文摘

核因子红细胞2 2(NRF2)编码转录因子调节的细胞保护机制,是由氧化应激激活的。NRF2所以假设对帕金森病提供保护,到目前为止NRF2单体型已经报道减少患疾病和延迟疾病发作的风险。也NRF2采用核本地化在帕金森病,是指示性的增加NRF2活动。我们已经调查之间的关系NRF2在瑞典和帕金森病病例对照材料,是否NRF2表达水平与NRF2遗传变异、疾病或疾病的发作。使用焦磷酸测序,我们在504年一个intronic和三个启动子的基因变异病人和509个对照组的斯德哥尔摩。此外,我们量化NRF2mRNA表达EBV转染人类淋巴细胞来自患者使用定量实时逆转录聚合酶链反应和控制。我们发现启动子变体之一,rs35652124,与年龄有关的疾病发病= 14.19,值= 0.0067)。NRF2然而mRNA表达水平没有与rs35652124基因型,帕金森病,发病的年龄或在我们的材料。更详细的研究NRF2为了阐明需要这个基因如何影响帕金森病的病理生理学。

1。介绍

帕金森病(PD)是第二个最常见的神经退行性疾病的老龄化;大约有20000人在瑞典受到PD有人口约960万。PD的特点是在黑质多巴胺(DA)神经元的变性(SN),但还有其他神经元的变性。虽然是一个相对大量的帕金森病的病理知识,很少有对病因的理解。现有治疗PD的今天,例如,取代哒,改善的效果哒,或抑制DA的崩溃,不治愈这种疾病,只是减少了症状。为了发展更好的方式打击PD或更好的防止临床症状,一个人必须破解疾病的原因。

通常情况下,没有明确关系的候选基因PD DA系统。相反,他们倾向于一般手机用途,如防止活性分子或参与线粒体功能(1]。一个基因已经被建议授予保护PD是红细胞2 2核因素(NRF2)(600492年人类),染色体上2问。它属于一个家庭一起的基因NFE2(601490年人类)NFE2L1(163260年人类),编码基本亮氨酸拉链(bZIP)转录因子2]。在正常情况下,NRF2不活跃;它位于细胞质中绑定到KEAP1 (kelch-like决定协会蛋白1),一个在E3泛素连接酶复杂,介导NRF2被蛋白酶体降解。在氧化应激反应,NRF2 KEAP1释放和转移从细胞质到细胞核transactivates表达基因与抗氧化活性,解毒酶,细胞生存,抗炎因子(3]。的表达Nrf2的老鼠orthologueNRF2随着年龄的增长而降低,伴随着二期抗氧化酶活性下降,调节的NRF2(4- - - - - -6]。随后,在减少NRF2表达式的结果对氧化损伤的敏感性增加。

在PD,核的本地化NRF2据报道在nigral强烈诱导神经元,但这种反应可能不足以保护神经元免受变性(7]。五个基因关联研究已经出版NRF2与PD的结果变量(8- - - - - -12]。2010年,冯水獭等人进行了基因研究在瑞典和波兰PD材料和确定单体型包括三个子单核苷酸多态性(snp)和五个标记snp有关风险的降低PD的发病年龄以及后来PD (11]。与延迟疾病发病后来复制在一个扩展的研究包括超过1000 PD患者(12]。另一个复制这些snp在台湾的一个子集研究PD人口无法证实这些发现(8]。的重要性NRF2单核苷酸多态性也被评估在中国的PD人口协会被发现有两个其实snp与启动子单核苷酸多态性建议但不是冯水獭et al。9,11]。另一个SNP被发现在澳大利亚样本与帕金森病相关的风险,在这项研究中,也发现几个单核苷酸多态性和单体型影响发病的年龄(10]。更重要的是,单体型之间的协会也被报道NRF2和阿尔茨海默病(AD)以及与老年性白内障和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS) (13,14]。整体看起来遗传变异NRF2影响神经退行性疾病发展的风险如PD和发病的年龄,但随着不同的snp是包含在这些研究,以及单体型的微分分布与不同的种族人群,很难确定什么组合的snp负责协会报告。

NRF2可能发挥重要作用在神经退行性疾病在细胞保护作为一个可行的治疗目标。如上所述,有几个迹象支持的参与NRF2在神经退行性疾病。在目前的研究中,我们调查了四个基因变异NRF2rs35652124 (> G), rs6706649 (G >), rs6721961 (C >),和rs2001350 (> G),及其可能与PD在我们大同质瑞典病例对照材料为了扩展知识NRF2帕金森病的遗传变异是一个风险因素。snp包括在我们的研究中曾被报道与PD在高加索瑞典和波兰的个人组成的材料(11]。我们另外想检查是否NRF2基因表达的不同病人和控制或影响发病的年龄,如果确认与帕金森病有关的遗传变异在这项研究体内表达的影响。

2。材料和方法

2.1。病人和控制

研究PD患者在常规门诊访问卡罗林斯卡大学神经学诊所医院,斯德哥尔摩,瑞典。患者()是瑞典血统无关,平均年龄为67.2岁,诊断年龄是59.4岁,36.7%是女性(表1)。所有患者完成了“英国帕金森症社会的大脑银行临床诊断标准”对特发性帕金森病除了28.2%的一个或多个第一,第二,或第三等级的相对诊断为帕金森病(15]。早发性(EO)被定义为小于或等于50岁诊断和晚发型(LO)被定义为51年或更多的诊断。控制()我们包括神经学神经健康个体参观诊所,PD患者的配偶,匿名献血者,从SNAC-K项目和个人(瑞典国家衰老研究Kungsholmen和护理,http://www.snac-k.se/),平均年龄为71.8岁,57.3%是女性(表1)。病人的样本收集和控制知情同意后,斯德哥尔摩当地伦理委员会的批准。DNA从血液样本中获得使用标准协议。血液从病人和控制个体随机选择个人招募的神经病学临床用于eb病毒(EBV)转染细胞,EO患者(),LO患者()和控制()。所有人类受试者进行调查后的规则1975年赫尔辛基宣言,2008年修订。的一个子集患者()和控制()曾在一组初步研究发表在博士论文(16]。

2.2。通过焦磷酸测序获得的基因分型和qPCR

我们四个单核苷酸多态性的基因NRF2:rs6706649 rs35652124 rs6721961启动子,rs2001350。三个子snp基因分型是由焦磷酸测序(17]。Rs2001350基因分型是TaqMan®定量实时PCR (qPCR)。焦,PCR运行使用Taq酶和两个寡核苷酸引物为了隔离209个碱基对的序列包含三个子单核苷酸多态性;正向引物5′-GAATGGAGACACGTGGGAGT-3′;和反向引物5′-ACTTTACCGCCCGAGAATG-3′(热费希尔科学、Hagersten、瑞典)。正向引物5′末端是生物素化的。PCR是程序如下:变性,在95°C 5分钟,45周期放大在95°C,持续20秒,57°C,持续20秒,30秒和72°C,和终端72°C伸长了7分钟。正向链PCR产品被捕和孤立的链霉亲和素涂琼脂糖珠,然后纯化根据制造商的指示使用filter-probe真空prep-tool。孕育了单链DNA片段测序引物和退火2分钟在80°C。snp rs35652124和rs6706649可以测序序列引物5′-TCACCCTGAACGC-3′, rs6721961测序,测序引物5′-GGAGATGTGGACA-3′。 Sequences were analyzed using a pyrosequencing PSQ 96MA system (BIOTAGE AB, Uppsala, Sweden) using PyroMark Gold Q96 Reagents (QIAGEN Nordic, Sollentuna, Sweden). Rs2001350 was analyzed with TaqMan Fast 7500 qPCR. Rs2001350 was genotyped with a premade SNP genotyping assay, assay ID number C__11634985_10. We used a standard cycling program: pre-PCR reading at 60°C for one minute, polymerase activation at 95°C for 10 minutes, 55 cycles comprising denaturation at 92°C for 15 seconds and annealing/extension at 60°C for 1 minute, and last post-PCR reading at 60°C for 1 minute. TaqMan genotyping mix and assays were purchased from Applied Biosystems/Life Technologies (Life Technologies Europe BV, Stockholm, Sweden).

2.3。巴尔病毒转染的淋巴细胞

从全血淋巴细胞分离使用Ficoll-Paque根据制造商的指示(通用电气医疗集团生物科技公司,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。淋巴细胞培养在RPMI 1640介质(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)与20%胎牛血清、谷酰胺(200毫米)penicillin-streptomycin (5000μg / mL)(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)和环孢霉素(1μL / mL, Apoteket,斯德哥尔摩,瑞典)。转染是通过添加和过滤eb病毒(EBV)感染的上层清液B95-8细胞中。当无限增殖,细胞冷冻保存在−140°C,直到使用[18]。

2.4。逆转录qPCR(存在)

巴尔病毒转染细胞解冻,受移植者,收获细胞计数达到约500万个细胞,在−130°C。从冷冻细胞RNA提取使用RNeasy迷你工具根据制造商的指示(试剂盒北欧,Sollentuna,瑞典)。RNA浓度测定和DNA污染消除。为了避免样本退化、稳定使用QuantiTect互补脱氧核糖核酸的合成RNA逆转录工具包(试剂盒北欧)。互补脱氧核糖核酸模板用于量化基因的表达NRF2PD患者和控制中存在。基因特定的引物设计的外显子4NRF2向前,这是存在于所有mRNA转录:引物5′-CTTTTGGCGCAGACATTCC-3′和反向引物5′-AAGACTGGGCTCTCGATGTG-3′。GAPDH被用来看家基因:正向引物5′-AGCCACATCGCTCAGACA-3′和反向引物5′-GCCCAATACGACCAAATCC-3′(热费希尔科学)。NRF2一对引物了R²值为0.9507,GAPDH启动了R²值为0.9809。根据标准协议执行中存在的反应,使用每个样本一式三份和SYBR绿色存在mastermix从应用生物系统公司(应用生物系统公司,生活技术欧洲BV,斯德哥尔摩,瑞典)。循环是程序如下:控股阶段pre-PCR阅读和酶激活:50°C 2分钟和10分钟95°C,放大了45周期:15秒95°C, 60°C 1分钟,最后融化曲线和post-PCR写道:15秒95°C, 1分钟60°C, 95°C为30秒,15秒和60°C。

2.5。统计分析和图像分析

基因型和等位基因频率PD患者和控制之间的比较。基因型与x平方分布评估协会()测试和等位基因协会使用确切概率法进行了分析。我们使用GraphPad Prism 5.03 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国)的分析,显著性水平为5%,两面值。Bonferroni调整用于对多个测试。控制倾斜的性别分布在病人组(男性= 63.3%),基因型分析验证了使用逻辑回归和性别作为辅助因子;分析运行在叮铃声v1.07 [19]。哈迪温伯格平衡使用软件通过一个免费的在线评估基础测试(20.]。单体型分析是使用软件Haploview4.2 [21]。存在数据分析qBase 1.3.3,软件用于自动化的实时定量PCR分析数据(22),并与学生的评估以及使用GraphPad Prism 5.03或单向方差分析。

3所示。结果

3.1。通过焦磷酸测序获得的基因分型和qPCR

我们有四种常见snp基因分型NRF2基因在504年从509年斯德哥尔摩的瑞典和PD患者个人地理位置匹配控制。一个遗传变异,rs2001350,在于大第二内含子的基因;其他三个单核苷酸多态性,rs35652124 rs6706649, rs6721961,启动子单核苷酸多态性。基因型和等位基因分析的结果可以在表中找到2。基因型和等位基因关联分析显示与PD无显著关联。所有四个snp在哈迪温伯格平衡(数据未显示)。逻辑回归,其中包括性别作为协变量,运行在一个基因型的自由度模型2基因型协会确认的结果分析(补充表在网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/4020198),验证没有偏见倾斜引入的性别分布在病人和对照组。为了分析多个snp的综合效应NRF2进一步,我们跑单体型分析,没有透露任何这四个单核苷酸多态性和PD(补充表之间的联系)。

当患者分层组光电或LO,基因型关联分析表明,一个启动子单核苷酸多态性,rs35652124,明显与EO PD控制(相比= 14.19),(表3);WT基因型AA和突变的基因型GG rs35652124观察更频繁地在PD患者EO比其他两个组的人在,虽然EO杂合的运营商都显著减少。修正后的意义仍为多个测试,。协会是进一步解剖,这表明患者的意义依赖于组早期发病。意义仍然当比较控制只EO患者(),当比较LO病人EO患者(),但不是当比较控件LO患者()。EO PD患者额外的分析比较与LO PD和控制下隐性模型(AA + GA和GG)和显性模型(AA与GA + GG),分别证实了协会在主导模式(= 6.68,),使我们之间建立因果关系G等位基因和EO PD的缺失。等位基因频率rs35652124并不与年龄相关的诊断(),也没有基因型和等位基因rs6706649, rs6721961和rs200350(补充表)。

3.2。信使rna表达分析

自启动子单核苷酸多态性NRF2已经提出影响基因表达在体外,我们想进一步调查是否基因表达与rs35652124基因型(23]。我们在的一个子集上执行中存在的病人包括在我们的基因研究;信使rna水平正常化GAPDH表达和参考样本组成的混合互补脱氧核糖核酸的个人控制。信使rna表达野生型(WT)启动子SNP rs35652124携带者的()相比,个人携带一个()或两个(在这个位置)突变等位基因。我们发现,携带和非携带之间无显著差异(学生的以及,)(图1(一))。值得注意的是最高的个体相对的NRF2表达式(6.76)是纯合子GG rs35652124但把WT三个单核苷酸多态性的等位基因;确切的mRNA水平和基因型在补充表。此外,我们比较了NRF2健康对照组(mRNA水平)和PD患者(),发现无显著差异(补充表)。当分层材料与LO PD患者两组()或EO PD (在所有三个组()表达水平相似)(图1 (b)补充表)。NRF2mRNA水平这些人非常变量,显示高一些表达个人在所有团体。最后我们分析了表达数据对年龄使用线性回归(图2补充表)。我们发现没有表达水平之间的相关性NRF2和年龄都在分析整个样本无论疾病状态()或仅在控制()。

4所示。讨论

我们已经发现了一种基因型与EO PD rs35652124协会。这个SNP基因型频率很难解释,随着EO患者多为野生型和突变等位基因的纯合子。这可能意味着这个遗传变异的外显率模式不太可能加法或乘法。结合基因型时,我们发现两种基因型组成变异的等位基因,杂合的GA或纯合子GG,更常见的对照组和PD患者发病后期,这是符合小G等位基因在早期发病人口少。分析材料在主导模式确认之间的关系没有早些时候G等位基因和疾病发作。因此我们规定,G等位基因赋予一些防止PD推迟发病症状。冯水獭等人之前报道野生型等位基因的启动子组成的单体型rs35652124, rs6706649, rs6721961与后发病的年龄和减少患病的风险11]。在一起,这些数据都指向一种疾病修改角色启动子单核苷酸多态性,尤其是rs35652124。

体外数据显示,启动子单核苷酸多态性分析我们可能影响的转录活动NRF2(23,24]。rs6706649突变等位基因和rs6721961报道导致大幅减少NRF2在转染细胞基因转录,而减少不太明显的突变等位基因rs35652124结合rs6706649的突变等位基因。这一信息,连同我们的基因分析的结果,促使我们调查的功能含义rs35652421 SNP在人体组织23,24]。NRF2信使rna表达量化在病人使用中存在特定的细胞系。尽管存在分析显示mRNA水平无显著差异,当受试者根据基因型分层,量化还透露,NRF2在两组表达水平相当的变量,这些群体的均值的标准误差是因此大。进一步分析基因表达数据没有显示任何区别控制个人和团体之间的PD患者或患者诊断岁之前和之后的50年。还有所有的群体内个体间差异很大。此外,该变量表达水平没有与研究参与者的年龄(从40到83年),这是令人惊讶的考虑先前的报道Nrf2随年龄增加(4,6]。不同群体内的显著差异表达水平在我们的研究表明,有一个监管参数不包括在我们的分析。我们可能会因此假设有更多的监管NRF2单核苷酸多态性可以影响基因的表达NRF2,独立或与rs35652421音乐会。

5。结论

我们已经发现了一种基因型与EO PD rs35652124协会,一个找到支持的参与NRF2在PD。我们的结果表明,NRF2有疾病的修改影响而不是影响疾病风险,但更详细的研究NRF2基因在较大的人口是必要的。量化的mRNA在人类血液细胞显示NRF2表达在对照组和PD患者相似,启动子的SNP rs35652124 mRNA水平没有一个一致的影响。到目前为止,有稀疏的功能的证据可以照亮的遗传变异的作用NRF2在PD。因此,同样重要的是,扩大知识的功能NRF2在病理生理学为了达成这个基因在PD的重要性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者要感谢劳拉Fratiglioni提供控制样本SNAC-K项目。大脑解剖人体组织是由荷兰银行(荷兰阿姆斯特丹)。这项研究得到了瑞典的脑力,瑞典研究理事会,瑞典帕金森基金会,瑞典的大脑基础,Ake Wibergs Stiftelse,和卡罗林斯卡医学院基金。

补充材料