文摘

退行性损失通过在黑质致密部多巴胺能神经元的凋亡中起着主要作用在帕金森病(PD)的发展。我们的体外实验表明,红景天甙(Sal)可以防止1-methyl-4-phenylpyridine-induced细胞凋亡的调节GSK3 PI3K / Akt /β途径。目前的研究旨在提高我们理解1-methyl-4-phenyl-1 Sal的保护机制,2,3,6-tetrahydropypridine——注射(MPTP药物-)诱导帕金森病小鼠模型。我们发现,预处理与萨尔可以防止MPTP-induced增长将向下的时候,爬到地板上。萨尔也阻止MPTP-induced减少运动频率和增加的固定时间。萨尔提供了一个保护在SNpc MPTP-induced酪氨酸hydroxylase-positive神经元的损失,DA水平,DOPAC, HVA纹状体。此外,萨尔GSK3可以增加一种蛋白激酶的磷酸化水平β、移植bcl - 2、Bax的比率和抑制caspase-3的激活,caspase-6, caspase-9。这些结果表明,萨尔防止多巴胺能神经元的损失和PI3K / Akt / GSK3β通路信号通路可能介导的保护Sal注射对MPTP药物,这表明萨尔在神经保护治疗帕金森病可能是一个潜在的候选人。

1。介绍

帕金森病(PD),是最常见的神经退行性疾病之一,显示电动机特点和行为障碍,包括静态震颤、刚度,动作迟缓,姿势步态紊乱。它主要是由退行性缺失引起的多巴胺(DA)神经元的凋亡在黑质致密部(SNpc) [1]。治疗方法包括许多药物一直很确定,但是大多数的药物探索临床批准不能暂停或停止PD的发展不可避免的明显的不利影响(2- - - - - -5]。尽管它的发病机制尚不清楚,目前明显表明一种蛋白激酶,也称为蛋白激酶B,在帕金森病中起着潜在的机械缺陷信号的作用(6- - - - - -8]。它推测化合物药理恢复缺陷Akt活动可能是一个有效的方法,显著的神经营养和凋亡的影响。

磷酸肌醇的3-kinase PI3K / Akt途径是一个关键途径与生存相关,扩散和增长响应在神经元细胞外信号(9- - - - - -11]。PI3K磷酸化的第三位羟基的肌醇磷酸肌醇环然后新兵Akt包含pleckstrin同源域可能促使等离子体膜。丝氨酸/ threonine-specific蛋白激酶,它已经发现,一种蛋白激酶和磷酸化Akt明显减少PD患者的SNpc [6]。此外,活跃的PI3K / Akt途径增加DA神经元细胞的生存和生长通过抑制细胞凋亡(12- - - - - -14]。糖原合成酶激酶3 (GSK-3),作为一种蛋白激酶的底物之一,是一种多效性的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(15,16]。它包含两种亚型的GSK-3α和GSK-3β。一些证据发现Akt可以抑制GSK3的活动通过磷酸化在GSK-3 Ser21α或Ser9 GSK-3β(15,17]。GSK-3β它们失调导致帕金森病理生理学;与此同时,GSK-3激活β已经被证明可以促进许多凋亡状况PD (18,19]。

红景天甙(Sal, 2 -乙基(4-hydroxyphenyl)β-D-glucopyranoside C₁₄H_20.O₇)主要是提取红景天的l,which grows at high altitude localities and usually is used as one of the herbal drugs in worldwide [20.]。萨尔已被证明有多种药理作用,如抗氧化效果(21,22],antiapoptosis作用[23),和维护线粒体功能的24]。我们的论文最近发现,萨尔对1-methyl-4-phenyl-1保护DA神经元,2,3,6-tetrahydropyridine -注射(MPTP药物-)/ 1-methyl-4-phenyl-pyridinium (MPP)⁺-)诱导毒性剂量依赖性的方式通过调制ROS-NO相关的线粒体途径在体内和体外25]。此外,我们还表明萨尔可以防止MPP⁺通过PI3K / Akt通路调节全身的细胞凋亡在体外(26]。结果的基础上,本研究旨在进一步评估Sal的神经保护效应MPTP-induced PD小鼠模型并确定其保护机制与PI3K / Akt GSK3 /β通路,以便它可以提供证据萨尔作为有效的神经保护治疗PD的潜在目标。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

C57BL / 6小鼠(男,八周大,重23-28 g)由第四军医大学实验动物中心和美联储在12 h /光循环温控房间(231°C)。所有小鼠饲养在一个笼子里,食物和水为前7天提供了随意实验的开始。所有程序都是通过动物保健和使用委员会第四军医大学。

注射亚急性MPTP药物的小鼠模型是根据以前公布的方法(27]。所有的老鼠都除以随机数方法分为5组(每组:对照组,小鼠腹腔注射生理盐水(30毫克/公斤/天)为12天,萨尔(高效液相色谱法,国家控制药品和生物制品研究所,西安,中国),小鼠腹腔注射萨尔(45毫克/公斤/天)为12天,MPTP (Sigma-Aldrich,密苏里州,美国)组,小鼠腹腔注射生理盐水(30毫克/公斤/天)注射7天然后MPTP药物(30毫克/公斤/天)连续5天,萨尔注射+ MPTP药物组我,小鼠腹腔注射萨尔(15毫克/公斤/天)注射7天然后MPTP药物(30毫克/公斤/天)连续5天,和萨尔注射+ MPTP药物组II,小鼠腹腔注射萨尔(45毫克/公斤/天)注射7天然后MPTP药物(30毫克/公斤/天)连续5天。最后一次治疗后24 h,老鼠设法后续测试。

2.2。杆测试

杆测试执行以前公布的协议后开始治疗后第一天开始(28]。老鼠被允许适应实验前2天第一个测试环境。每个鼠标放置在顶部的一个极粗糙表面(直径1厘米,55厘米高)向上头朝。鼠标的时间完全拒绝了向下(不),爬在地上(T-LA)被记录。

2.3。开放的现场试验

开放的现场试验评估的变化运动的能力根据以前公布的协议(29日]。一个木箱(厘米³)是水平划分为大小相等的16平方(厘米²)。中央4广场(厘米²)被认为是中心,和周围的4国(厘米²)和4角(厘米²)被认为是边缘。在鼠标放在箱子的中心,一个30分钟的测试会话发起。老鼠被自动记录的动态活动视频跟踪系统(上海Jiliang软件科技有限公司,上海,中国。速度和时间的百分比在竞技场的中心被用来评估电机和行为变化。

2.4。免疫荧光染色

小鼠大脑组织的免疫荧光组织化学进行根据以前公布的协议(30.]。组织被切割成30μ米用滑动切片机切片。在染色实验中,在4%的多聚甲醛固定15分钟紧随其后0.2% Triton x - 100年孵化透化作用的解决方案1 h和1%的牛血清白蛋白2 h。部分被孵化的小鸡anti-mouse酪氨酸羟化酶(TH)抗体(美国CA Abcam)稀释1:200年主要抗体稀释缓冲一夜之间在4°C。在PBS 5分钟冲洗三次后,幻灯片和Alexa孵化萤石®594山羊Anti-Chicken免疫球蛋白二次抗体(美国纽约生活技术)在黑暗中在室温下2 h。封面被安装到幻灯片有0.5%甘油。分析了部分在一个免疫荧光显微镜(IX51、奥林巴斯、日本)。TH-positive神经元细胞5 position-matched部分每个鼠标被ImageJ手动计算软件(版本1.48)由一位技术员蒙蔽了本研究[31日]。免疫反应性的神经元的平均数量每部分代表了宜居性。

2.5。高效液相色谱法(HPLC)分析纹状体多巴胺及其代谢产物的水平

采用高效液相色谱法(HPLC)分析多巴胺(DA)及其代谢产物,包括dihydroxy-phenyl乙酸(DOPAC)和高香草酸(HVA),在纹状体,如前所述32]。纹状体迅速隔离和均质到100年μL冰冷的0.2 N高氯酸。均质化后,离心机在13000 g×15分钟在4°C。上层清液过滤,过滤,然后测试的0.45毫米电化学检测(Eicom,京都,日本)高效液相色谱法。浓度表示为ng /毫克组织。

2.6。西方的屁股

组织收集和地面并结合细胞溶解产物的解决方案。蛋白质与bicinchoninic量化进行酸试验设备(美国纽约生活技术)。在免疫印迹的测试中,电泳后,一夜之间,转移PVDF膜被孵化与抗体一种蛋白激酶,phospho-Akt (Ser473) GSK-3β,phospho-GSK-3β(Ser9)(细胞信号技术、马、美国),b细胞lymphoma-2 (bcl - 2),伯灵顿,或裂解cysteine-dependent aspartate-directed蛋白酶(caspase-3 caspase-6,或caspase-9)(美国CA Abcam)。所有抗体稀释1:500 - 1:3000年,在4°C孵化。膜受到3××5分钟洗在PBS和培养2 h HRP-conjugated anti-rabbit IgG抗体。蛋白质含量测定与数量分析软件(Bio-Rad、钙、美国)。所有实验进行了一式三份。

2.7。统计分析

数据表示为均值±SEM从至少三个独立的实验。统计学意义分析了单向方差分析(方差分析)或学生的t以及在SPSS 20.0版。的值被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。萨尔防止行为障碍

Sal与透析相关行为障碍的保护作用是评估通过杆试验和大田试验MPTP-induced PD小鼠模型。注射杆测试,MPTP药物治疗显著延长的时间不s (),T-LAs ()与对照组(数字1(一)和1 (b))。预处理与萨尔明显阻塞的增加不注射和萨尔T-LA时间+ MPTP药物组我;注射)和萨尔+ MPTP药物组二世(;)注射相比MPTP药物组;然而,它仅仅在萨尔注射+ MPTP药物组没有显著差异二世与对照组(相比)。在大田试验,运动频率显著降低时报》()和静止时间增加s (注射)MPTP药物组与对照组相比(数字1 (c)和1 (d))。预处理与萨尔没有显著变化,运动频率或固定时间在萨尔注射+ MPTP药物组我)。然而,预处理与萨尔显著预防运动频率(),减少了固定时间()萨尔注射+ MPTP药物组II(数字1 (c)和1 (d)),并与对照组相比没有显著差异()。

3.2。萨尔防止TH-Positive神经元的损失

没有显著差异TH-positive神经元的数量()在对照组和萨尔组()(数据2(一个),2 (b),2 (f))。然而,显著减少数量的观察注射TH-positive神经元的MPTP药物组与对照组()(数据2(一个),2 (c),2 (f))。注射了MPTP药物组相比,虽然预处理与萨尔显著恢复TH-positive神经元的数量在萨尔注射+ MPTP药物组我与)(),但仍低于对照组()。然而,与萨尔预处理可以明显恢复这一数字萨尔注射+ MPTP药物组二世()(数据2 (c),2 (e),2 (f)),并与对照组相比没有显著差异()。

3.3。萨尔防止损失的纹状体DA, DOPAC, HVA的水平

DA, DOPAC HVA可以直接表达小鼠纹状体的多巴胺的含量。发现DA水平,DOPAC,和HVA没有统计萨尔组明显的变化,与对照组相比(图3)。显著降低这些注射水平MPTP药物组();然而,统计上显著增加的剂量依赖性的方式注射萨尔+ MPTP药物组我萨尔注射+ MPTP药物组)和二世()。他们只是没有显著差异在萨尔注射+ MPTP药物组II相比,对照组()。

3.4。萨尔防止pSer473-Akt和pSer9-GSK-3水平β

接下来Akt的角色和GSK-3β在萨尔MPTP-induced毒性防护是探索。Akt的总体水平没有区别,GSK-3β在所有组(数字4(一)和4(c))。MPTP诱导治疗减少pSer473-Akt / Akt比率与对照组相比与)()(数据4(一)和4(b))。预处理与萨尔可以防止pSer473-Akt水平萨尔注射+ MPTP药物组我),萨尔注射+ MPTP药物组二世();然而,它仅仅在萨尔注射+ MPTP药物组没有显著差异二世与对照组(相比)。注射此外,MPTP药物治疗诱导pSer9-GSK-3减少β/ GSK-3β率与对照组相比(与)()(数据4(c)和4(d))。这大大阻碍了pSer9-GSK-3β/ GSK-3β水平萨尔注射+ MPTP药物组我),萨尔注射+ MPTP药物组二世();然而,它还没有显著差异在萨尔注射+ MPTP药物组II相比,对照组()。

3.5。萨尔防止bcl - 2、Bax的比率

bcl - 2 /伯灵顿比的平衡是一个指示器proapoptotic激活的信号和相关细胞生存或死亡。它调查了萨尔防止MPTP-induced治疗是否涉及bcl - 2、Bax体内的毒性。它的bcl - 2 /伯灵顿比率显著降低注射的MPTP药物组()(数据5(一个)和5 (b))。预处理与萨尔的bcl - 2 /伯灵顿比显著恢复萨尔注射+ MPTP药物组我),萨尔注射+ MPTP药物组二世();然而,它只是没有显著差异的萨尔二注射+ MPTP药物组与对照组相比()。

3.6。萨尔抑制Caspase-3的乳沟,Caspase-6 Caspase-9

半胱天冬酶家族成员是激活凋亡通路的重要介质。注射免疫印迹显示MPTP药物显著增加裂解的caspase-3水平倍,caspase-6倍,caspase-9倍注射的MPTP药物组与对照组()(数据6(一)和6 (b))。与注射的MPTP药物组相比,虽然预处理与萨尔还存在显著减少的乳沟- - - - - -,- - - - - -,倍,分别注射萨尔+ MPTP药物组我),分歧仍高于对照组()。预处理与萨尔还存在显著降低乳沟Sal注射+ MPTP药物注射组II相比MPTP药物组();和分裂与对照组相比没有显著差异()。

4所示。讨论

目前的研究表明,预处理和萨尔防止行为障碍和SNpc TH-positive神经元数目减少,DA水平,DOPAC, HVA MPTP-induced PD小鼠模型纹状体。萨尔防止MPTP-induced毒性通过GSK3 PI3K / Akt的监管β信号通路,upregulation bcl - 2、Bax比率,和抑制caspase-3的乳沟,caspase-6, caspase-9。

MPTP作为DA神经元的选择性毒素,可引起震颤麻痹已普遍用于PD模型体内(33,34]。解剖大脑生物化学显示,与帕金森病相关的运动障碍是由DA神经元的变性SNpc [35]。外观的PD症状,发现至少50%的神经元nigral SNpc已经退化,和80%的纹状体DA含量减少36- - - - - -38]。在这项研究中,预处理高浓度的萨尔(45毫克/公斤)明显阻塞不时间的增加和T-LA注射相比MPTP药物组。它还阻止了运动频率和减少固定时间。

明显的损失的多巴胺神经元SN是PD的典型病理特征之一。黑通路的四个主要DA通路在大脑中尤其参与DA的生产。TH细胞反应中发挥监管作用变化的生物合成和释放儿茶酚胺(DA、去甲肾上腺素和肾上腺素)2,39]。研究表明,存在错义突变在两个等位基因可能导致严重Parkinsonian-related表型(40]。这是进一步发现这种TH-deficient老鼠在早期会死(3,41]。在这项研究中,老鼠MPTP-treated留在TH-positive神经元的30.4%,这与先前的报道是一致的(37,38]。然而,45毫克/公斤的萨尔TH-positive神经元的保护提供更高浓度与15毫克/公斤的萨尔。此外,它也被发现,萨尔(45毫克/公斤)阻止了纹状体DA的损失,DOPAC, MPTP-induced老鼠HVA水平没有影响他们的正常水平Sal组。这些说明,萨尔发挥重要的保护作用,以防止DA神经元的数量减少和DA水平及其代谢物在黑通路MPTP-induced老鼠。

PI3K / Akt通路是细胞生存的关键组件之一,增殖,在许多不同的细胞类型和增长途径包括神经元(8,42]。一种蛋白激酶,PI3K的衬底,在凋亡通路中起着主要作用[8,42]。活跃的PI3K / Akt信号通路可以预防注射DA神经元损失MPTP药物或MPTP-like神经毒素43,44]。许多化合物药理说明来发挥他们的神经保护效应对氧化应激激活Akt通路(45- - - - - -48]。此外,压力刺激可以诱发Akt的易位为磷酸化线粒体,线粒体GSK-3的快速抑制紧随其后β通过磷酸化Ser9 [49]。的磷酸化GSK-3β细胞凋亡的一个决定因素,已被证明导致神经细胞死亡(13,50,51]。注射在这项研究中,结果表明:MPTP药物治疗诱导pSer473-Akt / Akt水平和pSer9-GSK-3下降β/ GSK-3β的水平。只有更高级别的萨尔(45毫克/公斤)可以防止他们的水平。因此,结合我们目前的研究和先前的研究26),它是证明预处理与萨尔可能增加pSer473-Akt和pSer9-GSK-3水平β在体外和体内。

bcl - 2家族成员,凋亡或proapoptotic监管者,在细胞活动中发挥广泛作用[52]。bcl - 2、Bax的比率,作为一个指示器proapoptotic激活的信号,与细胞的生存或死亡(19]。Akt上调bcl - 2的表达,从而导致细胞生存通过磷酸化和抑制proapoptotic蛋白质如伯灵顿(14,53,54]。在这项研究中,萨尔(45毫克/公斤)治疗显著抑制MPTP-induced伯灵顿的bcl - 2水平和提高水平的降低。还在细胞凋亡(至关重要55]。一种蛋白激酶磷酸化caspase-9促进细胞存活(14]。它还磷酸化caspase-3和caspase-6,从而抑制其proapoptotic功能在不同的细胞系(42,50,51]。在这项研究中,预处理与萨尔(45毫克/公斤)显著降低caspase-3的乳沟,caspase-6, caspase-9注射相比MPTP药物组。这是表明预处理与萨尔通过一个适当的浓度可能会增加antiapoptosis蛋白质和减少proapoptosis蛋白质促进细胞存活。

5。结论

总之,萨尔不仅阻止了行为障碍,还可以抑制TH-positive神经元数目减少和DA水平,DOPAC, HVA MPTP-induced PD小鼠模型。这密切相关的监管PI3K / Akt GSK3 /β信号通路,upregulation正常bcl - 2、Bax的比率,和抑制caspase-3裂解,caspase-6, caspase-9。依照最近报道体外结果,这些结果表明,激活GSK3 PI3K / Akt /β信号通路的萨尔防止毒害神经的条件与MPTP-induced PD小鼠模型。

缩写

帕金森病:	帕金森病
大卫·爱登堡:	多巴胺能
SNpc:	黑质致密部
PI3K:	磷酸肌醇3-kinase
GSK-3:	糖原合成酶激酶3
萨尔:	红景天甙
TH:	酪氨酸羟化酶
MPTP:	6-tetrahydropyridine 1-Methyl-4-phenyl-1 2 3
:	1-Methyl-4-phenyl-pyridinium
bcl - 2:	b细胞lymphoma-2
半胱天冬酶:	Cysteine-dependent aspartate-directed蛋白酶。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

(音译)和香港同样他捐了这项研究。