胃肠道病理的已经被一些作者建议),可能的向心的分布α-核蛋白病理学(从外围中央神经轴突soma),活检的深度,黏膜下自主神经丛的关键一个适当的评估。不幸的是,由于这些可能的限制,任何适当的线粒体功能和异常之间的相关性分析α-核蛋白聚集可以评估。

综上所述,我们的研究结果在肠样品不展示清楚线粒体异常的结肠活检iRBD或建立PD患者。这种缺乏线粒体功能异常可能是由于组织的类型进行了研究。低温贮藏匀浆从结肠活检被用于实验程序。在初步研究中,只有少数细胞培养,可以达到最佳的会议之前经历了细胞的死亡。其他作者成功地获得神经文化从肠道系统通过使用整个肌间神经丛,在人类胎儿组织(37)或在小鼠体外模型(38,39]。在目前的研究中,数量、类型或活检的位置(小、异质细胞类型和肤浅的)可能会阻碍肠神经元的细胞生长在文化或重要的检测线粒体组之间的干扰。

我们的肠胃活检含有上皮细胞,肠胶质细胞和肠神经元。重要的是要注意,除了神经元,肠胶质细胞和上皮细胞,它们存在于胃肠道活检,也在PD(特异表达40]。我们已经证明了肠神经轴突的存在在我们的样本。根据纵向切片的位置,尽管少路易病理学的患病率低于上部肠道,乙状结肠和直肠一直研究到目前为止最常见的网站(41]。在这项研究中,从乙状结肠部分线粒体参数评估的生物材料。根据这些数据,全球线粒体发现此处描述可能被认为代表预期的变化在锅在PD的上下文中。

尽管负面结果,观察到的趋势朝着理想CI酶活性在两组患者(iRBD和PD)指出进一步研究的必要性在锅的线粒体的研究。这样的研究应该解决的作用线粒体干扰作为潜在PD体内生物标志物在不同的网站和肠道深处PD大群患者的活检。

信息披露

c . Moren和我。Gonzalez-Casacuberta应该考虑为主要作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是由Fundacio Privada Cellex,洋底de Investigacion疗养地[授予PI00462/11号,PI13/01455、PI13/01738 PI15/00903,和PI15/00817),综合计划Estatal我+ D +和得到ISCIII-Subdireccion通用de Evaluacion和欧洲区域发展基金(ERDF);杆族de Recerca de la Generalitat de加泰罗尼亚(批准号2014 - 2016SGR 2014/376);InterCiber PIE1400061和cib de心血管Raras (CIBERER ISCIII)的倡议。c . Moren被授予由何塞Castillejo (CAS15/00140)博士后资助从西班牙外交部(Ministerio de Educacion文化y Deporte)。

补充材料