文摘

17α-Ethynyl-androst-5-ene-3β7β,17β三醇(HE3286)是合成androstenetriol二期临床治疗炎性疾病的发展。HE3286是评估在小鼠血脑屏障(BBB)通透性和有效性1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine注射(MPTP药物)小鼠模型的帕金森病(PD)。我们发现HE3286自由穿透了BBB。HE3286治疗显著改善运动功能相比,车辆在rotarod测试(平均58.2秒和90.9秒, ),减少炎性介质大脑中的基因表达(诱导一氧化氮合酶,20%, ;肿瘤坏死因子α40%, ,interleukin-1β33%, 用逆转录酶聚合酶链反应。大脑组织组织病理学和免疫组织化学显示HE3286治疗酪氨酸hydroxylase-positive细胞的数量增加了17%相比,车辆( ),受损神经元的数量降低了38%,相对于车辆( )。l - 3, 4-dihydroxyphenylalanine (l二羟基苯丙氨酸)功效不是HE3286增强并发管理。HE3286政府注射前MPTP药物并未提高功效。我们的数据表明HE3286 PD治疗的潜在作用,并为进一步研究提供了激励。

1。介绍

帕金森病是一种神经退行性疾病的特点是逐步退化的多巴胺能神经元(DAergic)黑质致密部(SNpc)和减少的核背外侧纹状体的多巴胺水平。的纹状体中多巴胺的临床表现为运动障碍,包括动作迟缓、静止震颤和肌肉僵硬。诊断是基于运动症状,这之后才变得明显的损失超过50%的SNpc DAergic神经元和60 - 80%的纹状体多巴胺(1]。长期治疗的帕金森病l二羟基苯丙氨酸通常会导致运动障碍,可以比疾病本身更严重;因此,有一个伟大的替代治疗模式的必要性。注射急性MPTP药物黑变性的小鼠模型概括DAergic神经元损失出现在PD,目前是最常用的toxin-induced PD小鼠模型(2]。MPTP的毒性机制是复杂的,对通过其有毒代谢物,methyl-4-phenylpyridinium (MPP +)离子,由DAergic了选择性神经元通过多巴胺转运体。细胞内,MPP +是一种线粒体毒素,导致神经元死亡通过几种机制,包括氧化应激(3),会引起(4),和炎症(5]。由最近的出版物表明,神经炎症细胞外信号调节激酶(ERK1/2)可以通过hyperactivation NMDA受体,导致会增加Ca+ 2通量,从而,增加一氧化氮(NO)激进的损伤和线粒体应激通过互补机制MPP +的直接行动。有趣的是,NMDA受体hyperactivation也可以激活ERK (6,7]表明NMDA受体激活前馈的潜力。小胶质细胞激活的炎症级联进一步提升没有和其他炎症介质从星形胶质细胞和不良神经元。神经炎症被认为是与PD几十年,但直到最近炎症和神经退化之间的因果关系在PD赞赏和其他神经退行性疾病。由于无菌炎症介质、细胞外的免疫系统可以启动,传播,或回应炎症刺激8,9]。这些刺激可以单独行动,或与免疫系统,产生炎症没有传染病病原体(10]。发现无菌炎症的机制已经被中央澄清进步的病理生理学神经退化(11,12]。炎症机制的说明表明PD的潜在使用抗炎药疾病修改。

HE3286是一种口服抗炎的合成衍生物脱氢表雄酮(DHEA)代谢物,androstene-3β7β,17β三醇(β让)。HE3286是糖皮质激素和性类固醇药物无关,尽管抗炎,它不是免疫抑制,也没有明显的潜在的系统性毒性药物相关风险敞口的啮齿动物和狗13]。β让picomolar浓度在人血浆中14),但几乎没有在啮齿动物中没有外生脱氢表雄酮管理。β让不是口服生物利用率,和血浆浓度在人类无法明显增强的脱氢表雄酮补充由于脱氢表雄酮不宜吸收和代谢特征(15]。在啮齿动物疾病模型[HE3286有抗炎活动16,17]。这两个β让和HE3286显示的许多理想的抗炎活动报道脱氢表雄酮(18),这表明脱氢表雄酮的某些方面的活动源于polyhydroxylated代谢物,很容易形成于啮齿动物(15]。HE3286没有已知的内在neuropharmacological活动或毒性(13]。HE3286结合ERK1/2,低密度脂蛋白受体相关蛋白1 (Lrp1恰巧)和sirtuin蛋白2 (Sirt2) [19],HE3286减少ERK1/2激活在脂多糖(LPS)刺激啮齿类动物巨噬细胞(20.]。HE3286二期临床发展复合具有良好安全性在人类迄今为止(手稿提交)。因为HE3286绑定和调节ERK1/2 ERK1/2似乎发挥重要作用在神经退行性疾病21),一个示范HE3286活动PD模型将在帕金森病为临床研究提供理论基础和其他神经退行性疾病。

在目前的研究中,我们第一次测试的能力HE3286跨越血脑屏障(BBB),然后评估HE3286运动技能和保护神经元活动的注射急性MPTP药物PD小鼠模型。我们发现HE3286容易渗透的BBB和HE3286治疗MPTP-induced动物显著改善运动功能,减少神经炎症,治疗和神经退化降低车辆控制。我们的数据表明HE3286治疗PD的潜力。

2。方法

2.1。试剂

HE3286从Norac通过定制合成制药(高木、钙、美国),并制定口腔填喂法作为1毫克/毫升水microsuspension羧甲基纤维素钠盐、9毫克/毫升生理盐水,20毫克/毫升聚山梨醇酯- 80和0.5毫克/毫升苯酚。所有辅料都获得光谱化学物质(美国新泽西州新不伦瑞克)。MPTP和l二羟基苯丙氨酸买来西格玛奥德里奇(意大利米兰)。

2.2。动物保健和使用

依法进行了动物实验指导实验室动物保健和使用的通过和颁布的美国国立卫生研究院。

2.3。BBB通透性评价

21、cd - 6-8-week-old雄性老鼠(美国查尔斯河实验室,马威尔明顿)收到一个口头填喂法80毫克/公斤HE3286水microsuspension(4毫升/公斤)。群三个老鼠牺牲后0.5,1,2,3,4,8,24小时通过心脏穿刺下有限公司2麻醉。血血清和储存冷冻,直到分析处理。血液采集后,收集每个老鼠的大脑,快速冷冻,冷冻贮藏直到分析。每个大脑称重和均质使用超声波细胞分裂者;匀浆离心机清除残骸,并处理作为HE3286血清液体色谱-光谱/质谱分析(质/ MS)分析。

2.4。HE3286定量质/ MS

血清和大脑样本与内部标准(17飙升α-methyl-androst-5-ene-3β7β,17β三醇与甲基叔丁基醚)和提取。有机部分蒸发,重组在液相色谱流动相,并分析了水域Xbridge苯基柱反相,高效液相色谱法(美国安捷伦,帕洛阿尔托,CA和跳跃技术,Carrboro,数控、美国)加上一个串联四极质谱仪(美国水域,贝弗利,MA)。校准曲线的标准和质量控制样品HE3286准备样品。样品反应获得并根据校准使用浓度测定MassLynx分析软件(美国水域,贝弗利,MA)。量化的下限是1 ng / mL。样品浓度低于零的可量化的限制被分配一个值。

2.5。疾病的感应和药物管理局

HE3286活动在三个独立的实验评价。Eight-to-ten-week-old C57 / Bl6雄性老鼠(哈伦实验室开发。,Udine, Italy) were housed under standard laboratory conditions with free access to food and water for one week prior to randomization into groups of eight. In the first experiment, neurotoxicity was initiated in three groups of mice (groups 2, 3, and 4) with four intraperitoneal injections of 20 mg/kg MPTP two hours apart, while one group (group 1) received saline injections to provide a normal control, and group 2 received no treatment after MPTP. One hour after the last MPTP or saline injection, a four-day treatment schedule was initiated: group 3 received vehicle gavage twice daily (BID), and group 4 received HE3286 40 mg/kg gavage BID.

在两次实验中,另外两组MPTP-treated老鼠(5和6组)被添加到协议。两组收到了每天,为期4天注射治疗方案开始前一天MPTP药物诱导;组5收到l二羟基苯丙氨酸(24.8毫克/公斤/剂量腹腔注射(i.p。),基于平均体重20克)+车辆填喂法,和组6收到l二羟基苯丙氨酸i.p。,和40 mg/kg HE3286 per dose by gavage. Groups 1–4 of these experiments were treated as described for experiment 1.

2.6。运动协调测量

注射前MPTP药物注射,老鼠训练在几个不同杆旋转速度,和运动技能性能计算的平均延迟从旋转杆(尤格Basile、Comerio、意大利)。基线运动协调在rotarod测试记录每个鼠标培训完成后24 h(注射前24小时MPTP药物注射)。注射四天后MPTP药物注射,hypokinesia-like症状评估由恒速(20 RPM) rotarod测试。

After-MPTP测试包括三个试验(180年代)intertrial 30分钟的间隔。测试性能定义为平均的三个试验。老鼠1.5 h最后治疗治疗后开始测试。

完成rotarod测试之后,动物们被公司实施安乐死2窒息。大脑收集和部分被用于基因表达和组织学分析。

2.7。半定量的聚合酶链反应

大脑部分基因表达数据被存储在RNAlater解决方案(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)在4°C到总RNA提取使用试剂盒试剂(美国纽约表达载体,大岛),根据制造商的指示。RNA质量评估通过测量260/280 nm吸光度比值(≥1.8)和电泳。使用1互补DNA合成(互补)μ总RNA的g使用TaqMan retrotranscription试剂所描述的制造商(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。聚合酶连锁反应(PCR)进行了30μL最后向前卷包含200 nM和200 nM反向引物和20 ng的互补。以下引物配对使用,诱导一氧化氮合酶(间接宾语)FWD: AATCTTGGAGGGAGTTGTGG;伊诺牧师:CAGGAAGTAGGTGAGGGTTTG;肿瘤坏死因子-α(TNF -α)生产:AGCCCACGTCGTAGCAAACCACCA;TNA -α牧师:ACACCCATTCCCTTCACAGAGCAA;interleukin-1β(il - 1β)生产:ACACTCCTTCGTCCTCGGCCA;il - 1β牧师:CCATCAGAGGCAAGGAGGAA;磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)录象:CTAGAGAGCTGACAGTGGGTAT;(GAPDH)牧师:AGACGACCAATGCGTCCAAA。扩增片段是运行在1%琼脂糖凝胶并使用图像J软件光密度分析。介绍了基因表达数据之间的比率目标基因表达和GAPDH基因表达的控制。

2.8。组织学

大脑部分组织病理学在4%多聚甲醛固定为1周,嵌入在石蜡,切成5μ米厚的部分,沾hematoxylin-eosin可视化细胞体())。受损神经元的数量获得了平均细胞数场。一般标准分数受损细胞包括浓染的细胞核和细胞质空泡形成。受损的神经元的数目是视觉估计三个部分从四个为每个实验组动物。

2.9。免疫组织化学

的干预,老鼠被免疫组织化学分析是麻醉和transcardially灌注与多聚甲醛(4% 0.1磷酸盐缓冲剂,pH值7.4)。日冕部分SNpc vibratome被削减,沾antityrosine羟化酶(TH)抗体(多克隆兔anti-TH, 1: 1000年,Abcam),生物素化的二次抗体(山羊anti-rabbit TH免疫球蛋白,Abcam,剑桥,英国),按照制造商的指示和avidin-horseradish过氧化物酶共轭(ABC,向量,彼得伯勒、英国)。图像开发3、3′-diaminobenzidine(σ,意大利米兰)作为发色体。TH阳性神经元在枚举每个动物三个串行部分。TH-labelled神经元得分作为积极的只有他们的细胞图像包含定义良好的核复染色。TH阳性神经元的数量确定盲评的一个独立的病理学家。

2.10。统计评估

从所有实验数据相结合进行分析和测试使用Shapiro-Wilks为正态分布W测试。学生的正态分布的数据进行了分析t以及。数据不是正态分布进行分析的非参数Mann-Whitney测试。为多个比较,克鲁斯卡尔-沃利斯检验是用来确定整体意义,邓恩的事后测试组相比,控制的重要性。对所有的测试是归因于统计意义P≤0.05。所有统计测试进行了使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。

3所示。结果

3.1。HE3286血脑屏障穿透

血清HE3286动力学和大脑并行表明HE3286 BBB(图自由移动1)。的意思是比大脑相对于血清药物浓度从0.5到24 h为0.571±0.084,达到甚至在最早的样本收集。


图1
HE3286容易穿透BBB。cd -老鼠(男性,n每组= 3)治疗(填喂法)与HE3286(80毫克/公斤HE3286)和牺牲为0.5,1,2,3,4,8,24小时。血清和大脑样本分析HE3286质/ MS。每个点代表均值来自三种动物。

4所示。注射疗效的评价MPTP药物模型

4.1。死亡率

注射HE3286测试三次MPTP药物模型,和在每个实验中死亡率是观察注射后的第二天MPTP药物诱导。在第一个实验中每组(8),2、1和2老鼠注射被发现死在MPTP药物,MPTP +车辆,分别注射和MPTP药物+ HE3286组。在第二个和第三个实验每组(16),3,1,1,1和3老鼠注射被发现死在MPTP药物,注射MPTP +车辆,MPTP + HE3286 MPTP药物+l二羟基苯丙氨酸+车辆,注射和MPTP药物+l二羟基苯丙氨酸+ HE3286组,分别。没有观察到死亡盐水治疗动物(组1)。

4.2。治疗HE3286 MPTP-Induced运动障碍

我们评估的影响在MPTP-induced HE3286运动协调障碍通过测量动物的能力平衡旋转气缸(rotarod测试)。合并后的结果rotarod测试实验1,2,3总结在表1和图形呈现在图2。基线平均延迟下降的老鼠注射前MPTP药物注射是180.0±0.0秒(所有老鼠仍在杆直到测试结束)。MPTP治疗降低这个值59.2±27.3,58.2±27.5秒没有任何治疗或车辆,分别。

表1
方差分析显示显著影响总体(克鲁斯卡尔-沃利斯, )。邓恩的事后测试表明注射意义MPTP药物注射+ HE3286和MPTP药物+注射左旋多巴与MPTP药物+车辆, 和 ,分别。没有改进注射了MPTP药物+ HE3286 +注射左旋多巴与MPTP药物+左旋多巴( 由Mann-Whitney测试)。

图2
HE3286影响运动损伤在实验1 - 3的总和。老鼠(男,C57 / Bl6老鼠,每组8)有四个注射20毫克/公斤注射MPTP药物2 h。l二羟基苯丙氨酸(24.8毫克/公斤i.p)l二羟基苯丙氨酸(i.p)结合HE3286(40毫克/公斤填喂法)进行了4 d开始注射前1 h MPTP药物,或HE3286(40毫克/公斤),车辆或盐水由填喂法每天两次连续四天开始注射最后MPTP药物注射后1 h。运动损伤测量使用rotorod测试(,P< 0.0001车辆相比,B,PC = 0.0016,P= 0.0031)。

注射治疗后HE3286 MPTP药物诱导显著增加的平均延迟将降至90.9±18.4秒(P< 0.0001和车辆)。

平均延迟下降为83.8±10.6秒(P= 0.0016和车辆)治疗l二羟基苯丙氨酸(注射前发起MPTP药物)。平均延迟的组合l注射多巴与HE3286发起之前MPTP药物为84.0±12.5秒(P= 0.0031和车辆),类似于HE3286注射后发起MPTP药物归纳。HE3286 +没有显著区别l二羟基苯丙氨酸作为单一疗法相比各自的影响(P> 0.1 Mann-Whitney)。

4.3。HE3286治疗MPTP-Induced神经炎症的影响

为了阐明HE3286的疗效,炎症和神经损伤评估控制和治疗动物使用PCR和组织学。正如预期的那样,天真的控制小鼠促炎介质的低水平表达,进气阀打开,TNF -α,il - 1β(图3),而MPTP-induced vehicle-treated老鼠表示mRNA水平高。HE3286显著降低伊诺,TNF -α,il - 1βRNA表达(P< 0.05)。组织学显示显著(P= 0.01)的数量减少了小鼠受损的神经元接受HE3286车辆相比,对待动物(图4)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
HE3286减毒MPTP-induced炎性细胞因子的表达。老鼠(男,C57 / Bl6老鼠,每组8)收到四个注射20毫克/公斤注射MPTP药物2 h。HE3286(40毫克/公斤),车辆,或生理盐水是由口腔填喂法连续四天每天1 h注射最后MPTP药物注射后开始。基因表达对伊诺(a), TNF -α(b)和il - 1β(c)进行半定量的反向transcriptase-polymerase连锁反应。介绍了基因表达数据之间的比率目标基因表达和GAPDH基因表达的控制。*注射相比显著MPTP药物+ Mann-Whitney测试车辆。

图4
HE3286 MPTP-induced减少神经元损伤。老鼠(男,C57 / Bl6老鼠,每组8)有四个注射20毫克/公斤注射MPTP药物2 h。HE3286(40毫克/公斤)、车辆或生理盐水是由口腔填喂法每天两次连续四天开始注射最后MPTP药物注射后1 h。大脑部分来自固定段从四个随机选择的动物每组沾)和受损神经元的数量计算。*注射相比显著MPTP药物+ Mann-Whitney车辆的准确测试。
4.4。HE3286对MPTP-Induced TH-Positive SNpc神经元损失

MPTP治疗减少了SNpc多巴胺神经元的数量(图5)。治疗HE3286显著减毒TH-positive SNpc神经元损失(P< 0.003和车辆)。


图5
SNpc HE3286减毒TH-positive神经元损失。老鼠(男,C57 / Bl6,每组8)有四个注射20毫克/公斤注射MPTP药物2 h。HE3286(40毫克/公斤),车辆,或生理盐水是由口腔给开始连续四天每天两次注射最后MPTP药物注射后1 h。注射四天后MPTP药物注入,老鼠牺牲和大脑收集。日冕SNpc部分从四个随机选择的动物每组与anti-TH immunoreacted抗体。TH阳性神经元被确定在每个动物三个串行部分。*大大增强车辆相比,P= 0.003;显著降低虚假的相比,P= 0.0024,Mann-Whitney准确测试。

5。讨论

目前的实验来确定HE3286的抗炎活动将转化为神经活动在PD的啮齿动物模型。我们发现HE3286容易渗透BBB,口服的HE3286注射引起的运动协调的损失MPTP药物,减少和降低炎症介质的表达MPTP-treated老鼠的大脑。重要的是,HE3286减毒TH-positive神经元的损失和减少神经元损伤。没有一个增强治疗效果从HE3286注射治疗前MPTP药物(6组)表明HE3286没有直接注射活动对MPTP药物线粒体毒性。

尽管一些炎症条件可以妥协BBB,提供亲水或高分子量药物进入中枢神经系统(CNS), BBB通透性和潜在的P-glycoprotein-driven流出否则重要考虑在中枢神经系统药物筛选22,23]。HE3286很快体循环和中枢神经系统之间交换。生理盐水:辛醇(LogD) HE3286分区系数是1.3(港口疗法,未发表);其他人表明分子LogD 0.9 - -2.3的范围内自由地渗透到大脑狒狒(24]。大脑中高浓度的药物取得相对于血液中的浓度表明HE3286不是22介导流出的衬底,注意相同的结论是来自调查HE3286与22的交互在体外(港口疗法,未发表)。

HE3286对运动协调能力有显著影响,在大小相似l二羟基苯丙氨酸治疗。不幸的是,l二羟基苯丙氨酸浓度SNpc并不在我们的实验测量。这些数据可能会提供由HE3286保存细胞的功能确认,我们仅仅取决于表达TH。我们假定观察HE3286等价的l二羟基苯丙氨酸补充(对运动协调的影响)造成内源性的扩充l多巴TH +细胞的保存,但我们不能排除其他机制,如减少hyperactivation NMDA受体的抗炎效果。可以推测,增强内生l二羟基苯丙氨酸不会导致l-DOPA-induced运动障碍(盖子),但它可能很难解决这个问题而不考虑可能影响HE3286盖子通过抗炎机制(25]。可能延迟盖子发病会有巨大的好处,而且应该调查。

注射的MPTP药物模型用于目前的实验中,神经退化发生逐渐的几天(26,27)由于炎症会引起后续初始线粒体侮辱(28),因此适合评估候选人的抗炎治疗PD (5,12]。然而,慢性神经炎症,PD的核心,不能比较研究了急性模型,特别是在为期4天的治疗计划在我们的实验。

8小时注射的MPTP药物治疗增加伊诺,TNFα,il - 1β表达式3 - 20 - 13倍,分别。所有这三个蛋白在神经退化的重要因素,因此观察到的减少言论HE3286 HE3286相关的神经活动(假设蛋白浓度是反映在RNA富足,因为RNA与蛋白质测量结果不证实。)一氧化氮自由基伊诺产品注射的重要介质MPTP药物线粒体毒性(29日),而il - 1β(30.)和肿瘤坏死因子α(31日)与NMDA受体hyperactivation会引起。目前的实验不是为了测量细胞因子的动力学通量,但HE3286抗炎活动是在15分钟内可观察到的在体外(20.在24小时内),而在其他在活的有机体内模型(32]。

HE3286 ERK绑定(19)和监管ERK激活(20.)可能是负责抗炎和神经保护效应在当前的研究中观察到。MPTP发起一个神经炎症序列涉及(其他炎症介质)高机动组框1 (HMGB1)延长ERK激活(11]。在神经元,兵一个复杂和上下文相关的功能,调节长期记忆(33和职业或anticell生存机制34,35],ERK是早期中央炎症信号中介在退行性神经信号级联36]。努力与ERK激活必须认识到医学干预的ERK的参与至关重要的细胞功能以及病态。其他调查人员表明,部分减少ERK活化,使正常功能,可能是一个有用的方法来减少ERK hyperactivation的负面影响,同时支持体内平衡(25]。ERK hyperactivation通过toll样受体(TLR)和先进的糖化结束产品(愤怒)的受体与神经细胞凋亡和进步神经退化在PD (36]。ERK上调NMDA受体表达和NR2B亚基磷酸化酪氨酸残基1252,1336,或1472通过一系列信号事件涉及分子和src激活(37]。NR2B磷酸化增加神经元的Ca+ 2通量和强化神经兴奋过度,会引起37]。评估的ERK激活HE3286注射治疗的MPTP药物模型将有助于阐明药物目标之间的关系以及我们提出的作用机制。我们建议HE3286 ERK监管机构,但不是一个经典的抑制剂,可能拥有一个有用的治疗指数神经炎症疾病的治疗。事实上,广泛与HE3286毒理学研究没有提供证据的神经副作用(13]。有趣的是,ERK hyperactivation还有一个关键的辊在其他神经炎症疾病如癫痫37,慢性疼痛38),阿尔茨海默病(39,重要的是在本研究的背景下,l二羟基苯丙氨酸,诱导运动障碍(25]。

保护运动技能和DAergic注射神经元MPTP药物模型观察到在目前的研究中,结合有利的制药概要文件(13]建议的潜在作用HE3286治疗PD和parkinsonian-related紊乱。

作者的贡献

参与研究设计:Nicoletti、Philippens Ahlem,阅读,Frincke, Auci。进行实验:Nicoletti、Fagone Ahlem。执行数据分析:Nicoletti、阅读、Ahlem, Auci。或导致写作手稿写道:Ahlem, Nicoletti,阅读,Auci, Philippens。

利益冲突

作者Auci Ahlem、阅读、和Frincke员工的股权,港口疗法;拥有专利HE3286及其用于治疗炎症性疾病的。作者Nicoletti、Philippens Fagone没有潜在的利益冲突声明。

承认

这项工作是由迈克尔·j·福克斯基金会的资助多明尼克Auci。