5 -₂受体结合在帕金森症患者的额叶皮层和α-突触核蛋白Overexpressing老鼠:后期的研究

文摘

的受体是高度参与方面的认知和执行功能和影响在神经退行性疾病如阿尔茨海默病及相关疾病的病理变化。尽管帕金森病(PD)主要是运动障碍,执行功能受损的报道也越来越与这种疾病有关。我们不太清楚这背后的病理生理学。从而本研究的目的是双重的:(1)进行调查帕金森症的大脑和受体结合水平(2)调查是否PD病理相关,α-突触核蛋白(作为)超表达,可以联系在一起改变。绑定密度特殊技能放射性配体(³H] mdl 100.907测量膜悬浮液从PD患者额叶皮层组织。蛋白质含量的进一步使用西方墨点法测量。结果显示高水平伴随着增加在PD的大脑受体结合。在另一项研究中,我们寻找的变化受体在脑额叶前部皮层52-week-old转基因老鼠overexpressing人类。我们进行有针对性受体结合测量基因表达分析。转基因小鼠显示低绑定在额叶皮层,并不是伴随着基因表达水平的变化。本研究的第一个看5 -羟色胺受体水平的差异在PD和关系过度。

1。介绍

帕金森病(PD)是临床症状特点是电机组成的动作迟缓,静止震颤、刚度,姿势不稳定。PD发病机制的主要假设之一,侧重于改变α-突触核蛋白()表达式,神经元积累、聚合包括路易身体的形成的主要诱发因素病理级联(1]。虽然PD主要归类为运动障碍,它现在已经成为承认PD特性复杂的负担不同的电动机和nonmotor症状(NMS) [1,2]。NMS涵盖了一系列的症状包括嗅觉减退、视觉幻觉,睡眠障碍,各种dysautonomic症状、抑郁等情绪障碍,认知障碍,从而影响执行功能(3]。

的关键脑区参与认知和执行功能是前额叶皮层(PFC)。的5 -羟色胺受体是PFC中高度表达的领域,发挥着重要的作用在执行功能(4),在调节情绪反应的认知控制决策(5),使它们必不可少的抑制反应控制,最近已被证明是在PD患者受损6]。改变大脑皮层受体水平已报告在阿尔茨海默氏症患者7]。我们已经表明这是如何与β-淀粉样蛋白积累β-淀粉样蛋白的转基因小鼠模型超表达(8]。在这里我们想调查是否也可以这样PD。

本研究的目的是,一方面,寻找额叶皮层的受体改变从PD患者和死亡的脑组织,其次,探讨利用转基因小鼠是否过度会导致改变的额叶皮质受体。改变含血清素的神经支配曾被描述与PD (9),但缺乏信息有多大程度的5 -羟色胺受体,越来越明确在PFC受体,在这种疾病的影响。

对于第一种方法,我们使用膜悬浮液的人类PD控制大脑的额叶皮层组织为了执行与受体结合的研究特殊技能放射性配体,³H] mdl 100907,而且测量蛋白质含量,免疫印迹。其次,我们使用了转基因小鼠模型overexpressing人为检查区域受体的变化通过放射自显影法分析(³100.907 H] mdl绑定,紧随其后的是基因表达分析。

2。材料和方法

2.1。5 -₂受体结合试验在人类的额叶皮层组织

后期额叶皮层脑组织(BA9地区)PD患者和控制,死者从神经科学的原因,分析被用于绑定。所有大脑样本用来存储在- 80°C,直到进一步的使用。大脑是脑组织从哈佛大学获得的资源中心,美国,和大脑银行Bispebjerg大学医院(丹麦哥本哈根)(bbh - 2010 - 06, I-suite 00971号)。最初的样品总数PD和控件,但每组样本被排除在进一步分析显示意义Grubbs离群值测试。PD和控制样本中包含统计分析表中列出1。

PD患者的脑组织样本提供的哈佛脑组织资源中心,美国。患者的平均死亡年龄为75.4岁,意味着后期指数(PMI) -从死亡到解剖在20.2小时。大脑组织样本提供的控制大脑银行体视学和神经科学的研究实验室,Bispebjerg大学医院,丹麦。对照组的死因是胃肠道(GI),心肺(CP),和/或癌症相关,平均死亡年龄为68.5岁,平均PMI为43.0小时。之间没有显著差异的PD和对照组的年龄死亡(学生的 - - - - - -测试,)和性别分布(卡方检验,),而在采购经理人指数有显著性差异(学生的 - - - - - -测试,)。

对大脑膜制备、450毫克额叶皮层组织每个样本的均质HEPES-buffer(25毫米玫瑰,120毫米氯化钠,氯化钾5毫米,1.2毫米CaCl₂,1.2毫米MgSO₄、pH = 7.5)。匀浆旋转下来5分钟,resuspended,旋转下来10分钟4700 rpm和再次resuspended缓冲区为了获得膜悬浮(MS)为5%。三个整除的女士是储存在零下20°C到进一步使用。三个独立但相同的饱和绑定化验为每个样本进行三种不同的日子。大脑样本蒙蔽。对于每一个试验,100年μL的被添加到每个小姐24-well板一起100μL (³H] mdl 100.907(6不同浓度:0.14;0.28;0.53;1.07;2.12;4.63 nM)和HEPES-buffer直到总量达到300人μ非特异性结合l .(讲)10μ米未标记的MDL 100.907添加到每个浓度。三个总绑定(TB)和讲每个浓度的测量得到³H] mdl 100.907。在室温下培养时间是1小时。

过滤1毫升冰冷的HEPES-buffer之前添加到每个。膜过滤在印刷Filtermat b90 - 120 mm Wallac覆盖聚乙烯亚胺(PEI) 0.05%使用Connectorate过滤机配备了一个24针(Connectorate AG),瑞士Dietikon)。过滤器清洗在冰冷的HEPES-buffer 30秒,晾干加热板在98°C。一旦干,过滤器满是MeltiLex闪烁凝胶,指望闪烁计数器(6通道微β计数器,珀金埃尔默)。每个浓度点的三个测量平均到一个测量和特定的绑定(某人)决心是结核病和之间的差异讲,商议在GraphPad对配体的浓度。和为每个样本值计算根据nonfit线性分析曲线。蛋白质浓度测定湿重。

2.2。在人类的额叶皮质组织蛋白质含量来衡量西方墨点法

组织溶解产物的制备、50毫克的组织解剖了7 PD和6正常对照组大脑从冰冷的等效面积如上所述,立即组织提取试剂二世(表达载体,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。使用麦格纳的组织样本均质溶解仪器(2 x 6000 rpm, 25 s)和相关麦格纳赖氨酸绿珠(罗氏),在一个适当的体积的组织提取试剂(10 mL / g)。匀浆孵化在冰10分钟和离心机在000×16 g 20分钟在4°C。收集上清液,分为整除,储存在- 80°C到使用。上层清液的一部分是留给使用布拉德福德蛋白质测定试剂(Sigma-Aldrich)和随后的测量吸光度是在595 nm使用牛血清白蛋白作为标准。

接下来,每20个样品被稀释准备电泳μg蛋白质的溶解产物4 x NuPAGE®样本缓冲区包含2毫米的交联dithiobis [succinimidylpropionate] (DSP)(皮尔斯,热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)。DSP是溶解在二甲亚砜浓度50 x股票之前,除了蛋白质样品。样本孵化与交联30分钟37°C,其次是增加5%β巯基乙醇(β我在70°C)和孵化10分钟。的应用可约amine-reactive交叉结合DSP还原解理(5%紧随其后β我)之前,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和electroblotting显著改善immunodetectionα-突触核蛋白单体(10]。

样本在NuPAGE 4 - 12% Bis-Tris凝胶电泳NuPAGE 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic acid-sodium十二烷基硫酸盐(生命技术)运行缓冲和Novex®锋利Pre-Stained蛋白质标准(技术)。作为标准,我们使用10μg人类完整的重组α-突触核蛋白(rPeptide)治疗,同时加载到凝胶组织溶解产物。后电泳,凝胶涂抹在奥德赛®0.22硝化纤维膜μ米(LI-COR生物科学,剑桥,英国)使用半干的Bio-Rad装置(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA) 60分钟,使用200 mA /膜恒流NuPAGE转移缓冲(生命技术)含20%甲醇。Posttransfer膜处理0.4%多聚甲醛在磷酸盐(PBS) 30分钟21°C,用Milli-Q水冲洗,然后在奥德赛阻断缓冲区阻塞(PBS) (LI-COR) 1小时21°C。治疗多聚甲醛浓度较低的防止洗了α-突触核蛋白硝化纤维素膜(11]。

墨迹在一夜之间被孵化与兔单克隆抗体MJFR1 anti-alpha-synuclein 4°C (Abcam # ab138501, 1: 5000)与0.1% Tween-20奥德赛阻断缓冲区。膜都是同时也潜伏在一个anti-GAPDH抗体(克隆fl - 335) (# sc - 25778, 1: 1000;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)作为加载控制。膜被洗3 x 15分钟在PBS 0.1% Tween-20和孵化在二级抗体IRDye®800 cw山羊anti-rabbit免疫球蛋白(# 926 - 32211;LI-COR生物科学)1:15 000年和680年IRDye lt山羊anti-mouse免疫球蛋白₁特殊技能(# 926 - 68050;LI-COR生物科学)1:20 000年PBS + 0.1%渐变+ 0.01%十二烷基硫酸钠在黑暗中21°C。随后,细胞膜在PBS洗3 x 15分钟,冲洗Milli-Q水,风干,发达LI-COR生物科学9120年奥德赛红外成像系统。

与图像工作室Lite软件扫描分析了西方的屁股v.5.2 (LI-COR生物科学)。背景减法规范化后的红外信号的加载控制信号。

2.3。转基因动物,h-SNCA老鼠,Overexpressing人类的α-突触核蛋白

老鼠研究中使用的是男性,52-week-old转基因(tg) F28SNCA在C57BL / 6小鼠背景()人类SNCA overexpressing野生型(一个编码基因)控制鼠标的启动子(12,13)和C57BL / 6野生型小鼠(wt) ()(泰康利,h . Lundbeck公司/ S,它是一家丹麦)。动物实验都是丹麦的兽医和食品管理局批准(DVFA),按照欧洲标准进行了动物福利。

2.4。配体

的受体拮抗剂,³100.907 H] mdl (R - (+) -α- (2,3-dimethoxyphenyl) 1 - [2 - (4-fluorophenyl)乙基]4-piperidine-methanol],合成化学和放射性标记NOVANDI AB,瑞典。的特定活动³H] mdl 100.907确定是75.676 Ci /更易(2.8 Tbq /更易)。放射化学纯度大于97%。

2.5。5 -₂受体放射自显影法

老鼠斩首,大脑迅速移除和冷冻干冰粉和保持在- 80°C到切片。前额叶皮层区域被切成15μm日冕部分低温恒温器,thaw-mounted Superfrost +幻灯片,并存储在- 20°C,直到进一步的处理。

放射自显影法是使用1 nM[执行³H] mdl 100.907受体结核病,添加10μM ketanserin决定讲。简而言之,部分是在室温下解冻之前至少30分钟的实验。预培养,部分被淹没在5°C三羟甲基氨基甲烷缓冲液(50毫米tris-HCl缓冲区,pH = 7.4, 0.01%抗坏血酸)15分钟,或没有ketanserin。部分是孵化120分钟在5°C与配体三羟甲基氨基甲烷缓冲液,有或没有ketanserin。放射性配体浓度测定用闪烁计数器。孵化后,幻灯片被浸泡在冰冷的三羟甲基氨基甲烷缓冲液为5秒。片然后再洗2 x 15分钟在冰冷的三羟甲基氨基甲烷缓冲液和浸泡在冰冷的dH₂O,持续20秒。一夜之间,部分被通风橱下晾干。干燥后,部分被暴露在5周的BAS IP-TR2040富士成像板(科学成像,瑞典)一起³H)特定的微尺度在4°C。成像板扫描在bas - 2500磷图像扫描器:佛罗里达州- 9000,Starion。ImageJ用于信号强度的光密度分析。浓度表示为nCi /毫克。量化进行盲目地在不同的感兴趣的区域(roi)据Paxinos和富兰克林的阿特拉斯的老鼠大脑14]。

2.6。RT-qPCR量化的5₂- r表达

RNA提取从新鲜的额叶皮质部分刮掉的平行幻灯片的分配给受体放射自显影法分析。对于每一个动物,总共12冠额部分15μ米厚度汇集在一起。总RNA纯化使用PureLink RNA迷你包(Ambion)后,制造商的指示。所有的RNA样品已经没有dna治疗一旦使用涡轮与DNase细胞工具包(Ambion)根据制造商的指示。悬浮在水中RNase-free RNA样本,并量化使用安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技)。只有样品RIN≥6被包括在分析中。RNA样本存储在- 80°C,直到进一步的使用。

一个两步实时PCR随后执行:匹配的浓度是反向转录成RNA样本cDNA qScript cDNA SuperMix设备(量子生物科学)根据制造商的指示。SuperMix反应混合物由5 x反应缓冲区包含MgCl浓度进行了优化₂核苷酸(dATP dCTP、dGTP dTTP),重组蛋白质、核糖核酸酶抑制剂qScript逆转录酶,随机引物,低聚糖(dT)引物,和稳定剂。互补脱氧核糖核酸的合成步骤执行后孵化的时候5分钟25°C, 30分钟42°C,在85°C 5分钟,5分钟25°C。此后的互补产品在nuclease-free水稀释5倍,保存在- 20°C到进一步使用。

检查RNA样本核DNA的污染负控制PCR是所有样品之前互补脱氧核糖核酸合成省略逆转录步骤。

实时PCR反应进行了使用正序连赢SYBR绿色FastMix (2 x)工具包(量子生物科学)与特定的正向和反向引物受体(鼠标),Rpl13a参考基因(鼠标),和GAPDH(鼠标参考基因)(哥本哈根标签)。引物序列如下:猫:F = 5′gca GTC CAG CAA TGA GC-3′和R = 5′gca GTG GCT TTC TGT TCT CC-3′;甘氨胆酸Rpl13a: F = 5′gga GGG GGT TCT GGT在3′和R = 5′tgt TGA TGC CTT CAC AGC GT-3′;GAPDH: F = 5′猫CAA棉酚GGT GGT棉酚GCA-3′和R = 5′ctg TTG亚美大陆煤层气有限公司柠檬酸CAG GAG ACA-3′。qPCR执行了首次激活在95°C, 30秒40 5秒的周期在95°C的变性,15秒60°C退火(读)结束,伸长和10秒72°C。以验证产品融化曲线分析55和95°C之间每次运行后进行。相对量化(目标/引用)是使用ΔCt方法(15]。

2.7。统计分析

所有统计分析GraphPad棱镜6。显著性水平是设定在一个值≤0.05。所有值都呈现平均值±标准平均误差(SEM)。学生的 - - - - - -测试用于比较的mRNA水平受体分析,蛋白质含量,然后呢和值之间的PD控制大脑样本。多个测试被用于比较受体结合水平h-SNCA tg和wt老鼠不同的roi。

3所示。结果

3.1。高5 -₂受体结合在尸检PD患者的前额叶皮层

绑定试验,进行人类大脑额叶皮层组织,表现出显著的差异的受体PD ()和控制(最大绑定级别较高的)大脑样本,PD组(PD):;控制:;学生的测试 )(图1(一))。没有显著区别PD和对照组相比(亲和力)(PD):;控制;)。PMI(死亡时间)是不同的两组之间(PD和控制)。我们控制了PMI的潜在影响绑定的结果,也没有关系和采购经理人指数(,之间的)或和采购经理人指数(,)被发现。

3.2。增加蛋白质含量在PD的大脑的前额叶皮层区域

洗涤剂溶性单体的蛋白质含量,以电泳和免疫印迹,在PD的大脑相比,增加控件(PD:;控制:;学生的测试 )(图1 (b))。没有观察到的相关性之间的蛋白质受体结合水平在PD的大脑(枪兵;)。

3.3。区域差异5 -₂和5 -₁受体结合Overexpressing老鼠

感兴趣的区域(roi)包括联邦铁路局(额叶皮层),PrL + Cg1/2 (prelimbic皮层和扣带皮层),莫(内侧眶皮层),DLO(背外侧眶皮层),M1和M2(初级和次级运动皮层),和AI (agranular岛叶皮质)。的结果(³100.907 H] mdl放射自显影法结合分析显示显著降低受体结合的联邦铁路局h-SNCA老鼠(h-SNCA:fmol /毫克;wtfmol /毫克;)。没有显著差异受体结合的ROI测量(图2(一个))。

3.4。没有区别在5 -₂受体基因表达水平

结果RT-qPCR显示没有区别(h-SNCA:;wt;)受体基因表达的额叶皮层h-SNCA老鼠相比wt老鼠(图2 (b))。

4所示。讨论

在这项研究中我们看到改变受体结合水平从PD患者额叶皮质,和使用tg h-SNCA小鼠模型,我们另外寻找是否超表达可能与变化有关受体结合和基因表达。在体外受体结合研究死亡的脑组织从PD患者增加确实显示更高水平受体结合的水平,更高的最大约束力(在PD的大脑。结果使用验证人类因为overexpressing小鼠模型(12,13]显示低在联邦铁路局皮质受体结合水平h-SNCA转基因小鼠。的差异受体结合水平并没有伴随着基因表达下降。

据我们所知,这是第一个研究直接观察受体结合水平后期组织样本从PD的大脑的额叶皮层与帕金森病相关的病理是过度。以前,至少有两项研究解决的问题受体PD的大脑额叶皮层的变化。从1998年的一项研究调查了突触后受体在八PD患者的大脑皮层(16]。它也发现的增加受体结合的PFC后期PD组织,利用配体其他比这项研究(8-OH-DPAT和ketanserin)。最近,一个Single-Positron-Emission-Tomography (SPECT)的研究中,使用(^123年我]5-i-r91150配体,报道低受体结合的前部纹状体和前运动皮层和增加受体结合在治疗PD患者的枕叶皮质区(17]。然而,没有显著差异受体结合检测在额叶和顶叶皮层。与我们的研究结果可以解释这种差异的病人包括在后者研究在疾病的早期阶段,因此无法直接同我们的病人组PD患者组成的结束阶段。PD根据Braak登台,中缝核,血清素激活的投影的起源黑质、纹状体、苍白球、丘脑核、丘脑、大脑皮层连接包括额叶皮层和皮质区域的PFC areas-core结构cortico-basal ganglia-thalamo-cortical循环妥协在PD (9),成为越来越多的影响在第三阶段第二阶段和完全影响(18,19)——血清素激活的系统主要是在疾病的后期影响。另一种解释可能是,与Melse等的研究。17),包括犯人的病人,我们不能排除影响医疗的受体upregulation PD患者观察到。

除了绑定的水平更高受体PD的额叶皮层的大脑,我们的研究发现更高浓度的PD控制相比,相对应的视图,积累在PD病理中起着重要作用。总的来说,重要的是要考虑到在研究Melse et al。17和陈等。16),在我们的研究中使用了相对较小的样本大小与不确定的结果的风险。不过考虑到这一点,我们可以同意联合的结果指向疾病相关的变化受体水平可以与一些相关的认知和执行功能障碍在PD。需要更多的研究来进一步追求这个想法。

在第二部分的研究中,我们的目的是调查是否改变受体结合和表达可能与过度。这里结合水平的下降受体被发现在联邦铁路局在overexpressing老鼠。这个地区是PFC的一部分地区,尽管它的确切功能仍然是未知的,联邦铁路局最有可能参与的一些认知过程与执行功能有关。联邦铁路局已经提出了走在人类研究中很重要/不方便任务性能(20.]。行/不行任务措施注意力和反应抑制控制(21,有趣的是这些都是新诊断药物天真PD患者的功能障碍(6]。受体结合水平观察到的差异overexpressing老鼠不是伴随着基因表达的差异。较低的受体结合h-SNCA老鼠可能因此是由于监管效果的转译后的水平。

为什么改变受体结合水平显示相反的方向在PD的大脑和转基因动物模型的超表达是令人费解。在我们分离的小鼠模型的特定段PD-that背后潜在的病理是过度。在人体组织的方方面面PD病理以及超表达,也就是说,多巴胺能退化,在,因此增加的复杂性可能影响的机制受体。纹状体变性也导致下降在PFC绑定,如6-hydroxydopamine-induced帕金森大鼠模型(22]。的变化受体水平可能是背后的更多方面的病理学PD的结果,没有过度直接相关。我们不能排除在PD的大脑受体upregulation观察也可以由于补偿管理这群病人药物影响,也就是说,抗抑郁药或抗精神病药物;我们没有访问这些信息从病人材料用于本研究我们无法确定这一点。

总之,在PD的大脑,我们发现高水平的与更高水平的受体结合在一起。协会不支持转基因小鼠模型的结果,从而指向一个更复杂的和多维的解释变化中发现PD。然而,从目前的研究最重要的发现是,受体似乎在PD中特异表达。领域的进步靶向治疗已经被表现在PD精神病管理例如[23]。解决这种受体在未来的研究与理解和治疗相关的一些认知和执行功能障碍在PD。

相互竞争的利益

作者没有利益冲突声明。

确认

这项工作是支持的Lundbeck公司基础。它是一家作者感谢哈佛脑组织资源中心,美国捐赠的PD的大脑。

引用

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