文摘
的积累-核蛋白是观察在神经退行性疾病如帕金森病和多系统萎缩。在先前的研究转基因C57BL / 6小鼠overexpressing-核蛋白携带突变基因A53T和A30P帕金森病或parkin-null背景,我们报道严重的线粒体损伤神经元和神经胶质细胞在更大程度上的中脑。大脑中的神经元死亡没有被观察到。在这里,我们表明,老鼠在行为测试显示严重的运动障碍。此外,这些老鼠表现出脊髓星形细胞死亡,伴随着大量的胶质增生和小胶质激活。这是细胞死亡所示染色和免疫组织化学。超微结构分析显示严重不仅在星形胶质细胞线粒体损伤,而且在少突胶质细胞,影响程度很小,在神经元。因此,转基因小鼠显示出深刻的病理学在脊髓的神经胶质细胞。
1。介绍
帕金森病(PD)是一种慢性神经退行性疾病相关的严重的运动障碍,大量的发病率和死亡率增加。帕金森病的神经病理学的特点是过度黑质多巴胺能神经元的损失,但其他大脑区域也可能受到影响。大多数情况下PD是零星的,与晚发型。然而,5 - 10%的帕金森病病例是家族性的,可以归因于基因的突变-核蛋白(syn)和帕金1]。syn突触分子,它假定参与膜泡贩运和细胞骨架动力学(2]。此外,聚合syn是特定的-synuncleinopathies像PD,路易的身体疾病,或多系统萎缩(MSA) [3,4]。它似乎是帕金syn是退化的E3泛素连接酶(5]。
一些转基因小鼠模型syn和帕金突变被用来阐明PD发病的分子机制6]。在先前的研究中,我们生成的老鼠携带帕金基因的删除和/或overexpressing变异的人类syn转基因(7,8]。这些老鼠展览在神经元线粒体超微结构的改变,有趣的是,在更大程度上在中脑的胶质细胞,但他们不显示严重的组织病理学特征,如在黑质细胞死亡。这些数据表明,神经胶质细胞是PD的发生或发展的主要贡献(9,10]。这是由细胞培养数据显示异常的功能神经胶质细胞从老鼠携带PD-inducing基因突变(11,12]。此外,神经胶质细胞表达蛋白质与超氧化物歧化酶1,杭丁顿蛋白或ataxin与神经退行性疾病。最近的研究表明,神经胶质细胞的重要作用也在其他神经退行性疾病。例如,星形胶质细胞中发挥核心作用的脊髓运动神经元变性肌萎缩性脊髓侧索硬化症(13和少突胶质细胞是神经变性的主要贡献在MSA (14,15]。
一些临床研究报道的外观nondopaminergic症状焦虑行为的障碍在PD早期阶段(16]。最近的文献表明,病理表现脊髓中首次检测到从尾然后发展到吻侧,直到他们到达中脑。这个模型,描述了Braak和同事(17),提供了一个解释nondopaminergic症状的出现,之前在黑质细胞死亡。自主(交往)功能障碍,例如抑郁症睡眠障碍,或焦虑行为控制的降低脑干和脊髓神经节(18]。
根据这些报告,我们现在调查是否尾喙的进程也可以观察到在我们的转基因小鼠,因为帕金和syn表达在脊髓19]。我们发现细胞死亡、线粒体的改变和严重的炎症反应在脊髓胶质细胞突变的老鼠。此外,当观察小鼠的运动能力,我们发现严重的运动障碍,似乎与脊髓的病理变化有关。
总之,我们的转基因老鼠携带PD-inducing基因突变表现出更严重的病理损伤脊髓神经胶质细胞的比在中脑,类似于早期PD Braak和同事所描述的情况(17]。
2。方法
2.1。鼠标菌株
两个转基因小鼠行进行了分析:纯合子syn线(C57BL / 6 j背景)overexpressing双重突变(A30P A53T)人类(嗯2)syn的鸡肌动蛋白(BAsyn)启动子如前所述7),这里我们使用BAsyn 1.5和double-mutant鼠标线带着另外一个删除exon3帕金基因(BAsyn / PaKO;F10一代,99% C57BL / 6 j, 1% 129 svj)。控制老鼠的同龄nontransgenic同窝出生(LMs)。
住房和繁殖的动物进行按照德国的动物保健和使用委员会的指导方针。都是努力减少实验用动物的数量,他们的痛苦。
2.2。组织准备
老鼠被过量的氯胺酮麻醉(100毫克/公斤)和rompun(5毫克/公斤)和灌注transcardially磷酸盐(PBS)其次是4%多聚甲醛(PFA) 0.1磷酸盐缓冲剂(PB)免疫组织化学或2% PFA加上2.5%戊二醛(GA)电子显微镜的铅。颈脊髓的部分被立即删除,后缀。
2.3。免疫组织化学染色和细胞死亡
颈脊髓的部分是嵌入在石蜡。为连续的双标记脊髓被切成3米厚的部分,分析syn聚合,细胞死亡染色以及炎症过程的调查脊髓被切成18米厚的部分。部分是deparaffinized和抗原检索(5 - 10分钟烹饪在0.01 M柠檬酸缓冲,pH值6.0)进行(除了胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘碱性蛋白(MBP))。预培养后正常血清(3%),部分是处理鼠标反人类的syn (anti-syn211;1:700年,表达载体),星形胶质细胞标记兔anticow GFAP (anti-GFAP;1:1000;阿克利),少突细胞标记山羊反人类的MBP (anti-MBP;1:1000;Santa Cruz),小胶质细胞标记山羊反人类的电离钙结合衔接分子1 (anti-Iba1;1:250;Abcam)、神经核神经元标记鼠标antimouse (anti-NeuN;1:700;Chemicon),山羊antimouse组织蛋白酶X (anti-CATX; 1 : 200; R&D Systems), and goat antirat cathepsin S (anti-CATS; 1 : 200; Santa Cruz). Sections were stained with the corresponding biotinylated secondary antibody (1 : 300, Axxora), ABC reagent (1 : 100; Axxora), and silver-gold intensification.
FluoroJade silver-staining用于检测细胞退化。Deparaffinized和水化部分0.06%高锰酸钾溶液中孵化15分钟,用蒸馏水冲洗,然后在0.01%的解决方案孵化FluoroJade (Histo-Chem)在0.1%醋酸30分钟。银染色根据协议执行Gallyas et al。(20.]。
2.4。透射电子显微镜法
后缀(2 h,颈脊髓被削减的)部分与vibratome (100米厚的),前角样品microdissected OsO4 1 h和放置在2%,脱水乙醇分级浓度和氧化Epon-propylene和平板嵌入环氧树脂。代表超薄部分收集Formvar-coated网格和与醋酸双氧铀及柠檬酸铅。
超薄部分可视化使用菲利普斯em - 410。线粒体的形态和数量进行评估在数字化的电子显微镜图片8 m-old动物。总共24 somata每个细胞类型(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)从两个vibratome部分动物是由两个独立分析审查员盲老鼠的基因型。超薄部分随机选择从vibratome中间部分,以避免潜在的结构表面上可能出现的违规行为。
数据提出了作为平均值±标准偏差(SD)的每个基因型分析动物的手段。超微结构的变化而相应的统计分析与LMs进行使用Mann-Whitney等级和测试(以及,正反,α水平0.05)。
2.5。高+测试
老鼠放在一个十字形的高架迷宫闭着两张开双臂和两臂站在离地面1米。摄像机记录了5分钟水平路径长度,时间在封闭的手臂,和持续时间和数量的停止。
2.6。的足迹
获得的足迹,后爪老鼠蘸染料和老鼠放在一个100厘米长,4.5厘米宽舷梯。地板是内衬白皮书和足迹的足迹分析软件。提出了数据的平均数±标准差的方法分析了动物基因型。统计分析采用Mann-Whitney等级和测试(以及,正反,α水平0.05)。
3所示。结果
3.1。hm的细胞分布脊髓的syn BAsyn和BAsyn / PaKO
我们调查和比较人类的分布syn的转基因syn鼠标线。顺序immunoperoxidase标签与syn -抗体和细胞特定类型。例子所示为8个月(m)老BAsyn / PaKO数字1(一)- - - - - -1 (h)。BAsyn / PaKO表达的转基因脊髓几乎只在星形胶质细胞(数字1(一)和1 (b))。在图2(k)syn分布显示整个截面的脊髓BAsyn / PaKO,表明转基因主要是表现在白质。在这个领域我们还发现许多GFAP-positive细胞(图2(左))。还不清楚小胶质细胞的转基因表达。的部分脊髓与大量的小胶质细胞显示几乎没有syn表达式(数据1 (c)和1 (d))。然而,它不能排除转基因表达的几个孤立的小胶质细胞。既为彩色immunopositive少突胶质细胞和神经元的表达转基因可以检测到(数字1 (e)- - - - - -1 (h))。我们发现相同的细胞分布BAsyn老鼠(数据未显示)。
(一)
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(c)
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(h)
3.2。严重的syn聚合、炎症反应和细胞死亡的脊髓syn基因转移
我们分析3 - 8米的颈脊髓旧BAsyn BAsyn / PaKO老鼠和它们相应的LM如图2。我们检查了hm的表达syn没有(图2(年代)2(k)2(q)和(数据2(f),2(左)2(r))预处理的片和蛋白酶K .预处理后片和蛋白酶K hm,syn聚合在前角(啊),带媒介物(子),横向细绳(低频),以及前细绳(AF)的脊髓中可见8 m-old BAsyn / PaKO(数据2(左)和2(r))。相比之下,没有LM(图中观察到聚合2(f))。
接下来,我们研究了GFAP的表达和Iba1数量的增加,发现GFAP-positive细胞(数字2(m)和2(s))以及更强的表达Iba1(数字2(n)和2(t))啊,子,低频,房颤的脊髓8 m-old BAsyn / PaKO相比LM(数字2(g)和2(h)),表明严重的神经胶质过多症的发生。
这种神经胶质细胞的激活在旧BAsyn / PaKO伴随着更高的表达溶酶体cystein蛋白酶CATX(数字2(o)和2(u))和猫(数字2(p)和2(v))。这些标记的表达是炎症反应的早期指标。两种蛋白质被观察胶质增生,可见在同一地区不同的LM(数字2(我),2(j))。
除了严重syn聚合、胶质增生和炎症,FluoroJade(图2(b))和Gallyas银染色(图2(c))显示细胞死亡的发生在低频和房颤的颈脊髓8 m-old BAsyn / PaKO。分析相邻切片显示细胞阳性Gallyas细胞死亡染色也由星形胶质细胞标记染色(数字2(c),2(d))。没有细胞死亡可能检测到运动神经元位于星形胶质细胞。
相同的分析进行BAsyn monomutant线和四只动物我们还发现两个syn聚合、胶质增生,炎症反应和细胞死亡。然而,两个其他动物没有显示这些病理变化(数据没有显示)。此外,3 m-old老鼠调查和年轻BAsyn和BAsyn / PaKO显示这些变化(数据没有显示)。
3.3。线粒体的超微结构损伤脊髓的双突变体
线粒体超微结构的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞在颈脊髓受到电子显微镜检查。神经胶质细胞数如果他们包含细胞核周围细胞质和分类根据其典型的超微结构特征21,22]。简而言之,星形胶质细胞被确定electron-lucent细胞质和细胞核的外观(异染色质毗邻核膜的薄边缘)。少突胶质细胞显示电子致密细胞质融合及其核异染色质斑块富含接近原子核的边界。线粒体被列为结构破坏时的一个或多个以下改变观察:扭曲或中断嵴,外膜分离或突起,electron-lucent域,或夹杂物的矩阵。8岁的m BAsyn / PaKO显示只有轻微的线粒体损伤神经元(数字3 (d)和3 (g)),而LM展出几乎没有障碍(数字3(一个)和3 (g))。相比之下,星形胶质细胞(数字3 (e)和3 (g))和少突胶质细胞(数字3 (e)和3 (g))BAsyn / PaKO显示显著增加线粒体损伤而LM(图中相应的细胞3 (b),3 (c),3 (g))。少突胶质细胞表现出改变线粒体的数量最多。
(一)
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3.4。行为赤字在Mono -和Double-Mutant老鼠
8 m-old转基因老鼠的步态研究通过分析他们的足迹。测量以下参数:步长、步宽,脚长度、面积感动,角度,脚趾1 - 5和2 - 4(图4(一))。检查显示减少步幅mono -和double-mutants(数字4 (b)- - - - - -4 (c))。
(一)
(b)
(c)
高架+测试测量焦虑以及老鼠愿意探索新环境。四个不同的参数进行了分析:距离,时间在封闭的怀里,停止,停止的时间。两个8 m-old BAsyn和BAsyn / PaKO走较短的距离比LM停了更少和更长的休息时间。趋势的转基因老鼠花了更多的时间在封闭的武器,然而,这种差异很低(数字5(一个)- - - - - -5 (h))。
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(h)
4所示。讨论
在帕金森病的病理特征是黑质多巴胺能神经元的变性,它最近表明,多巴胺能神经元死亡之前更尾中枢神经系统病变区域(17]。有人提出这样的变化是伴随着syn聚合在脊髓17,23]。这些发现提出新疑问PD病理的起点。
我们正在分析overexpressing hm转基因小鼠模型2 syn (BAsyn)或结合一个删除的exon3帕金基因(BAsyn / PaKO)。因为这些老鼠不表现出严重病理损伤的中脑我们调查研究颈脊髓的一部分根据分期方案Braak和同事(17,23]。
我们首先证明了两个鼠标线hm的表达2 syn几乎完全脊髓星形胶质细胞中。小神经胶质细胞,神经元和少突胶质细胞syn表达式可以被探测到。
蛋白酶K预处理syn聚合是可见的在所有分析double-mutant动物和两个四monomutants分析。这些发现只能观察到8米——但不是3 m-old动物。这是与之前的研究结果相一致的小鼠模型24,25)和人(26),syn聚合只发生在脊髓但不是在黑质。这些结果提示对脊髓的早期介入PD的起源。
此外,炎症过程中增加相对于LM转基因老鼠。转基因小鼠表现出更高的数字GFAP-positive星形胶质细胞和活化的小胶质细胞。此外,溶酶体cystein蛋白酶猫和CATX表达更丰富的颈脊髓BAsyn和BAsyn / PaKO LM相比。这些炎症过程伴随着持续的细胞死亡,如图所示FluoroJade和Gallyas染色。分析相邻切片可以识别大多数细胞和星形胶质细胞染色阳性细胞死亡。
有趣的是,这些变化只发生在衰老,3 m-old老鼠不受影响。这加强了早期PD病理衰老期间建立的假设(27]。所有四个BAsyn / PaKO老鼠分析显示上述病理损伤而发生炎症和细胞死亡的外观中只有两个四BAsyn动物。这表明的超表达的影响增强了syn帕金基因的删除。这可能是由于这一事实帕金参与α-突触核蛋白的退化5]。然而,两者的结合是增强细胞死亡在星形胶质细胞未见类似的模型系统(28]。
此外,double-mutants表现出较高的线粒体损伤颈脊髓星形胶质细胞和少突胶质细胞,表明严重的神经胶质反应与星形细胞死亡的外观相关联。最高的线粒体损伤发生在少突胶质细胞,即使他们不表达转基因。夹杂物的syn少突胶质细胞的转基因小鼠模型的MSA过多表达α-突触核蛋白已被证明参与神经退化(14,15]。有趣的是,我们的数据表明,少突胶质细胞的转基因的表达并不是一个必要的要求中受损的线粒体的存在相同的细胞类型。相比之下,在运动神经元超微结构发现了干扰很小,也不表达转基因。神经元的损伤,更明显,在邻近寡树突胶质细胞可能由星形胶质细胞受损。少突胶质细胞可能更容易比神经元线粒体损伤已经出现在更多的受损的线粒体在LM(图3 (g))。转基因在星形胶质细胞syn可能开始一个病态的级联。在病理条件下星形胶质细胞可以成为反应性神经胶质,释放细胞因子和活性氧化分子。这些细胞却无法提供正常支持神经元(10,29日),从而导致这些细胞线粒体损伤。少突胶质细胞似乎并不发挥作用在促进炎症虽然像神经元,它们受到炎症过程。这些数据表明,syn表情模仿生理效应可能与PD相关或其他疾病与α-突触核蛋白表达有关。
所有病理findings-gliosis、炎症、细胞死亡和线粒体损害发生的啊,子,低频,AF颈脊髓的转基因小鼠。这可能与小鼠模型-synucleinopathies, astrogliosis出现在脊髓(30.,31日]。可以观察到任何更改后细绳(PF)或后角(PH)。检测到变化是符合的syn聚合。为主的运动神经元,啊,和房颤是受影响最严重的地区导致运动损伤。尽管运动神经元不是结构性影响,他们周围都是改变胶质细胞可能导致神经功能发生变化,因此,启动PD症状。这个假说是加强数据的足迹分析。8岁的m两种转基因线显示运动能力损伤如PD患者的步态障碍的症状非常相似(32]。此外,高+测试是用来测量老鼠去探索一个新环境的趋势。测试是基于自然厌恶老鼠的开放和高地区,以及他们的自然自发的探索行为33]。我们发现严重赤字的性能两个鼠标线LM相比。老鼠的不愿意去探索一个新的环境,以这个测试来衡量,可能是由于他们的步态障碍。
我们的小鼠模型表达syn英航启动子的控制下,导致变异的表达syn星形胶质细胞。同样,帕金基因在每一个细胞都摧毁了。因此,该模型反映了人类的情况,作为人类表达帕金和syn几乎在每一个组织。尽管这个一般表达式模式,我们发现病理描述只在鼠标脊髓,类似早期PD患者的情况。
5。结论
我们表明,脊髓syn转基因老鼠比更高的大脑区域受到严重影响。结果支持这一假设syn过度引发astrocyte-derived毒性,导致脊髓的病理,最终还涉及了少突胶质细胞和神经元。这可能会导致受损的运动协调。基因的性质和病变显示相似的MSA或帕金森病小鼠模型。因此,它很容易推测nonneuronal细胞可能导致的病理变化-synucleinopathies。
确认
作者感谢茱莉亚Frose,佩特拉Jergolla分析员Katja Schmidtke,雷肖勒,凯特琳舒斯特尔,西尔维亚Schweer, Holger Schlierenkamp优秀的技术援助。这项工作是支持的德国国家学术基金会(SM),波鸿国际神经科学研究生院(SS),波鸿-鲁尔大学研究学院(SM, SS)和Biofrontera生物科学公司。