文摘
帕金森病(PD)是一种最常见的神经退行性疾病的临床三:震颤、运动不能和刚度。几项研究已经表明,PD患者显示干扰嗅觉作为最早的,非特异性nonmotor疾病发作的症状。我们试图用果蝇黑腹果蝇作为一个生物模型探索LRRK嗅觉功能功能丧失突变体,为PD之前证明是一个有用的模型。令人惊讶的是,我们的结果表明,LRRK突变,野外苍蝇相比,呈现出显著增加触觉电图的振幅响应,这是伴随着更高的嗅觉感觉器的数量。尽管上述报告的结果,在变异果蝇嗅觉刺激的行为反应是受损而获得在野生型果蝇。因此,行为修改和形态功能的变化LRRK的嗅觉功能丧失突变体也可以用作一个索引来探索帕金森症的进展在这个特定的模型中,也有学习的目标和发展新的治疗方法。
1。介绍
嗅觉系统是最常见的和古老的感觉系统在动物的王国里,从单细胞生物到高等动物(1],其中最重要的感官形式,由于其至关重要的作用在传达关于外部世界信息的神经系统。在这方面,嗅觉系统的障碍可能有负面影响生活质量2),在某些情况下,它与更高的死亡风险有关3]。几项研究已经证明嗅觉障碍之间的联系和帕金森病(PD)4- - - - - -9]。尽管PD通常被认为是运动障碍,多项研究表明,PD nonmotor症状可能对生活质量有更大的影响的措施,制度化水平,或健康经济学(审查,看10])。此外,在PD nonmotor障碍,嗅觉障碍往往先于运动症状,代表一个潜在的预测PD的标志(11]。实际上,相同的路易小体出现在黑质(12],严格相关典型PD的发病运动症状,是后一步的病理过程。事实上,最初的路易小体的存在已经清楚地观察到在延髓和嗅球,因此前中脑的连续参与,间脑的核,和大脑皮层13]。
虽然现在清楚的是,PD与风险因素的组合,包括环境有毒物质和遗传倾向14],它的许多风险因素可能与疾病发病的时间尚不清楚。
此外,关于遗传倾向,只有有限的比例是由于单基因疾病的形式(15]。在几个基因突变与PD的病因学,那些与富亮氨酸重复激酶2基因体内基因LRRK2()实际上是被称为最常见的家庭负责和零星的障碍情况下(16- - - - - -18]。两个常见的变化LRRK2描述了基因:G2019S和G2385R [19]。其中,最常见的(G2019S)占3 - 6%的家庭占主导地位的PD和1 - 2%的零星的形式的南北梯度G2019S频率在欧洲国家和达到频率高达41%在北非的情况下(20.),而第二个变化(G2385R)是常见的主要在亚洲人口(19,21]。到目前为止,这些变化已报告之间存在明显的差异,说明一个更复杂的表型G2385R突变携带者比LRRK2G2019S突变携带者(19]。
虽然在炎症过程中体内基因LRRK2证据作用,endolysosomal系统和细胞骨架损伤已被确认22),其参与PD开发仍没有完全定义。有趣的是,不同的研究强调,体内基因LRRK2给定突变携带者显示临床和病理变化表现的障碍,与nigral变性与缺失和有限或广泛扩散的路易小体(16,17,23- - - - - -25]。然而这表型和病理变化,发现在几乎所有单基因引起的PD,即使在核心家庭(如SNCA A53T) [26]。
一些关于nonmotor可变性也被观察到的症状,体内基因LRRK2哪里G2019S嗅觉表型可能明显低于特发性帕金森病和可能G2385R突变,目前还不清楚所有G2019S突变携带者有嗅觉障碍19,27- - - - - -36]。
鉴于上述报道表型变化PD嗅觉功能障碍,似乎有特别感兴趣的一个简单的模型来研究这个nonmotor症状,尤其是在体内基因LRRK2的突变。
体内基因LRRK2的基因编码异常大的蛋白由2527个氨基酸组成的广泛表达于大脑和其他器官37- - - - - -40]。体内基因LRRK2的角色,贝里克和哈维审查中列出22),包括神经发生和神经突产物、细胞骨架组装、内吞作用/囊泡贩运和自噬协调。
LRRK2是ROCO蛋白家族中的一员,其特征是存在两个守恒的领域:中华民国在复杂的蛋白质(Ras)域属于Ras / GTPase总科和软木域(中华民国的c端)。三个进一步描述了守恒的域:富亮氨酸重复(远程雷达);酪氨酸激酶催化域(MAPKKK);最后一个WD40域(17]。后者是至关重要的在泡排序等几个基本细胞功能在突触囊泡内吞作用和胞外分泌vesicle-mediated运输以及细胞骨架组装(41,42]。
最近,德玫瑰et al。43)报道,果蝇LRRK2功能丧失删除域WD40突变(;突变体,44,45])显示运动年龄相关性障碍和相关的线粒体损伤胸神经节。此外,触角叶的线粒体损伤检测区域,嗅觉信号从外周化学感受器的项目。类似地,形态学损伤报道了Poddighe et al。46在另一个果蝇突变等也显示,嗅觉检测,减少在电生理记录嗅觉信号和嗅觉行为。
在此基础上,本研究的目的是评估任何可能的嗅觉功能障碍果蝇LRRK2 PD模型体内基因LRRK2相关突变()。这个模型最接近体内基因LRRK2接近人类G2385R突变,发生在人类WD40域和帕金森病的一个危险因素。结果表明,突变体提供了一个意想不到的戏剧性的电生理响应的振幅增加,但嗅觉歧视、减少对野生型果蝇(WT)。
2。材料和方法
2.1。昆虫
对这些实验成年野生型(WT;Canton-S)和突变体(,# 34750,从布卢明顿股票中心)黑腹果蝇(Dm)男性使用。从蛹出现后不久,WT或突变的男性与女性。WT和变异果蝇饲养标准cornmeal-yeast-agar介质在受控环境条件(24 - 25°C;相对湿度60%;光明/黑暗= 12/12小时)。苍蝇等10 - 15天的年龄测试根据先前的实验(43]。
2.2。触角电图(各地)录音
触角电图(各地)进行录音在活的有机体内如前所述(47,48]。
通过考虑昼夜周期在嗅觉灵敏度49),WT和变异果蝇总是并行测试。短暂,生活10 - 15天大雄性苍蝇单独插入在100年μL截断塑料吸管,头顶端突出。准备用牙科蜡固定在显微镜幻灯片和定位的观众奥林巴斯BX51WI光学显微镜(奥林巴斯、东京、日本)。玻璃毛细管银钢丝满心导电0.15 M氯化钠溶液。录音玻璃电极轻轻放置在触角的顶端细绳,而参比电极插入复眼。坚毅不屈的信号放大与一个AC / DC探针,然后获得一个IDAC-4接口板(Syntech【NL)。木炭纯化和湿润气流不停地吹在天线(速度0.5 m / s)通过一个玻璃管,从天线放置约1厘米。包含一个odour-loaded巴斯德吸管的滤纸(5毫米×25毫米)在玻璃管插入一个小洞。气味刺激是由注入一股净化空气(0.5 s 10毫升/ s气流)通过吸管使用刺激交付控制器(Syntech)。
气味刺激测试被溶解在己烷和提出了系列从轻微到较高的浓度(职责。,0.01,0.1,1,v / v)的10%。1-Hexanol被选为其著名的刺激性的活动果蝇(50- - - - - -52),和1-linalool terp通常存在于植物,被选为其能力激发嗅感觉神经元在不同种类的昆虫53]。作为标准参考,1-hexanol当时管理v / v稀释10%的开始实验,确认天线的活动。1-hexanol和1-linalool都购自Sigma-Aldrich(意大利米兰)。
平均值坚毅不屈的振幅计算,然后通过比较分析获得的结果突变组与WT组。
差异的重要性被重复测量方差分析测试或单向方差分析(HSD紧随其后事后测试)与一组阈值水平的统计学意义(统计软件包)。坚毅不屈的结果表示为平均值+ SEM和由柱状图表示。
2.3。嗅觉行为
Free-walking后进行生物实验过程所使用的德克et al。54]。简而言之,男性WT和有机会选择瓶含有水有或没有气味(1-hexanol或1-linalool)。两个4毫升玻璃小瓶被对称和等距的在一个大培养皿(舞台),然后配备截断吸管技巧。300瓶充满了μL水0.25% Triton X有或没有有气味的东西。坚毅不屈的基础上反应,气味稀释选择陷阱苍蝇是0.1%的化合物。苍蝇的脱水是阻止通过将一个棉花球竞技场3毫升的水。苍蝇是渴望9小时前开始实验。12为每个实验组苍蝇来进行生物(15苍蝇领域)和每个气味源,然后复制三次。来进行生物在环境条件控制,持续了18个小时54),由嗅觉灵敏度的最活跃的阶段(49]。吸引力指数(AI)计算如下:,在这是苍蝇的数量的治疗,在控制数量,是住苍蝇留在舞台上的数量,然后呢是死苍蝇的数量。
获得的数据被表示为平均百分比的苍蝇达到治疗瓶(1-hexanol或1-linalool)或控制瓶(水),通过学生的统计评估以及(统计软件包)和95%的置信水平。
2.4。形态学观察
扫描电子显微镜(SEM), 4-6-day-old苍蝇与二氧化碳麻醉,立即沉浸在己烷,动摇了3分钟去除外部蜡层,然后脱水乙醇分级系列十分钟绝对乙醇浓度,随后风干,最后粘在存根和黄金涂层。至少10个标本制备和SEM观察范使用广达200高的树科学、昆虫学和植物病理学”G。比萨大学Scaramuzzi。”WT和触角感觉器的密度突变雄性决心通过计算不同类型的感觉器的数量出现在样本地区包围电子广场帧(1000μ米2)应用于扫描电镜的屏幕中部鞭毛。鞭毛的此区域被选自普通显示在所有的安排样品和触角的结构允许数容易的每种类型的数量感觉器包括由框架。此外,在这一领域的各种各样的感觉器,除了一种类型(大basiconic感觉器)主要位于基底的一部分鞭毛(53]。感觉器在鞭毛面积计算每个标本;一个天线不同的三种类型的感觉器的数量统计分析地区的男性的两株被学生的评估t -试验以95%的置信度(Statistica 6.0、StatSoft、意大利)。更高的放大倍数是用于研究详细的形态不同类型的感觉器。
3所示。结果
3.1。LRRKWD40突变体显示增强的响应1-Hexanol和1-Linalool坚毅不屈
如数据所示1(一)和2(一个)果蝇的嗅觉刺激天线1-hexanol和1-linalool (0.01, 0.1, 1, 10% v / v)与典型的东亚运动会引起响应波形,也就是说,一个快速的去极化,后跟一个缓慢复苏阶段,以超极化波前完成逆转的基线,在WT和突变体,复极化阶段低于WT。
(一)
(b)
(一)
(b)
与预期相反,其盛响应值与1-hexanol(图后引起刺激1)和1-linalool(图2)突变体在WT高于获得标本,表现出剂量反应的刺激,虽然这种倾向是1-hexanol更为明显。在细节,苍蝇有显著提高()在其盛振幅对WT与1-hexanol刺激后和1-linalool浓度测试,除了最低(数字1和2)。
3.2。LRRKWD40突变体显示损伤1-Hexanol和1-Linalool的行为反应
至于其盛测试,free-walking来进行生物WT成年男性,通过检测反应1-hexanol或1-linalool稀释0.1% v / v。与电生理结果相反,男性提供了一个行为障碍,行为得分显著降低对气味WT对照组(图3)。事实上,在陷阱与1-hexanol化验,odour-trapped昆虫的百分比%的相比%为WT对照组;在1-linalool的情况下,只有%的突变体在瓶的气味吸引相比WT %的对照组。
(一)
(b)
至于水反应,困在空白的鱼饵是苍蝇的数量更高相比WT (和%,分别地。在应对1-hexanol),而昆虫的数量被困在应对1-linalool空白没有差别。此外,在后者,之间不存在差异变异昆虫被困在气味的空白。
3.3。形态学观察
意外增加,各地响应相结合的损伤行为反应突变体对WT带领我们调查任何可能的变化触角的嗅觉器官。
根据我们的结果,WT,之间没有发现差异苍蝇的总结构。如图4(一),天线之间的复合的眼睛在两个坑由一位著名的脸。天线包括三个部分:柱身(基础部分),花梗和鞭毛。茎是由纵向触角缝背。最相关的感觉区,鞭毛熊不同类型的感觉器穿插表皮刚毛通常明显弯曲和皱纹。有4种感觉器:毛形,大basiconic小basiconic,槽感觉器(数字4 (b),4 (c),4 (d))。毛形感觉器是最长的,最主要的感觉器分布在整个鞭毛;大型basiconic感觉器存在主要在鞭毛的基底部分和显示一个多孔的表面(图4 (c)),而小basiconic感觉器存在主要在中间,在远端鞭毛的一部分。槽感觉器存在只有在中央和远端鞭毛的一部分;他们看起来很小,形成的一系列(图6 - 8卫星传回的预测4 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
然而,如表所示1,显著差异被发现在不同类型的感觉器数的平均数与WT鞭毛的选择区域突变体。
在细节,一般模式,突变体显示考虑区域的所有感觉器数量高于WT苍蝇,虽然这些差异只有高倍镜下(图很明显5)。事实上,毛形感觉器的数量突变体的男性数量超过了WT与高度显著差异()。同样,也小basiconic和槽感觉器中突变体与密度略高于男性雄性WT ()。
4所示。讨论
本研究的目的是评估在PD转化模型黑腹果蝇任何可能的体内基因LRRK2嗅觉功能障碍相关的特定突变()[43),通过类比PINK1一项研究果蝇模型(9,46]。
体内基因LRRK2体内基因LRRK2使用平移模型最接近接近人类G2385R突变,发生在人类WD40域和帕金森病的一个危险因素,主要在亚洲人口(21]。
相反(9,46),关于WT坚毅不屈的反应低,我们的结果表明WT相比,突变,提出了意外大幅增加坚毅不屈的振幅响应,这是伴随着更高的嗅觉感觉器的数量。
然而,类似于观察(46)也突变体存在的障碍气味的行为反应。
4.1。LRRKWD40突变体显示增强的响应1-Hexanol和1-Linalool坚毅不屈
在细节,即使显示坚毅不屈的增加反应在任何浓度测试刺激(1-hexanol和1-linalool),最低的一个,没有发现差异阈值突变体和WT之间。尽管感觉器数量的巨大变化在不同的菌株(55),我们不能排除电生理反应的概念是由于sensillar密度更高的鞭毛WT相比,主要是在考虑相关的毛形感觉器的数量可以导致增加总结触角敏感。进一步,我们不能排除一个角色perireceptor环境的化学感受器反应。在这方面,很可能在突变体气味结合蛋白可能是现在和/或与气味更紧密,但是存在的气味降解酶浓度下降也可能(56- - - - - -58]。因此,Corvol et al。59)发现PD患者持续增加一个嗅觉类型蛋白()首次发现的嗅觉上皮细胞(60,61年同源的嗅觉感觉器果蝇天线。
最近,云和公园(62年),分析形状和坚毅不屈的振幅曲线,表明一些参数分析其盛曲线,峰值振幅是最重要的一个,因此它被广泛用于研究气味检测。根据这些作者,形状等参数不能用于有气味的浓度测量但他们可以帮助区分不同的气味。在这方面,我们的结果表明,东亚运动会诱发1-linalool超过1-hexanol所唤起的。坚毅不屈的整体低振幅响应1-linalool对1-hexanol也是按照文献中的数据,根据前与数量减少的口服补液盐对后者(50]。
4.2。LRRKWD40突变体显示损伤1-Hexanol和1-Linalool的行为反应
看着气味的行为反应,1-hexanol吸引昆虫的数量统计高于1-linalool, WT和变异果蝇,但数量突变体困低于WT无论刺激测试。至于两个兴奋剂的功能意义,1-hexanol据报道涉及欲望和厌恶反应苍蝇,即使以极大的变异性的影响(51,63年),它与许多嗅觉感受器神经元(菜)分布在小型和大型basiconic和毛形感觉器(50,53,64年]。在这方面,我们的行为数据点的1-hexanol食欲的反应,从而使文学的差异与上述报道数据。1-Hexanol报道也与许多嗅觉受体(ORs)位于毛形的响应信息素(64年),可以给有吸引力的原因影响我们观察到。换句话说,我们建议可能与性有关的差异,也就是说,本研究对男性和女性的男性使用1:1的比例在研究Knaden et al。51]。我们不能排除其他可能的方法论的不同研究之间的差异。类似的考虑可以为1-linalool以前曾有报道称,这是一个厌恶刺激(51),但这也可能与pheromone-sensitive OR19a毛形的感觉器(64年]。
至于应对水,在我们看来,体内基因LRRK2结果表明突变体被水困在1-hexanol实验,特别是没有区别水和气味的1-linalool指向一个损伤体内基因LRRK2歧视能力的突变体。事实上,即使突变体呈现出更高的电生理反应都刺激WT,突变体的比例去气味下double-choice情况WT苍蝇的一半左右。这些结果可以归因于一个障碍我们发现线粒体形态的触角叶(43),嗅觉神经元的项目。
4.3。形态学观察
我们的观察在触角的鞭毛果蝇WT男性显示存在四种类型的感觉器之前报道(65年为这个物种[]和映射53];此外,突变体没有显示明显的总形态差异对WT,但总体感觉器的数量增加中央鞭毛是高亮显示的一部分。据我们所知,没有数据关联的感觉器LRRK功能;我们体内基因LRRK2回想一下,是参与细胞骨架组装(22),但如何关联删除WD40域增加感觉器数量很难猜测。在这方面,我们回想一下研究菱形果蝇突变体在不同程度上有所改变触角感觉器的形态特征,包括减少或增加的数量和/或缺乏一些感觉器(66年]。
4.4。结束语
我们的功能合并嗅觉感官电生理和行为反应的方法被用来在深度分析的气味检测,目的是考虑嗅觉为PD的诊断标记。
我们的研究结果表明,尽管存在剂量-反应关系和意想不到的高届东亚运动会振幅指向一个“正常”的嗅觉功能,突变体存在的障碍气味的行为反应。在这方面在pioneeristic作用于人类的气味刺激检测相关电生理活动从人类嗅球和主观反应刺激,休斯等。67年声明”的意义这种类型的相关性仍让人怀疑,只要没有迹象表明总反应的生物。”
总之,我们的研究结果表明,嗅觉行为障碍是一种常见的功能果蝇PD模型如和(46)尽管两种截然相反的电生理反应和外围强调这一事实果蝇体内基因LRRK2是一个强大的模型还对吗功能丧失变体。
缩写
| 糖尿病: | 黑腹果蝇 |
| 东亚运动会: | 触角电图 |
| LRRK2: | 富亮氨酸重复激酶2 |
| : | LRRK功能丧失在WD40域 |
| 帕金森病: | 帕金森病 |
| : | PTEN-induced假定的激酶1 |
| WT: | 野生型。 |
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Francescaelena德玫瑰,瓦伦蒂娜变化,保罗·索拉里,Patrizia Sacchetti贡献同样这项工作。
确认
作者要感谢Ignazio Collu博士和古丽亚娜Colella(卡利亚里大学)照顾的苍蝇。