文摘

流行病学研究链接除草剂百草枯的帕金森病(PD)的发生率增加。我们先前报道,果蝇暴露于百草枯概括PD症状,包括区域的多巴胺能神经元的变性。二甲胺四环素、四环素衍生物对改善效果在神经退行性疾病模型,包括果蝇。我们调查是否环境toxin-based PD模型有助于了解细胞和遗传机制的二甲胺四环素行动,我们是否能够评估潜在干扰药物影响改变遗传背景。Cofeeding二甲胺四环素的百草枯长期生存,救出了流动性缺陷,阻止了一代的活性氧,并扩大了多巴胺能神经元生存,正如前面报道基因的PD模型果蝇。然后我们扩展这项研究二甲胺四环素的识别潜在的相互作用与调节多巴胺自我调节有关的基因可能修改防止百草枯,发现赤字三磷酸鸟苷cyclohydrolase影响二甲胺四环素救援。我们进一步进行基因研究必需的识别信号通路,二甲胺四环素防止百草枯毒性和发现突变果蝇基因编码c-Jun n端激酶(物)和一种蛋白激酶/蛋白激酶B块二甲胺四环素救援。

1。介绍

帕金森病的致病机制,是否由突变或异常PD-associated基因的拷贝数或环境资源,增加氧化应激在多巴胺能神经元,加剧了高活性多巴胺本身的性质(1- - - - - -3]。慢性神经功能紊乱结果通常保护性神经炎症反应进一步放大氧化条件下,加速疾病进展(4,5]。因此,化合物具有抗氧化和抗炎功能极大的兴趣的潜在的慢性神经退行性疾病包括帕金森病的疗效。二甲胺四环素(MC)、第二代四环素药物是临床上安全(6),表明承诺改善效果在慢性神经退行性疾病的动物模型,包括neurotoxin-induced PD模型(7- - - - - -9]。MC似乎有消炎的特性,调节神经保护在PD动物模型10)以及抗氧化性能(11]。尽管许多有利影响的报道,然而,其他的研究发现有害后果MC治疗一些神经退行性疾病和神经损伤的模型12,13)和孤立的线粒体损伤在微摩尔的浓度(14]。此外,没有单一的模式的行动也确定了抗生素的直接目标,这可以部分解释的多样性报道效果(15]。遗传背景是另一个功能,可能导致这些看似矛盾的反应,如遗传变异个体中被修改的功能活动的药物(16]。这样gene-drug交互是笨重的调查在人类甚至在脊椎动物生物模型。无脊椎动物遗传模型提供了一个简化的方法调查三方之间的相互作用基因相关疾病易感性和进展,环境条件和治疗药物。

生物体的遗传模型,黑腹果蝇,越来越被认为是一个有用的神经退行性疾病模型由于其相对简单,易于操作,高度的神经保护机制和信号通路,和可用性的遗传和分子试剂调查疾病的机制(17,18]。因此,该模型系统应该促进解剖在疾病进展相关的反应途径和识别这些改变对MC等药物的反应。

MC的影响进行了调查主要在哺乳动物模型,虽然它已经表明,MC提高百草枯的生存——美联储(PQ)果蝇(19)和延迟多巴胺损失DJ-1遗传PD模型果蝇(20.]。我们已经开发出一种果蝇模型基于摄入PQ,概括特点PD症状与多巴胺能神经元的变性和伴随的神经症状,包括静止震颤和姿势不稳定。此外,我们表明,突变直接大幅改变达内稳态的调节改变对PQ (21,22]。因此,这个模型提供了同时修改遗传背景和环境毒素的能力。

在这篇文章中,我们证实了以前的研究结果(19,20.)利用这个环境毒素模型证明MC延长PQ-exposed成人的生存果蝇,并减少PQ-induced流动性缺陷,块DA体内平衡路径的变化有关,减少活性氧簇(ROS)的水平,和延长DA神经元生存,报道果蝇DJ-1模型(20.]。此外,我们表明,MC剂量可以显著改变生存研究的结果。然后我们扩展的分析MC行动证明突变基因改变DA体内平衡和PQ敏感性会影响MC的改善作用。我们进一步使用这个系统来识别信号通路可以修改PQ-induced毒性和MC的保护作用体内果蝇模型。使用功能突变体和超表达转基因线,我们发现物和Akt1发挥重要作用在保护DA神经元对PQ毒性和减少这些激酶的表达减少MC防止PQ的能力。

2。材料和方法

果蝇品系和文化维护。两个菌株利用野生型控制线路在所有实验测试突变株:广州年代,野生型菌株, 黄色体,白色的眼否则野生型菌株。对所有实验用人Gal4表达式来驱动UAS-transgenes, TH-Gal4 / +, UAS-transgene / +被利用为控制。从布卢明顿获得突变株果蝇股票中心如下:滚(),一个弱功能丧失等位基因的基因编码的兵,和和Df (2 l) J27, 物功能丧失的等位基因的基因编码, , 和 ;, 携带功能丧失的等位基因的一种蛋白激酶/ PKB,功能丧失的等位基因的基因编码收割者,收割者, ; 和一个空的突变等位基因Nedd2-like半胱天冬酶(数控/ Dronc), ;,。转基因菌株用于野生型激酶的表达物(bsk), ; 1和Akt1, ;。

转基因菌株UAS-2X eGFP从布卢明顿(染色体II)获得果蝇库存中心和TH-Gal4应变(23)是获得杰伊·赫希(弗吉尼亚大学)。功能丧失番茄酱介绍了等位基因Stathakis et al。24),,某人是一个功能丧失的突变基因编码TH (25]。的损失函数描述在麦凯et al。26]。所有突变体和转基因菌株交配到相应的野生型菌株,以及所有化验进行突变体为野生型基因杂合的。所有的股票都维持在25°C。

2.1。喂养实验

雄性和雌性果蝇分离,48 - 96小时after-eclosion,美联储在滤纸饱和与以下解决方案:5%蔗糖、5%蔗糖1或10毫米百草枯,在不同浓度盐酸二甲胺四环素,10毫米PQ 1毫米MC,与200年1毫米PQμM NG-nitro-L-arginine methylester (L-NAME)。喂奶是持续显示部分3。所有化学品都来自σ(圣路易斯,密苏里州)。

2.2。运动分析

成年雄性和雌性果蝇的流动从每个治疗组使用负趋地性,评估爬化验。一个飞是放置在一个空塑料瓶,利用底部,所需的时间爬5厘米和10分钟休息时间顺序记录三次之间测量。每个复制值记录是一个平均的三个试验;每个10苍蝇/测试组进行了分析。

2.3。高效液相色谱分析

单胺和蝶啶含量测定采用ESA CoulArray 5600型高效液相色谱系统。五十个成人60头提取μL 0.1高氯酸,其次是离心。十μ每个提取L整除的注入。分析进行三副本的每个测试集。胺和蝶啶分离在Phenomenex Synergi 4μm Hydro-RP列(毫米)根据麦克朗和赫希的方法27]。分离与权力平等主义的流进行1毫升/分钟。胺ESA CoulArray电化学分析检测了细胞,模型5011(通道1−50 mV,通道2 300 mV)。蝶啶与线性模型检测LC305荧光检测器(激发波长360 nm和发射波长456 nm)。分析使用ESA CoulArray执行软件。

2.4。GTPCH化验

GTPCH活动化验如前所述[21]。简而言之,从30头提取准备3 - 5天100年成年男性μL 50毫米三、2.5毫米EDTA和pH值8.0。提取物在10000转离心10分钟和上层清液的蛋白质浓度测定使用BioRad蛋白检测试剂。三磷酸鸟苷提取增加了相应的45μg蛋白质的最终浓度的0.2毫米70年最后一卷μl .混合物是孵化为1小时37°C将三磷酸鸟苷三磷酸dihydroneopterin (dNP3),紧随其后的是30的氧化μL 1%的碘和碘化钾2% 1 M盐酸和脱磷酸作用2单位的碱性磷酸酶(罗氏)。Neopterin峰值检测的荧光激发波长353 nm和发射波长438 nm)。

2.5。共焦显微镜

解剖大脑的坐骑TH-Gal4;UAS-eGFP,TH-Gal4;,TH-Gal4;成人用蔗糖,百草枯,或与百草枯和二甲胺四环素为多巴胺能神经元的形态和数量一起检查,检测到可视化GFP-expressing神经元。每个大脑扫描为最佳提升包括部分的可视化DA神经元。Z-sections被用来获得所有部分的平均使用徕卡TCS SP2 aob共焦显微镜除了共焦图像如图8,使用蔡司LSM 710共焦显微镜捕获。

2.6。过氧化氢酶试验

粗酶提取物成年苍蝇美联储PQ和MC如上所述准备从十头150年从每个治疗组μL 0.1钠钾磷酸盐缓冲剂包含0.1米特里同x - 100 (pH值7.0),和活动进行了化验后的方法28]。头提取的反应与H₂O₂决心在230纳米波长吸光度,计算使用H的摩尔消光系数₂O₂62.4。一个单位的过氧化氢酶活性被定义为1μ摩尔的H₂O₂分解每分钟。所有的值代表的平均6 - 8复制从独立提取做好准备。

2.7。脂质过氧化作用分析

头提取物50头在100年准备μL 0.1磷酸盐缓冲剂的雌性果蝇羽化后2 - 4天美联储如上所述24小时。两毫升的试剂TCA-TBA(硫代巴比土酸)盐酸加入1毫升的头提取和在沸水浴加热15分钟允许丙二醛,脂质过氧化物酶反应的产物,开发一个红发色团,发现spectrophotometrically在535海里,被描述为(29日]。

2.8。格里斯NOS活性的测定

头提取物50头在100年准备μL 0.1磷酸盐缓冲剂1 M氯化钾(pH值7.4)。离心去除碎片后,上层清液混合着刚做好的修改格里斯试剂(σ)的体积比为1:1。在室温下15分钟后潜伏期在黑暗,亚硝酸盐含量测定spectrophotometrically在595海里,与亚硝酸盐的浓度对银nitrite-derived标准曲线和计算数据,提出了一个产生的亚硝酸盐浓度提取50头飞。

2.9。统计分析

单向方差分析与Dunnett测试后或双尾学生的t以及被用来分析数据使用GraphPad棱镜(CA)圣地亚哥。图传说描述数据的分析。

3所示。结果

3.1。该文就近年来关于百草枯所致的截断发生二甲胺四环素对寿命的影响

因为MC毒性已经报道在一些哺乳动物疾病模型,我们首先测试了一系列MC含量从100年μ米到50毫米non-PQ-treated苍蝇来评估潜在的有害的影响。我们发现,摄入5毫米MC或更大的生存能力的影响,低浓度时没有造成显著的毒性(图1(一))。本次测试的结果为成年男性在图所示1(一);女性给类似的结果(数据未显示)。所有后续实验利用MC的浓度1毫米或更少,以避免与毒品有关的毒性。

然后我们被问及在1毫米或更低浓度的抗生素可以挽救PQ(图10毫米的毒性作用1 (b))。仅当暴露于PQ,成年男性的平均生存时间大约是3天。500 Cofeeding MC的浓度μM和下面没有改善生存时间;然而,co-feeding 1毫米MC与PQ额外延长平均存活时间48小时,从三到五天(数字1 (b)和1 (c))。除非另外注明,所有后续实验研究使用10毫米PQ和1毫米MC。然后,我们测试了MC的功效在三个不同的方案,比较PQ和MC co-feeding prefeeding MC 2天PQ曝光之前,和prefeeding PQ前2天单独接触MC。我们发现,无论是prefeeding还是后处理的MC能够修改PQ-exposed果蝇的生存时间(数据没有显示)。然而,扩展MC pre-feeding期5天导致延长寿命几乎相同程度co-feeding方案(图1 (c))。

3.2。MC防止PQ-Induced流动性缺陷

我们雇了一个攀登试验,这是一个敏感的指标的多巴胺neuron-linked运动功能障碍,以评估MC能否拯救流动性赤字引起PQ,类似于观察到浮士德et al。20.),在果蝇DJ-1帕金森病的遗传模型和几种哺乳动物模型(30.,31日]。24小时内开始PQ喂养没有MC,震颤和运动徐缓明显。在48小时,这些苍蝇都无法攀爬和表现出很强的bradykinesia-like行为。相比之下,与MC PQ钴铁时,没有运动缺陷明显,流动相媲美的负趋地性活动控制和minocycline-only苍蝇(图2)。

3.3。MC延迟PQ-Induced多巴胺神经元的损失

我们之前确定运动功能障碍的发病在PQ摄入的同时,有针对性的损失成人大脑的多巴胺神经元子集(21]。的MC能力改善PQ-induced震动和流动性赤字,我们接下来问这种效应是通过保护高危介导多巴胺能神经元。多巴胺神经元被TH promoter-directed检测到GFP的表达转基因菌株,TH-Gal4;UAS-eGFP。我们比较多巴胺能神经元在大脑形态和数字24和48小时后开始喂食5%蔗糖,PQ, MC,或与MC PQ(图3)。图3(一个)显示特性导致多巴胺能神经元集群PPM2经过24小时的治疗。这些神经元的数量和形态MC-only治疗后与神经元控制的大脑是没有区别的。正如我们之前已经观察到,用GFP记者和immunolocalization TH确定多巴胺神经元的21),这些神经元显示特征模式后的形态变化和神经敏感性PQ曝光(图3(一个)),而神经元附近的动物暴露于MC PQ保留正常神经元形态和数量(数字3(一个),3 (b),3 (c))。只在治疗PQ(图3(一个)为24小时),我们观察到前地区的朋友子群和PPL1 PPM2, PPM3子组神经元在大脑后表现出显著损失相对于控制(图3 (b))。在co-fed PQ的动物和MC,没有神经元损失PPM1或PPL2子组在24小时,和其他集群神经元数量和形态与控制大脑(几乎相同的数字3(一个)和3 (b))。PQ喂养48小时后,先前集群持续恶化的影响,同时指出神经退化之前影响PPM1 PPL2集群,同时改善生存的多巴胺能神经元组织指出在PQ和MC co-fed苍蝇(图3 (c))。因此,我们得出结论,寿命的延长观察到当苍蝇喂MC PQ和延迟开始运动的赤字与保护PQ-induced退化。

3.4。MC块DA的变化表明PQ-Induced氧化应激通路组件

DA的生产是由两种酶的态势:酪氨酸羟化酶(TH),酪氨酸转化为左旋多巴,和三磷酸鸟苷cyclohydrolase (GTPCH),这是病原的生产四氢生物蝶呤(BH₄),一个代数余子式和监管机构的催化。我们以前观察到对PQ至少部分由黑洞的活动₄和达生物合成途径21]。之后我们发现PQ摄入,但多巴胺能神经元的损失之前,有一个短暂的刺激DA途径活性,减少BH紧随其后₄和DA水平和相应增加氧化产品,分别为生物蝶呤和DOPAC。观察保护二甲胺四环素对PQ的影响可能是介导通过与达内稳态机制相互作用,调节DA合成或运输或通过其行动能力作为活性氧的清除剂(11),延迟PQ-induced氧化损耗DA和随后的氧化损伤。摄入MC仅24小时无显著影响的生产途径代谢产物或GTPCH活动(图4),排除MC调节DA体内平衡的可能性。PQ诱导酶活性的动态变化,通路产品,氧化产品。经过24小时的PQ曝光,左旋多巴池明显升高,表明增加TH活动;然而哒耗尽,哒代谢物,DOPAC (3 4-dihydroxyphenylacetic酸)升高,如预期的那样在氧化环境中(数据4(一)和4 (b))。同样,GTPCH活动增加(图4 (c)),而黑洞₄池是减少和氧化产品生物蝶呤与PQ增加曝光(图4(一))。相比之下,MC与PQ co-fed 24小时时,PQ对这些组件的影响更严重,与MC的报道抗氧化性质一致。

3.5。MC减少PQ-Generated活性氧

MC的能力阻止PQ-induced DA和黑洞的变化₄生物合成途径表明氧化应激导致我们假设MC担任主要PQ-generated ROS的清道夫果蝇。我们使用两个分析氧化应激,脂质过氧化反应(29日)和过氧化氢酶活动的感应28,32]。PQ摄入导致双重高程内脂质过氧化的第一个24小时(图5(一个))。Co-feeding MC的PQ几乎完全阻断脂质损伤的指标。提高过氧化氢酶活动中发现的PQ和PQ + MC组(图5 (b));然而,过氧化氢酶活性在苍蝇摄取MCwith PQ明显低于那些暴露于PQ。这些结果强烈表明,MC有很强的抑制所产生的ROS PQ的能力。

3.6。MC不能拯救聚氨酯(三磷酸鸟苷Cyclohydrolase)突变体

黑洞的病原基因突变₄和DA合成,穿孔(聚氨酯;GTPCH) [33),苍白的(请耐心;TH) [25),分别导致减少DA池在成人头和PQ(敏感性增加21]。相反,功能丧失的等位基因儿茶酚胺增加(番茄酱),一个消极的TH和GTPCH调节器,黑洞会升高₄和DA池和强大的抵抗PQ (22,24]。当我们继续探索PQ微分灵敏度的机械基础,这些突变株提供了机会开始定义遗传因素可能参与调节MC。我们发现的保护作用番茄酱杂合的生存PQ 24小时长,平均而言,比野生型的成年人,聚氨酯和请耐心杂合子死前48小时或更多野生型果蝇(图6(一))。MC野生型果蝇的生存和扩展番茄酱和请耐心为每个应变突变体,大约2天。因此,我们发现没有在这些突变体与MC DA-specific交互。

引人注目的是,然而,MC无法改善的生存聚氨酯在这些条件下突变体。一种可能性是,杂合的聚氨酯突变体可能会提供一个激活的背景,揭示了一个探测不到1毫米MC的有害影响。然而,在其他的研究中,我们发现,摄入的MC含量5毫米聚氨酯突变体没有明显的对生存的影响(Ajjuri和O ' donnell)。另外,氧化损伤聚氨酯突变体,可能是相关的聚氨酯DA的作用除了调节合成,可能进展过快MC传授其保护作用。其中一个候选人是一氧化氮合酶(NOS),这就需要黑洞₄代数余子式。众所周知,限制了黑洞₄,这应该是一个功能丧失的突变的结果聚氨酯号的,结果在催化解偶联,并显著提高氧化应激通过生产高过氧化物和过氧亚硝基34,35]。自聚氨酯突变体减少了黑洞₄(33),我们假设MC保护的失败聚氨酯突变体与灾难性的氧化损伤源于诱导NOS PQ及其随后的解偶联。如果这个假设是正确的,那么抑制NOS催化活性应该限制ROS和RNS的生产,因此,提高生存聚氨酯变异果蝇。正如所料,杂合的聚氨酯比野生型果蝇突变体NOS活性较低。正在进行的实验日期显示没有检测到MC仅对NOS活性的影响(未公开的数据)。PQ摄入导致高架没有生产,由格里斯化验,在野生型和聚氨酯突变体头(图6 (b))。野生型果蝇MC降低亚硝酸盐含量,表明它能够减少炎症反应在飞的哺乳动物。然而,MC在减少亚硝酸盐含量是无效的聚氨酯突变体,暴露于10毫米PQ(图6 (b))。然后美联储1毫米PQ,减缓氧化损伤积累的速度,为了进一步剖析事件导致神经退化。我们发现NOS抑制剂L-NAME野生型和亚硝酸盐含量降低聚氨酯突变体(图6 (c))。此外,摄入L-NAME能够延长生存聚氨酯突变株和野生型果蝇接触PQ(图1毫米6 (d))。相比之下,即使在这个10倍低浓度的PQ, MC仍无法改善的生存聚氨酯突变体。这些结果表明,MC营救的失败聚氨酯突变体是由于其无法限制NOS活性,因此黑洞时减少氧化损伤₄生产是妥协。

3.7。损失函数的突变体的基因编码物和一种蛋白激酶对1毫米PQ敏感但收割者的参与,半胱天冬酶,滚在PQ-Induced毒性并没有发现

信号转导途径与氧化应激,炎症和凋亡反应可能二甲胺四环素的目标行动15]。然而,它也知道多巴胺信号和体内平衡,高度保守的过程在果蝇和哺乳动物,跨物种积极响应环境压力(36,37]。这个特性的多巴胺功能凸显了我们的发现,PQ诱导早期变化哒新陈代谢和突变基因改变哒体内平衡强烈影响的敏感性果蝇PQ (21,22]。角色的信号转导途径可能是高度复杂的,作为特定激酶参与差异明显对氧化损伤的反应和随后的神经退化强调[38,39]。为基础对雇佣我们整个有机体疾病模型更好地理解监管之间的接口信号转导和多巴胺在多巴胺能神经退化体内平衡,我们接下来将我们的注意力转向MC影响在特定的条件下信号通路之前与神经退化机制是转基因的。

增殖蛋白激酶(MAPKs)亚科,细胞外信号调节激酶(ERK) c-Jun n端激酶(SAPK /物),已知和p38激酶被激活等一系列刺激炎性细胞因子和各种环境压力,调解各种下游的影响可能是整体保护神经退行性机制(40,41]。在哺乳动物模型对于神经损伤和神经退行性疾病,药理方法提供了证据表明,p38和物主要涉及神经元死亡过程,而ERK可能促进细胞复苏/生存从神经元死亡与这些条件(42]。

因此,我们测试了杂合的突变体物,由基因编码篮子和Akt / PKB编码Akt1兵,编码滚,在果蝇。此外,我们测试了caspase-9基因的突变,droncproapoptotic基因的突变,收割者。这些激酶功能无数生物过程但是尤其应对各种细胞的压力。我们假设他们也应该在PQ引发的不良反应上发挥了关键作用。

我们暴露与损失函数等位基因的杂合的突变体bsk和一种蛋白激酶到10毫米PQ单独或结合1毫米MC和突变体观察到两组显然略高灵敏度PQ虽然不显著(图7(一))。然而,有趣的是,MC未能改善生存的突变,而生存的控制应变显著改善。澄清这些激酶基因突变的影响,我们测试了额外的bsk和一种蛋白激酶等位基因,减少PQ浓度(1毫米)减缓PQ-induced损伤的发展穿孔上述突变实验。在这个实验中,我们扩大了我们的分析包括ERK基因的突变等位基因,滚凋亡通路的基因,突变体dronc(半胱天冬酶)和收割者。在这些条件下,杂合的bsk和一种蛋白激酶突变体显示对PQ敏感性增加,死亡,平均而言,野生型果蝇,前两天又MC在拯救这些突变体(图无效7 (b))。这些结果表明,物和一种蛋白激酶信号通路是重要的保护性反应MC苍蝇或减少他们的活动加剧了氧化环境的有利影响MC丢失。然而,杂合的的敏感性收割者和滚突变体PQ和MC增加生存能力与野生型控制是没有区别的。相比之下,杂合的半胱天冬酶突变体,dronc,幸存下来的两天比野生型控制PQ和二甲胺四环素改善生存(图一个额外的两天7 (b))。

3.8。过度的物和一种蛋白激酶该文就近年来关于百草枯所致毒性发生授予保护在多巴胺能神经元

的观察物和一种蛋白激酶功能丧失的杂合突变体增加灵敏度PQ,这些基因的正常表达对MC-mediated似乎是重要的保护性反应对PQ让我们测试是否这种效应逆转当物和Akt是过表达。由于PQ毒性最初是在多巴胺能神经元和DA本身似乎在这一过程中交互,我们开车的表达野生型物和Akt DA神经元使用GAL4-UAS系统(43]。尽管我们采用PQ更高浓度的10毫米的这些实验,物和Akt在多巴胺能神经元的表达导致大约两倍增加生存时间在这两种情况下(图8(一个))。MC在所有菌株寿命提高了30%到10毫米PQ孤单。重要的是MC的组合+ Akt在多巴胺能神经元的过度增强生存/ 3倍相对于野生型控制。这些结果说明一种蛋白激酶和物prosurvival函数PQ-induced DA毒性,Akt表达式有最强的效果。

我们进一步验证了野生型的保护作用物和Akt通过检查高危成人大脑多巴胺神经元的生存。转基因菌株,TH-Gal4;UAS-eGFP过了和,表达GFP的配合物或一种蛋白激酶。我们观察到MC能够防止神经元损失后的子组大脑DA神经元表达绿色荧光蛋白,但否则野生型,相对于来自相同文化的苍蝇的大脑只接触到PQ(图8 (b))。Akt或物在多巴胺能神经元的过度防止PQ-induced DA神经元损失在大多数DA神经元的子组相对于控制大脑。同样,转基因的大脑,TH-GAL4; 美联储PQ(图8 (b)显示更高的DA神经元数。然而,1毫米的cofeeding MC与PQ未能提供神经保护上面观察Akt或物超表达(数字8 (b)和8 (c))。这些结果的生存数据MC转基因线路的保护作用,TH-GAL4; UAS-JNK和TH-GAL4; UAS-Akt / +比例和控制苍蝇所观察到的,而不是进一步提高生存。

4所示。讨论

4.1。MC PQ-Induced给予抗氧化效果果蝇帕金森病模型

PQ被认为是氧化应激源,生成过氧化物和羟基自由基(31日]。此外,流行病学和实验研究指出PQ作为PD的病因代理(44]。我们使用PQ摄入建立体内果蝇PD模型(21]在这里使用这个模型来探索基因相互作用,改变MC的影响,作为模型药物在PD提供疗效分析。可能的结果报道在这项研究中,这个系统提供了一个富有成果的途径探索基因改变的影响,可能扮演的角色在DA神经元易感性有害环境的侮辱。值得注意的是我们观察到的强烈影响,对PQ毒性和MC的防护能力,尽管在所有实例,我们正在与纯合子致死突变的等位基因,需要使用杂合子与野生型等位基因也存在于每个实例。人们越来越认识到风险加剧氧化多巴胺能神经元,很大程度上是由于DA的互动性质本身。当务之急是达稳态机制和氧化监测敏感调节和平衡,以避免灾难性的破坏神经元。我们注意,类似的研究在哺乳动物模型,将大量的突变等位基因,更难以实现。然而,这样的研究是简单的使用果蝇模型系统,我们的结果与这些杂合的菌株明显支持的普遍观点精致的平衡所需的通路的福祉多巴胺能神经元。

MC已被证明具有抗炎和抗氧化特性在许多神经退行性和创伤性哺乳动物模型(15,45]。虽然确切的生物目标MC仍然不是众所周知的,据报道,MC导致抑制线粒体细胞色素c的释放,caspase-1和3表达的抑制,抑制小胶质激活(8,15,46]。

尽管许多报告支持MC的有效作用在许多神经系统疾病和损伤的模型,其他研究报告甚至没有影响或增加有害的影响(12,13]。Diguet et al。12)报道,MC的保护或有害的影响取决于模式管理和剂量的药物。因为持续的争议在MC的研究中,我们首先进行了毒性试验采用一系列MC剂量。因为我们发现浓度高于5毫米时有毒野生型成年苍蝇,我们使用1毫米MC,浓度显著低于有毒的水平,但有效的改善10毫米PQ的有害影响。此外,我们测试了不同治疗模式,发现pre-feeding和co-feeding方案都同样的保护。Bonilla et al。19)也报道预防PQ-induced减少生存时间果蝇,但MC传授这种影响的机制果蝇没有调查研究。最近,《浮士德》等。20.)测试的效果在改善MC多巴胺能神经元损失果蝇当表达式DJ-1A被特定的表达DJ-1A RNAi在这些神经元。在这项研究帕金森病的遗传模型,更高浓度的MC(50 - 100毫米)能够拯救DJ-1RNAi-mediated DA神经元的损失。这些调查人员还评估了MC对DA池和DA神经元的生存DCM地区的大脑。我们的研究支持并扩展了这个有趣的研究,证明这种抗生素也有效的环境毒素的PD模型。我们还发现改善生存和DA池,也是引人注目的救援DA神经元,不仅在特定区域调查浮士德等人,但有趣的是,在所有的子集DA神经元。流动性也解救了在我们的研究中,氧化应激和炎症的标志。因此,有效影响MC的遗传和毒素的PD模型果蝇产生类似的结果,尽管这一事实DJ-1击倒效果观察在羽化后大约10到25天,虽然这PQ研究测试更多的急性反应。在形式上,有可能MC化学与PQ并帮助排毒。然而,类似的结果观察到基因和PQ PD模型果蝇认为强烈反对这种选择性的化学相互作用。因此,我们得出这样的结论:果蝇系统提供一个健壮的模型为研究治疗作用的机制。

我们先前已经表明,PQ诱导第一快速激活DA合成、以及黑洞₄代数余子式途径所需哒生物合成和NOS活性,紧随其后的是黑洞的快速氧化营业额₄和达21]。因此,我们扩大了我们的神经化学分析监测左旋多巴和DOPAC。我们发现这些神经化学反应的抑制MC治疗,证实了一个强大的抗氧化功能MC在这个系统从DA代谢物的角度反应以及ROS的生成反应,过氧化氢酶和脂质过氧化反应化验。

克劳斯et al。11)将MC的抗氧化特性与其他已知的抗氧化剂。抗氧化性质评估在哺乳动物的神经元细胞培养通过细胞glutamate-induced氧化应激化验包括脂质过氧化和抗氧化活性测定游离。MC连同其他已知的抗氧化剂如生育酚(±)显示直接彻底清除活动,提出是由于酚环的存在能够与自由基反应,形成相对稳定和稳定phenol-derived自由基(15]。我们的研究结果,结合Bonilla et al。19和《浮士德》等。20.),强烈支持类似的MC能力在这整个生物体研究各种氧化应激模式。

4.2。MC的失败保护PQ穿孔突变体

先前表明,突变体与DA生物合成途径缺陷显示微分对PQ (21),我们使用这些突变体基因-环境交互的测试中,可能会修改MC的功效。有趣的是,MC改进的生存苍白的和番茄酱那些野生型果蝇突变体比例,虽然未能营救聚氨酯突变体。当一个可能的解释缺乏效果是有害的MC效果是显示的聚氨酯突变,我们发现没有证据表明改变生存MC独处时,在这项研究中,采用浓度而被这个突变株。这些结果表明,功能聚氨酯除了它的角色在DA体内平衡可能会影响对MC的保护。黑洞₄GTPCH通路、终端产品,也为生产函数作为一个重要的辅因子,促进NOS的二聚作用和功能作为一个捐赠者在生产的过程中(35]。限制黑洞₄池,如杂合的聚氨酯突变体,导致NOS的解偶联电子转移催化功能,结果是,过氧化物的生成和过氧亚硝基激进分子(35,47]。支持这个解释我们的结果,我们发现穿孔突变体表现出,低于正常NOS活性在活的有机体内与抑制剂抑制NOS催化功能L-NAME改善PQ-fed果蝇的生存。MC无力阻止过度生成过氧硝酸盐穿孔突变体提供了修改后的药物相互作用的一个例子,可能有助于解释这一现象的响应在PD和其他神经退行性疾病药物失败。我们的数据也验证果蝇作为一个在活的有机体内药物分子筛选模型可能的药物相互作用。

4.3。识别所需的信号转导途径MC保护PQ-Induced神经毒性和神经炎症反应

我们的调查的信号通路调节PQ-induced神经毒性果蝇寻求对信号转导途径,可以修改PQ-mediated毒性在整个生物体水平。之前的大部分哺乳动物的研究利用在体外(即。,cell culture) approaches to address this question. Moreover, these mammalian studies have used primarily pharmacological inhibitors to block the proposed functions of the signaling pathway, which may lack complete specificity of function. Finally, the variations in the type of inhibitor used, inhibitor concentrations, and time of addition as well as cell lines may affect the outcome of these experiments [48,49]。

我们已经测试了角色的激酶和proapoptotic基因已知功能守恒与哺乳动物。杂合的功能丧失的突变体物/ bsk(,和),一种蛋白激酶(,和)表现出对PQ没有MC和应对抗生素治疗失败。此外,过度的野生型形式的激酶PQ阻力。这些结果表明关键角色这些信号通路对PQ神经应激反应。相比之下,杂合的功能丧失突变体对ERK和收割者突变体与野生型果蝇在PQ的敏感性。我们注意到缺乏效果并不一定指示后基因的缺失的角色。漏水的突变或冗余的功能可以很容易地防止有害的检测效果。正在进行的研究将更全面地解决这些问题。

在哺乳动物中,Akt1起着至关重要的作用在细胞生存,也是受PI3K-mediated信号通路(41]。放松管制的Akt1-mediated信号通路已经被记录在家族和零星的形式的PD模型(38,50]。Akt1信号通路的刺激在体外或在活的有机体内模型导致神经营养、凋亡的影响(41]。杨et al。50)发现DA神经元的抑制ROS和生存在转基因菌株过度表达果蝇Akt1 DJ1型RNAi菌株,再次说明PQ模式在许多方面相似基因PD模型。

在哺乳动物PD模型、物、灭活启动程序性细胞死亡的凋亡蛋白Bcl-xl,神经元被激活在哺乳动物PQ-induced PD模型暗示作用物在神经退化51]。同样,激活物中发现了帕金突变体果蝇(52]。的特定物抑制剂钴铁SP600125 20毫米PQ增加了生存和运动的活动与美联储相比20毫米PQ (53]。此外,王et al。54还演示了物的重要角色在寿命和抗PQ-induced氧化应激。我们的数据显示一个特定角色的物生存DA神经元的反应在我们的PD模型。我们进一步确认的prosurvival作用Akt1和物在DA神经元对PQ与延迟DA神经元损失评估超表达野生型Akt和物的DA神经元。然而,除了MC未能进一步防止DA神经元丧失Akt vegf对PQ DA神经元。这些神经元计数数据并行的生存数据获取与vegf与野生型果蝇Akt和物PQ和MC PQ。MC提高vegf与野生型果蝇生存的一种蛋白激酶和物在同一比例在野生型果蝇对PQ(控制)。

我们发现,杂合的功能丧失突变ERK /滚没有任何检测功能参与我们的模型,虽然结果也可以推断出缺乏足够的击倒的杂合性压力。最近,基因之间的相互作用果蝇DJ-1和Ras / ERK但不是PI3K / Akt从而表明prosurvival DJ-1介导通过ERK在DA神经元的效应(55]。虽然缺乏影响我们考试的ERK /卷突变可能解释,如上所述,通过减少功能不足,这也可能是一个实例PQ和PD的突变基因的细胞效应可能分道扬镳。未来的研究将解决这一点。

最后,我们分析了程序性细胞死亡的作用在PQ神经毒性测试pro-apoptotic基因杂合的突变体,收割者程序性细胞死亡引发剂,caspase-9直接同源,dronc。我们发现一个杂合的功能丧失收割者突变体显示类似的生存对PQ野生型果蝇,dronc突变体显示增加寿命。PQ已被证明通过激活诱导细胞凋亡还3和9和抑制bcl - 2家族成员除了伯灵顿(56]。因此,我们的研究结果dronc建议在果蝇和哺乳动物行动并行模式。

总之,除了我们发现保护机制的MC对PQ MC - PD模型和小说穿孔突变体相互作用,我们的研究结果提供在活的有机体内逆境应答激酶的重要作用的证据对PQ的回应。在本文中,我们目前的数据显示失败的杂合的Akt1和物丧失突变体对MC。然而,摄入10毫米MC的苍蝇过度表达野生型Akt1和物DA神经元不提供额外的保护PQ水平。因此,这些途径可能不是直接影响MC或者,或者,可能存在一个上限以上这些激酶不再能有效破坏连续PQ暴露在这些急性毒素积累模型。进一步探索这些通路的角色在不同的突变背景在慢性或零星的接触模型的影响PQ将生产可以遵循的途径,分析组织Akt和物的响应。

确认

这项工作是支持部分由美国帕金森病基金会和美国国立卫生研究院(R15ND078728) j . O ' donnell。此外,作者欣然承认从阿拉巴马大学的额外支持。他们希望感谢杰·赫希和天山许果蝇菌株和O ' donnell实验室的其他成员为他们的见解和建议对于这个项目。高效液相色谱法分析都是熟练地执行的研究助理珍娜·布朗。