文摘

从我们实验室之前的研究显示,适量nigral多巴胺能变性引起情绪和认知功能障碍的老鼠,并联帕金森病的早期迹象。最近的证据表明,大麻素CB的封锁1受体可能有利于缓解运动抑制帕金森病的典型。在这里,我们调查是否CB拮抗作用1受体将改善情绪和认知功能障碍的运动帕金森病大鼠模型。类似抑郁的行为和认知评估强迫游泳测试和社会识别测试,分别。证实了我们之前的研究中,老鼠在纹状体注射6-hydroxydopamine提出了情感和认知的改变提高了急性注入SR141716A。高效液相色谱法分析单胺水平证明改变后的纹状体和前额叶皮层SR141716A注入。这些发现表明CB的角色1受体的早期症状引起纹状体多巴胺能神经元的变性,帕金森病的观察。

1。介绍

越来越多的证据表明,认知和情感症状之前的经典运动症状帕金森病(PD)。流行病学、病理和临床研究提供了数据支持帕金森病的运动阶段的存在(1]。帕金森病的运动症状包括温和的情感和认知障碍。在这个阶段,神经病理损伤进展没有伴随的运动能力损伤(2]。当红衣主教马达迹象(动作迟缓、休息震颤和刚度)PD的诊断所需的出现,大约60%的黑质多巴胺能神经元的丢失,和纹状体多巴胺含量减少了60% - -80% (3]。最近,我们已经开发出一种PD大鼠的运动模型,在情感和认知缺陷发生在缺乏运动变化(4]。特别是,我们已经表明,双边intrastriatal注入6-hydroxydopamine (6-OHDA)在成年大鼠强迫游泳不动时间增加测试一周后药物管理局,而歧视障碍在社会认可测试6-OHDA注入三周后出现。

Endocannabinoids-that, anandamide 2-arachidonoylglycerol-are合成需求通过解理膜磷脂和充当逆行使者在中央突触,调节生理功能,包括情感和认知5,6]。这些分子绑定到CB1大麻素受体的突触前突终端调节离子通道活动和抑制神经递质释放7]。证据表明,神经传输是活跃在人类受到的基底神经节PD (8)在大鼠PD模型(9,10)表明,大麻素CB的封锁1受体可能有利于缓解PD症状。事实上,来自非人灵长类动物和啮齿动物的证据表明政府SR141716A改善帕金森病的运动症状模型(11- - - - - -14]。这些数据表明,CB1受体介导的传播发挥功能作用在电机改变疾病的发展过程中。然而,我们所知,CB的影响1受体对抗这种疾病的早期阶段尚未被研究过。

CB的1受体在大脑区域人口表示控制情感和认知过程,如边缘系统和前额叶皮层(15]。因此,它是可能的神经系统介导的情感和认知改变的退行性疾病。出于这个原因,本实验研究大麻素系统是否影响情感和认知改变早期PD和是否CB的典范1拮抗剂SR141716A减少6-OHDA破坏性影响在老鼠类似抑郁的行为和记忆功能。

2。方法

2.1。动物

共有四十成人(3仅有几个月)雄性Wistar鼠被用于强迫游泳测试,而32成人和六个少年(1个月)雄性Wistar鼠被用于社会识别测试。动物们被安置在一个房间里与光周期控制(07:00-19:00灯)和温度(23 C)。他们可以免费获得标准食物和自来水。本研究中使用的所有程序符合UFSC伦理委员会的动物保健指南的使用动物,它遵循“实验动物保健原则”的国家卫生研究院。

2.2。Intrastriatal注入6-OHDA

用于诱导的过程温和的多巴胺能变性大鼠模型是基于先前所描述的我们(4)使用intrastriatal 6-OHDA注入。所有与无菌技术进行了手术。6-OHDA (12 g每注射稀释0.9%生理盐水,补充与0.1%抗坏血酸,注入体积2.5 0.5 l的速度 l /分钟;美国σ)是在5分钟双边注入背侧纹状体的腹外侧区。立体定位注入后的坐标Paxinos和沃森16阿特拉斯:记者:1.1毫米,ML: 3.2毫米,DV: 使用汉密尔顿10毫米前囱和硬脑膜 l与26-gauge针注射器连接到一个30-gauge插管。注射后,套管留在地方2分钟前被收回,允许完全扩散的药物。所有动物都是处理ip注入20毫克/公斤去郁敏(稀释在0.9%氯化钠,σ,美国)手术前30分钟,为了保护去终端从6-OHDA毒性。立体定位手术进行氯胺酮(15毫克/公斤,Dopalen;Agribrands) /甲苯噻嗪(2.5毫克/公斤,Rompun;拜耳)麻醉。Sham-operated老鼠提交相同的协议,除了车辆代替6-OHDA注射。我们之前的研究(4)表明,情感和认知变化与时间有关的PD大鼠模型。因此,行为实验进行了一个(强迫游泳测试)和三(社会识别测试)周后手术。子组4 - 8的动物被斩首后神经行为测试分析。

2.3。强迫游泳测试

描述的过程以前Porsolt et al。17)和建立标准程序在我们的实验室4]。老鼠被分为五组( = 8)。手术后大约一个星期开始,老鼠适应实验测试之前至少30分钟的余地。老鼠被安置在单独的气缸(40厘米高度和直径17厘米)包含水(水深30厘米;25 C)。两个进行了游泳训练(一个初始下半场预备考试之后5分钟测试24小时后)。SR141716A(0.5、1和3毫克/公斤,溶解在80年与10% DMSO + 0.1%盐水渐变,赛诺菲-安万特(sanofi - aventis)法国)和车辆由ip路由30分钟之前第二次会议被迫游泳。总不动时间手动得分为5分钟。不动被定义为不动上市,除了那些必要的运动来保持老鼠的头露出水面。

2.4。社会识别测试

短期社会记忆是评估与先前建立的社会认可的任务在我们的实验室4,18]。手术后三周左右,6-OHDA-injected单独和虚假的老鼠被安置在标准塑料笼子(42 34 17厘米),经过三天的使用习惯新环境。每只动物被注射CB1拮抗剂(0.5和1毫克/公斤)或车辆社会识别记忆测试(前30分钟 = 8)。测试是在观察室,老鼠的习惯了在测试开始前30分钟。所有的青少年都隔离在单独的笼子里30分钟前开始实验。社会认可测试包括两个连续5分钟演讲相隔30分钟间隔,一个少年的笼子里的老鼠被孤立的成年老鼠。时间调查青少年(前缘,嗅探、修饰或滚烫的)被记录在每个会话。年底的第一个演讲中,少年老鼠被保存在一个笼子在延迟期间,气鳔成年鼠后30分钟。

2.5。神经化学研究

确定达3 4-dihydroxyphenylacetic酸(DOPAC) homovallinic酸(HVA), NA,大脑5 -内容,老鼠被斩首,三周后6-OHDA管理。

老鼠被斩首,大脑被立即删除,和纹状体,前额叶皮层和海马新鲜解剖,在液态氮冷冻,保存 c的浓度哒,DOPAC HVA, NA,和5 -纹状体,前额叶皮层和海马化验通过反相高效液相色谱电化学检测(ED)。这个系统由一个Synergi Fusion-RP C-18反相柱(150 4.6毫米身份证。4 米颗粒大小)配备了一个4 3.0毫米precolumn (SecurityGuard墨盒Fusion-RP),电化学检测器(ESA Coulochem三世电化学检测器)配备了保卫细胞5020 (ESA),电极设置在350 mV和双电极分析细胞5011 (ESA);和LC-20AT泵(日本岛津公司)配备一个手动Rheodyne 20 7725喷射器 l循环。列是维护在一个温控烤箱( C,日本岛津公司)。细胞有两院系列:每个室包括一个多孔石墨电极比色,双反电极和参比电极的两倍。氧化电位设定在100 mV第一电极和第二电极450 mV。哒,DOPAC, HVA、NA和5 -发现第二电极。组织样本均质与超声波细胞分裂者(超音速)0.1米高氯酸包含0.02%焦亚硫酸钠和内部标准。离心后10000 g 30分钟 C, 20 l的上层清液注入色谱仪。使用的流动相流速为1毫升/分钟以下成分:20克一水柠檬酸(默克公司),200毫克octane-1-sulfonic酸钠盐(默克公司),40毫克乙二胺四乙酸(EDTA)(σ),和900毫升HPLC-grade水。缓冲区的pH值运行解决方案是调整到4.0 0.45然后过滤 m过滤器。甲醇(默克公司)被添加到给最后一个成分10%甲醇(v / v)。的峰值区域外部标准被用来量化样本的山峰。

2.6。统计数据

在统计上有显著差异的强迫游泳测试评估的单向方差分析(方差分析),其次是Newman-Keuls事后测试。双向重复测量方差分析是用于社会识别测试,其次是Bonferroni的多个测试比较。统计分析的高效液相色谱法是由未配对的学生的措施 以及。所有的值被表示为的意思 扫描电镜。被定义为统计意义P . 05。

3所示。结果

在强迫游泳测试(图1)、单向方差分析显示静止时间的增加比虚假的集团( ;P . 05)。急性治疗SR141716A(3毫克/公斤,i.p。)恢复6-OHDA治疗引发的静止时间的增加。


图1
影响急性SR141716A管理局(0.5、1和3毫克/公斤),i.p。30分钟之前第二个会话6-OHDA-treated大鼠强迫游泳测试。结果表示为平均静止时间 SEM与虚假的控制。统计分析是由单向方差分析后跟Newman-Keuls事后测试。*P 。05年比虚假的集团( 每组= 8)。

强迫游泳测试后,大脑纹状体的神经递质水平,前额叶皮层和海马测量在6-OHDA-treated 6-OHDA-treated老鼠和老鼠收到的有效剂量SR141716A(3毫克/公斤)。脑单胺水平的措施的DA水平有显著提高( ;P . 05),DOPAC ( ;P . 05),HVA ( ;P . 05)6-OHDA-lesioned老鼠SR141716A处理。没有发现显著差异在纹状体水平的NA ( ;P . 05)和5 ( ;P . 05)和DA的含量,DOPAC, HVA, NA, 5的前额叶皮层和海马6-OHDA-lesioned老鼠对待SR141716A相比6-OHDA-lesioned老鼠收到车辆。数据如表所示1。

表1
影响急性SR141716A管理局(3毫克/公斤)ip在纹状体神经递质水平,前额叶皮层和海马后一周6-OHDA管理。结果表达的意思 SEM 6-OHDA组相比。统计分析是由未配对的学生的 以及。

在社会识别测试过程,双向方差分析(治疗对青少年)显示交互因素没有显著的影响( ;P=。08)。然而,它表示一个显著影响药物治疗( ;P 。)和青少年表示,第二个演讲的幼年大鼠( ;P 。)。Bonferroni事后测试表明6-OHDA-treated老鼠提出一个明确的障碍的青少年识别能力相比,虚假的老鼠,因为6-OHDA集团花了那么多时间调查少年老鼠在第二次遇到他们的第一次接触。6-OHDA SR组花更少的时间调查青少年老鼠在第二次比第一个接触。数据如图2。


图2
影响急性SR141716A管理局(0.5和1毫克/公斤)i.p。30分钟前社会识别测试6-OHDA-treated老鼠。调查结果表示为平均时间 SEM与虚假的控制。统计分析是由双向重复测量方差分析Bonferroni事后测试紧随其后。*P 。05年相比第一个少年演讲( 每组= 8)。

社会认知测试后,大脑纹状体的神经递质水平,前额叶皮层和海马测量在6-OHDA-treated 6-OHDA-treated老鼠和老鼠收到SR141716A的有效剂量(0.5毫克/公斤)。NA ( ;P . 05)和5 ( ;P= . 05)水平在脑额叶前部皮层SR-treated组显著增加。两组之间没有显著差异在纹状体和海马(表中2)。

表2
影响急性SR141716A管理局(0.5毫克/公斤)ip在纹状体神经递质水平,前额叶皮层和海马三周后6-OHDA管理。结果表达的意思 SEM 6-OHDA组相比。统计分析是由未配对的学生的 以及。

4所示。讨论

老鼠与双边6-OHDA黑通路的病变显示则行为和社会记忆障碍,建模nonmotor的病理生理学改变,发生早期PD患者(1]。的证据增加基底神经节的神经传输病人和这种疾病的动物模型8,10)支持SR141716A或其他CB的潜力1受体拮抗剂缓解PD症状。本文中的数据证实这一假设,我们表明,CB的封锁1受体明显减毒6-OHDA-induced障碍在强迫游泳和社会识别测试。这是伴随着增加纹状体DA水平和NA和5水平在前额叶皮层。

在强迫游泳测试,6-OHDA-treated老鼠显示更大的绝望行为倾向与虚假的动物和那些接受SR141716A相比,因此这表明CB的封锁1受体恢复正常的应对反应当动物暴露于不可避免的厌恶刺激。增加减少6-OHDA-induced静止在强迫游泳测试由SR141716A明显的剂量3毫克/公斤,但不是在低剂量(0.5和1毫克/公斤),表明低剂量的CB1拮抗剂可能不足以诱导抗抑郁效应在PD动物模型。然而,必须承认,利莫那班可以在啮齿动物在高剂量诱导运动过强,这也会影响我们的结果的结果。然而,目前的证据同意抗抑郁活性报道Griebel et al。19),表明,SR141716A减少静止时间在强迫游泳试验剂量的3毫克/公斤,但不是在大鼠1毫克/公斤。

事实上,尽管这个问题,据我们所知,是第一个报告CB的行为动作1受体拮抗剂的模型PD-associated抑郁症状,CB的形象1对手已经证明了在情绪性抑郁症的其他啮齿动物模型。抗抑郁效应建立了模型中使用老鼠,老鼠,和沙鼠,在模型中使用不同的相关措施(19- - - - - -21]。确认的参与CB的证据1受体的抗抑郁效果SR141716A CB1拮抗剂,AM251,来自他们的受体特异性CB1受体和药物相互作用研究。因此,直接的CB1受体激动剂CP55940阻止AM251的抗抑郁作用。另一个关键的数据将CB1受体的抗抑郁的作用机制这些化合物来自CB的示范1receptor-null老鼠不显示AM251[的抗抑郁作用20.),证明这种受体的重要性这些大麻素拮抗剂的抗抑郁效果。

我们的研究结果表明,SR141716A的抗抑郁作用的机制可能涉及修复纹状体的多巴胺的水平,因为急性管理3毫克/公斤的SR141716A海拔哒,DOPAC, HVA含量6-OHDA-treated大鼠的纹状体。符合这是我们之前的研究结果显示,在强迫游泳不动时间的增加测试6-OHDA治疗后伴随着减少在纹状体DA的含量及其代谢产物(4]。纹状体DA水平的增加很可能是由于CB的封锁1在striatonigral gaba ergic神经元受体局部而不是直接影响的大麻素拮抗剂黑多巴胺能预测。事实上,黑多巴胺神经元不包含CB1受体,至少在成年人的大脑,虽然这些受体硝唑与D1和D2多巴胺能受体在纹状体预测(22]。

有趣的是,0.5毫克/公斤SR141716A管理导致显著增加NA和5水平的前额叶皮层,但没有造成纹状体的神经递质改变。剂量的3毫克/公斤,然而,纹状体DA及其代谢物含量显著增加,而没有出现在前额叶皮层神经递质水平变化。这不同的神经递质水平增加不同的大脑结构似乎是由于本研究中使用的剂量和值得更好的调查,可能采用其他剂量的CB1拮抗剂6-OHDA和虚假的动物。

尽管有强有力的证据表明CB的有益影响1受体拮抗剂在抑郁,到目前为止获得的数据并不完全支持这种假设,因为当我们和其他人(19- - - - - -21)表明,SR141716A可能有效减少则症状在动物模型中,这CB1对手是作为一种典型药物撤出市场由于其prodepressant效果。另一方面,精神分裂症病人与SR141716A临床试验(23),药物并不影响端点的功效,没有报道负面影响情绪和焦虑。临床研究专门设计来解决这个机制是抗抑郁的潜力,因此,只有解决问题的有效性。

急性SR141716A影响短期记忆功能在这个模型的运动前区PD是评估使用社会识别测试。社会识别记忆基地嗅觉线索和代表嗅觉短期记忆的一种形式。在这个任务中,如果延迟周期小于40分钟,成年雄性老鼠通常显示识别的幼年大鼠显著减少社会调查时间在第二次演讲相比,第一个。社会歧视的能力在老鼠6-OHDA处理中断,影响SR141716A逆转。

CB是一致的1大麻素受体参与认知过程包括内存在人类和动物24- - - - - -26]。一项研究Micale et al。27]表明SR141716A中和失忆症影响βamyloid-injected老鼠,一个阿尔茨海默病模型,加强提案SR141716A在神经退行性疾病的治疗的作用。

•et al。28]之前证明SR141716A促进短期记忆在社会识别测试。在这里,我们将这些数据通过证明SR141716A能够改善6-OHDA-lesioned动物的短期识别记忆。因此可以推测,这种药物可能是有用的治疗记忆缺失与帕金森病有关。在我们之前的研究4)、社会承认赤字是伴随着改变在脑额叶前部皮层神经递质水平。这里,这些结果进一步暗示这一领域在这样的记忆,因为改善识别SR141716A与提高水平的NA和5 -在前额叶皮层。

5。结论

优势的结论,这里给出的数据显示一些SR141716A的急性效应之间的关系在强迫游泳和社会识别测试和治疗行为改变的治疗PD的潜力,进一步加强CB的治疗价值1受体拮抗剂,已经提出了运动能力损伤的治疗PD (12,29日]。

确认

本文支持由慰问Nacional de Desenvolvimento Cientifico e学府(CNPq-Brazil)。此外,作者要感谢鲁伊·d·s . Prediger博士和法布潘普洛纳对这里描述的工作为他们的贡献。