文摘
最进步的黑质多巴胺能神经元的变性(SN)与帕金森病(PD)。这些目前使用的药物的疗效是有限的,而中药(TCM)被用于神经退行性疾病的管理多年。本研究旨在评估修改的影响传统中药煎煮,丛荣京(CRJ),在细胞的存活和凋亡1-methyl-4-phenylpyridinium——(MPP)+-)MES23.5多巴胺能细胞治疗。CRJ准备从三个中药煎煮,也就是说,大芸,草Epimedii,黄精。在这里我们报道CRJ显著增强细胞MES23.5细胞接触后MPP的生存+和抑制细胞内活性氧(ROS)的产生引起的边际产量+。CRJ也阻止了边际产量+对待MES23.5细胞凋亡减少磷脂酰丝氨酸的外化和增强bcl - 2、Bax蛋白表达率。信号蛋白质如JAK2、STAT3和ERK1/2也参与到行动中。综上所述,这些研究结果提供了一个初步的机制来支持临床应用中药配方的PD和可能的其他神经退行性疾病与ROS损伤和细胞凋亡有关。
1。介绍
帕金森病(PD)是一种神经退行性疾病由于进步和黑质多巴胺能神经元的选择性变性(SN),导致纹状体多巴胺的损耗(1,2]。尽管生化和分子发病机制帕金森病的多巴胺能神经元的损失尚未完全了解,相信发病机制是多因素疾病包括氧化应激、线粒体功能障碍,glutamate-mediated会和炎症(3,4]。新兴的证据也表明,凋亡途径可能参与了帕金森病的多巴胺神经元的死亡(5,6]。防止多巴胺能神经元的凋亡处理将是有用的治疗帕金森病。
传统中药(TCM)已被证明会降低PD症状多年的发展(7- - - - - -10]。它对治疗效果在控制疾病的进展,减少剂量的多巴胺治疗(10]。我们以前测试五个中草药(,等•女贞子大芸,草Epimedii黄精,精液Cuscutae)与“kidney-tonifying”属性根据中医理论和发现的一些草药显示更好的神经保护效应在PD小鼠模型(11)和H2O2受伤MES23.5细胞模型(12司立吉林)相比,单胺氧化酶抑制剂用于减少帕金森病的早期症状。这些草药证明微分由(1)增加亲神经的神经保护效应等因素神经生长因子(神经生长因子),脑源性神经营养因子(BDNF)和神经胶质细胞line-derived神经营养因子(GDNF) [11,12),(2)减少神经元凋亡的抑制proapoptotic FasL caspase-3表达式和凋亡bcl - 2表达的增强11,12),和(3)增加酪氨酸羟化酶(TH)活动11]。PD的发病机制很复杂,预计的草药配方可能可能提供更广泛的神经保护效应由于多目标行为(13,14]。因此,在目前的研究中我们选择三种中草药(大芸,草Epimedii,黄精)我们之前发现准备制定中药汤,即从荣京(CRJ),进一步研究草药配方的影响在MPP的细胞存活和凋亡+对待MES23.5细胞。
2。材料和方法
2.1。材料
胎牛血清(的边后卫)和细胞培养基杜尔贝科的修改鹰培养基营养Mixture-F12 (DMEM / F12)从生活购买技术(美国沃尔瑟姆,MA)。AG490 (JAK2抑制剂),PD98059 (ERK抑制剂),3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT) 1-methyl-4-phenyl-pyridiniuiodide (MPP)+),2′,7′二乙酸-Dichlorofluorescin (DCFH-DA)购买的σ(圣路易斯,密苏里州,美国)。膜联蛋白V凋亡检测设备购买的凯基生物生物技术(中国南京)。phospho-JAK2抗体(p-JAK2)、JAK2 phospho-STAT3 (p-STAT3), STAT3, phospho-ERK1/2 (p-ERK1/2) ERK1/2, bcl - 2,伯灵顿β肌动蛋白从细胞信号技术购买(美国贝弗利,MA)。
2.2。水提物的制备
中国传统的中药材,大芸(肾阳Cong荣),草Epimedii(阴阳霍),黄精(黄静),购买来自福建制药有限公司(福州,中国),仔细验证由生药学实验室和中药根据中国药典(中华人民共和国药典委员会,2005年)。准备CRJ水提物,大芸(50克),草Epimedii(50克)黄精(90克)混合和地面。生草药粉是沉浸在一个总量的10倍(w / v)的蒸馏水为1小时,然后煮2小时。溶液过滤,滤液收集。整个残留物收集并进一步煮总量的8倍的蒸馏水(w / v) 2小时。解决方案是过滤和两个滤液合并,集中和冻干。最终干提取的收益率是25% (w / w)的草本原料开始,结果提取存储在−20°C到使用。的浓度在本研究根据草药原料开始计算。股票的解决方案CRJ(10毫克/毫升)被溶解在PBS的准备,其次是声波降解法、灭菌在100°C,和过滤。
2.3。细胞培养
MES23.5细胞最初建立和开发Weidong勒贝勒医学院博士,美国被培养为李等人的报告中描述15]。简而言之,保持MES23.5细胞在DMEM / F12培养基补充5%的边后卫(美国生活技术,沃尔瑟姆,MA), 1%谷酰胺(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),2%的50 x佐藤的解决方案(12,16),100 U /毫升的青霉素和0.1毫克/毫升的链霉素(美国生活技术,沃尔瑟姆,MA)。这些细胞被维护和湿润5%孵化有限公司2孵化器在37°C。
2.4。MPP+和CRJ治疗
MES23.5细胞被播种在poly-D-lysine (PDL)涂层96孔板的密度1×105细胞每口井。不同浓度的MPP+细胞接种到24或48小时内优化实验条件。评估神经保护效应中,边际产量+包含介质被孵化的24小时后,然后进一步处理不同浓度CRJ 24或48小时。细胞控制只有被培养基不包含CRJ和边际产量+。
2.5。细胞生存能力分析
细胞生存能力被MTT试验检测。表示时间的治疗后,20μL MTT的解决方案(5毫克/毫升)添加到细胞,进一步培养4小时在黑暗的环境中。之后,上层清液被150人μL的DMSO溶液添加到每个盘子里。板进一步动摇了10分钟溶解甲瓒晶体。光密度的测量通过分光光度计(BIO-TEK ELX 800年BioTek仪器,Inc .,佛蒙特州,美国)。刚做好的DMEM / F12培养基作为消极的控制。
2.6。检测细胞内活性氧的生产
细胞内ROS水平检查使用与H2DCF-DA染色流式细胞术被王et al。17]。短暂,细胞治疗是用无血清培养基洗净后的孵化DCFH-DA没有光线为30分钟37°C。细胞被洗,离心机,resuspended PBS。细胞分析FACSVerse™流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲)的激发波长488 nm和荧光信号被FL-1渠道获得。CellQuest数据分析的软件。
2.7。细胞凋亡检测
用流式细胞术检测细胞凋亡的比例膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(FITC)细胞凋亡检测设备(南京凯基生物生物技术有限公司、南京、中国)根据制造商的指示。简而言之,收集的细胞收获和EDTA-free胰蛋白酶。胰蛋白酶的作用被血清培养基中和。至少1×105细胞被收集和清洗一次离心后用冷PBS。细胞在500年被暂停μL绑定缓冲紧随其后的染色(Annexin-V-FITC)试剂和propidium碘(π)。在黑暗中孵化后在室温下10分钟,细胞分析BD FACSVerse流式细胞分析仪(美国新泽西州,正欲)。结果进一步分析使用细胞追求软件。
2.8。免疫印迹分析
控制或治疗MES23.5细胞细胞溶解在里帕裂解缓冲(Beyotime有限公司、上海、中国)包含50 mM Tris-HCl (pH值7.4),150毫米氯化钠,特里同x - 100 1%, 1%钠脱氧胆酸盐,0.1%十二烷基硫酸钠(SDS)、蛋白酶抑制剂(原钒酸钠、氟化钠、EDTA和亮抑酶肽),和phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF, 1毫米)。蛋白质浓度的细胞溶解产物由BCA试验测量。细胞溶解产物(50μg)被加载并分离10% SDS凝胶,然后转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)。墨迹图与p-JAK2探测、JAK2、p-STAT3 STAT3, p-ERK1/2, ERK1/2, bcl - 2,伯灵顿β肌动蛋白(1:1000)在一夜之间在4°C。与TBST洗涤后,膜与适当的稀释二次孵化与辣根过氧化物酶抗体(1:5000)共轭室温1小时。化学发光检测采用免疫印迹基质(ECL)和x射线胶片的可视化。ImageJ软件被用来测量微乐队来自免疫印迹分析。
2.9。统计分析
每个实验进行至少三次,数据被表示为使用Graphpad棱镜v.6.0意味着±SEM和分析。时间进程的变化未配对学生的蛋白表达进行了分析t以及。单向方差分析(方差分析)其次是土耳其的事后多重比较测试是用来比较组之间的差异。的值被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。CRJ增强细胞MPP的生存+对待MES23.5细胞
MPP的浓度+和CRJ MES23.5多巴胺能细胞的治疗是针对本研究使用MTT试验进行了优化。MES23.5 CRJ治疗仅显示没有明显的细胞毒性效应细胞的浓度250μ克/毫升。MPP+治疗了剂量和时间细胞毒性MES23.5细胞浓度的12.5到800年μM(图1(一))。不同浓度的治疗中(100、200和250μg / mL)显著增加细胞MPP的生存+对待MES23.5细胞从65%到91%,从40%到56%(图24小时1 (b))和(图48小时1 (c)),分别为()。
(一)
(b)
(c)
3.2。MPP后CRJ MES23.5细胞活性氧产量减少+治疗
MPP+是众所周知的诱导活性氧的生产,造成神经毒性(18,19]。评估是否MPP的救援+治疗由CRJ MES23.5细胞与细胞内ROS水平有关,ROS的间接测量使用荧光方法。图2显示了一个在MPP ROS水平显著增加+对待MES23.5细胞与控制()。然而,治疗CRJ显著降低MPP后一代的细胞内ROS水平+治疗,MPP相比+独自处理细胞()。这表明CRJ可能出现MPP的神经保护作用+对待MES23.5通过细胞内活性氧的清除。
(一)
(b)
3.3。CRJ减少MPP+全身的细胞凋亡在MES23.5细胞
磷脂酰丝氨酸磷脂是位于内等离子体膜。在细胞凋亡早期,磷脂酰丝氨酸将把外质膜(20.]。磷脂酰丝氨酸的外化表明细胞凋亡的早期事件,可以显示绑定的膜联蛋白V-FITC。π复染色是用来检测细胞坏死或凋亡。在这项研究中,边际产量+积极治疗MES23.5细胞沾膜联蛋白V-FITC 24小时后,表明边际产量+触发凋亡过程。在CRJ面前,膜联蛋白的百分比V-FITC积极染色细胞显著减少(剂量依赖性的方式(图)3MPP),这表明CRJ治疗减少+全身的细胞凋亡在MES23.5细胞。
(一)
(b)
3.4。CRJ增加的比率在MPP bcl - 2 /伯灵顿+对待MES23.5细胞
进一步证实在MPP的细胞保护的模式+全身neurocytotoxicity MES23.5细胞,表达的bcl - 2、Bax蛋白的比例是由免疫印迹分析。众所周知,bcl - 2是凋亡蛋白而伯灵顿proapoptotic蛋白(18]。bcl - 2、Bax的比率的降低可能支持内在mitochondria-mediated凋亡的过程(21,22]。在这项研究中,边际产量+bcl - 2表达下调的蛋白表达上调伯灵顿的表达在MES23.5细胞(图4(一))。治疗CRJ bcl - 2的表达的增加而减少的表达在MPP伯灵顿+剂量依赖性的方式对待MES23.5细胞,导致显著增加()的bcl - 2 /伯灵顿(图的整体比例4 (b))。
(一)
(b)
3.5。调制的JAK2 / STAT3的表达和ERK1/2 CRJ未经处理或边际产量+对待MES23.5细胞
JAK2 / STAT3和/或生存信号通路已报告与bcl - 2、Bax的表达(23,24]。因此,我们试图进一步调查的影响CRJ治疗JAK2 / STAT3的表达和ERK1/2信号蛋白质在我们的模型中。未经处理的MES23.5细胞进行预处理与AG490 (JAK2抑制剂)或PD98059 (ERK1/2抑制剂)1小时,其次是治疗中24小时。总细胞溶解产物被收集和JAK2的磷酸化状态(p-JAK2), STAT3 (p-STAT3)和ERK1/2 (p-ERK1/2)是由免疫印迹分析(数据5(一个)和5 (b))。结果表明,p-JAK2、p-STAT3 p-ERK1/2被发现在未经处理的MES23.5细胞表达。治疗中可以进一步提高p-JAK2的表达,p-STAT3, p-ERK1/2 MES23.5细胞。p-JAK2的激活,p-STAT3, p-ERK1/2 CRJ部分被AG490 PD98059,分别。结果表明,CRJ参与表达式的upregulation p-JAK2, p-STAT3, p-ERK1/2信号蛋白。
(一)
(b)
(c)
(d)
我们进一步测试p-JAK2 CRJ治疗的效果,p-STAT3, p-ERK1/2信号蛋白与MPP MES23.5细胞经过24小时的治疗+(100μ米)。我们发现CRJ(250的治疗μg / mL)在第一个MPP后30分钟和60分钟+治疗显著激活p-JAK2的表达和p-STAT3 ()和p-ERK1/2略有增加()(数据5 (c)和5 (d))。这表明进一步upregulation p-JAK2 p-STAT3,可能在MPP p-ERK1/2蛋白表达+对待MES23.5细胞将与治疗中。
4所示。讨论
目前,多巴胺替代治疗的一线临床管理控制电动机PD患者的症状。然而,治疗只能维持几年由于end-of-dose和开关现象的发展25]。神经保护已成为一个主要的兴趣PD研究[26]。识别药物导致防止多巴胺能神经元细胞凋亡和氧化应激可能可能有助于减少多巴胺替代治疗的剂量和副作用。证据表明,一些活性成分的加速Cistanches草和草Epimedii淫羊藿展览浓度等信息,echinacoside,抗氧化剂和神经活动(27- - - - - -29日]。我们以前的研究表明,不同“kidney-tonifying”中药的煎煮监管apoptotic-related因素以及神经营养因子的表达在PD细胞和动物模型11,12]。由于PD是多因素疾病的病理通路和复杂,单一的草药的神经行为是有限的。例如,在PD小鼠模型,草Epimedii防止损失的活动但不是bcl - 2,黄精能够减少apoptosis-promoting因素的表达模型在TH活动(但没有效果11]。因此,在这项研究中,我们旨在评估治疗的行动中,一种中药配方组成三个选定的中国草药(大芸,草Epimedii,黄精)而不是单一的中草药,边际产量+受伤的多巴胺能细胞模型。我们观察到CRJ可以具有多个明显的保护作用。
MPP+已经证明是一个神经毒素,抑制线粒体电子传递链的复杂的我,导致MES23.5细胞氧化应激和线粒体功能障碍和其他神经细胞类型(30.- - - - - -32]。在这项研究中,CRJ发现MPP后部分废除MES23.5细胞ROS+治疗。这是一个至关重要的观察多巴胺神经元产生ROS包括过氧化氢和羟基自由基在多巴胺代谢(33,34]。相信多巴胺神经元会那么容易受到氧化损伤CRJ的存在。线粒体功能障碍的另一个常见的后果将是内在的起始mitochondrion-mediated凋亡途径。磷脂酰丝氨酸的外化内在质膜和凋亡之间的平衡的交替和proapoptotic bcl - 2家族蛋白质最终导致下游瀑布内在凋亡细胞死亡(20.]。我们的研究表明,CRJ可能发挥核心作用引起的凋亡细胞死亡MPP的预防+通过调制bcl - 2、Bax蛋白和预防磷脂酰丝氨酸的外化。
JAK / STAT信号通路已被公认为一个守恒的信号通路参与生理和病理细胞增殖等事件(35],分化[36,和生存37,38]。堵塞的JAK2 / STAT3通路使用药理抑制剂AG490已被证明会降低神经元生存(38]和废除neuroprotectants的神经保护作用[39,40]。在目前的研究中,重要的upregulation p-JAK2 p-STAT3观察。在MPP的神经保护作用+对待MES23.5细胞可能与JAK2和STAT3磷酸化,从而减少细胞凋亡。
兵是另一个重要的信号通路介导细胞的生存。许多neuroprotectants发现保护神经细胞死亡通过ERK信号通路的激活。激活ERK途径的长期管理丙戊酸(VPA)增强神经突生长,细胞存活率SH-SY5Y细胞(41),ERK-dependent bcl - 2基因的表达,在小鼠胚胎大脑皮层神经元和成人海马神经发生(42]。人参皂苷Rb1防止MPP+全身的细胞凋亡在PC12细胞中通过ERK / Akt通路的激活和抑制SAPK /物和p38 MAPK通路(43]。在这项研究中,治疗CRJ没有显著增加ERK在MPP的表达+但它调节治疗MES23.5细胞ERK在未经处理的MES23.5细胞的表达,还显示瞬时激活ERK在MPP的无意义的趋势+处理细胞。它可能涉及CRJ可能诱发细胞生存途径MES23.5细胞,导致边际产量的减少+全身的细胞凋亡。
5。结论
总之,目前的研究表明了中药配方的重要保护措施,CRJ,包括中国的草药大芸,草Epimedii,黄精在MPP+对待MES23.5多巴胺能细胞。相信中药配方的神经保护”目标。“基于临床发现在这项研究中,推测CRJ配方的管理将是一个潜在的候选人PD或其他涉及氧化损伤和神经细胞凋亡的神经退行性疾病。
的利益冲突
没有利益冲突。
作者的贡献
京Cai导致的设计论文,指导学生完成毕业实验,使付款。Shuifen你们时,温家宝粉丝,汇徐,魏苇完成了实验。何官凯写了这篇文章。Chuanshan徐帮助确认实验结果和共同责任cocorresponding作者。
确认
这项工作是在指导项目科技部门的支持下,福建省Y (2017 0053)。作者表达自己的感谢陈教授完,导演,神经学,宣武医院,首都医科大学,他们的研究的支持。