文摘

背景。有一个不足remyelination病变的多发性硬化症(MS)。一个被发现的因素促进remyelination是neuregulin 1 ErbB4的配体。免疫细胞与神经发生和oligodendrogenesis。目标。我们学过的表达ErbB4复发患者的免疫细胞汇款(RR)多发性硬化症(MS)和健康对照组。方法。ErB4表达在免疫细胞流式细胞仪研究了没有刺激或刺激和anti-CD3 anti-CD28单克隆抗体或interferon-g或TNF -的存在α以及通过免疫沉淀反应和免疫印迹,和它的信使rna研究了实时PCR。结果。我们发现减少的水平ErbB4总PBMCs和T细胞,单核细胞和B细胞的RR MS患者。同样,ErbB4 RNA水平相对较低的免疫细胞RR-MS患者。刺激通过CD3和CD28显著调节ErbB4在免疫细胞健康个体的表达。这种效果是较弱的病人组中。结论。ErbB4可能发挥作用在少突细胞祖细胞的增殖,少突胶质细胞的分化,remyelination,和,因此,减少ErbB4表达在免疫细胞的患者RR-MS remyelination不足可能导致疾病发生。

1。介绍

多发性硬化(MS)是一种慢性炎性脱髓鞘疾病的中枢神经系统负责神经系统残疾的最常见的原因在年轻的成年人1]。女士斑块特点是免疫细胞浸润,髓鞘脱失,成熟的少突胶质细胞轴突损伤,死亡和神经退化2]。神经前体细胞(npc)和少突细胞前体细胞(信息公开化)存在病变[女士3的过程,remyelination存在于女士的病变4,5];然而,这个过程主要是不足和无法remyelinate成功。调节配体的一个家庭起到营养作用通过其受体ErbB2神经元和神经胶质,ErbB3, ErbB4。neuregulin 1的结果表明,可溶性对碘氧基苯甲醚,胶质生长因子2 (GGF2),促进神经胶质细胞和他们的祖细胞的存活和增殖,增强体内remyelination [6- - - - - -8]。ErbB4已被证明参与广泛的功能和采取了至关重要的作用在神经系统和心脏的发展以及在癌症和精神分裂症等疾病9- - - - - -12]。此外,表达的调节ErbB4被幸存的少突胶质细胞和活性小胶质细胞和周围病变女士,髓鞘和少突细胞耗竭发生和被发现在淋巴结淋巴细胞表达(13]。最近报道,neuregulin 1参与免疫调节(14]。

它长期以来一直认为,免疫系统可能帮助修复和再生作用的中枢神经系统(CNS)受损组织myelin-reactive T细胞和T细胞来源的细胞因子(15,16)通过具体激活血源性骨髓细胞(17- - - - - -19]。

鉴于ErbB4表达式的潜在作用在髓鞘再生女士和neuroregenerative潜在的免疫活动,本研究的目的是调查的表达谱ErbB4 MS患者的免疫细胞。

2。方法

MS患者参加神经免疫学诊所特拉维夫Sourasky医学中心是包括在这项研究中。参与者给了他们的知情同意后,明确复发患者血样来自13个汇款(RR-MS)女士根据麦当劳等人修订标准和10 aged-matched健康对照组(HC)(表1)。外周血单核细胞(PBMCs)从静脉血样通过离心分离Ficoll-Paque (Amersham生物科学乌普萨拉,瑞典)。ErbB4受体表达PBMCs研究通过流式细胞术使用藻红蛋白(PE)共轭鼠标对CD3单克隆抗体(mAb), CD14、CD19(研发系统)以及细胞内染色与老鼠和人类ErbB4 ErbB4马伯(Santa Cruz)和allophycocyanin——(APC)共轭F (ab)2对人类Fc(杰克逊ImmunoReasearch)和适当的同形像控制。在进一步的实验中,PBMCs 5 MS患者和5 HC的培养24小时与anti-CD3马伯和抗CD28马伯(研发系统)或与相应的同形像控制24小时或干扰素-的存在γ100 ng / mL或TNF -α24小时100 ng / mL。这些分子的检测是由FACScan流式细胞分析仪(Beckton Dickinson)。分析是由CellQuest软件(Beckton Dickinson)测量的具体意思是荧光强度(MFI) ErbB4检测到细胞和ErbB4阳性细胞的百分比。

表1
研究参与者。

除了ErbB4表达PBMCs研究通过免疫沉淀反应和免疫印迹分析。大细胞癌H661高表达细胞株ErbB4作为积极的控制,而人类肺腺癌H1299细胞系作为消极的控制。使用缓冲区里帕PBMCs提取。不溶性材料被15分钟离心(12000×g)在4°C。上层清液(0.5毫克的蛋白质)孵化2 h与单克隆抗体ErbB4在4°C,紧随其后的是额外的孵化1 h在4°C与G蛋白琼脂糖珠。Immunocomplexes是与PBS缓冲PBS-Tween一旦洗两次。珠子是悬浮在Laemmli样本缓冲区,煮5分钟,通过解决10% sds - page,免疫印迹了anti-ErB-4多克隆抗体。在免疫沉淀反应,提取后,我们决定使用布拉德福德试剂所有样品的蛋白质含量,孵化后类似数量的总蛋白质anti-ErbB4抗体和进一步孵化珠,我们同样数量的上层清液加载。因此,我们假设相同数量的上层清液加载在凝胶。

总RNA准备使用一个简单的从PBMCs RNA净化设备(生物产业)根据制造商的指示。总RNA样本通常对待Turbo-DNase (Ambion),以防止可能的基因组DNA污染。在实时中存在的反应研究,没有剩余的基因组DNA污染测试使用GAPDH引物的PCR反应的样品没有经过体外转录反应。1的总RNAμg转录了六聚体随机使用反向转录酶(封底cDNA工具包)后,制造商的指示。实时执行中存在ABI棱镜7900 HT仪器(应用生物科学)。ErbB4 mRNA表达测试的执行中存在如下:94°C 10分钟和45周期如下:94°C的15秒,60°C 15秒,15秒72°C。融化曲线分析通常用于每个反应。GAPDH基因是并行运行内部控制设置为每个反应。GAPDH基因是并行运行内部控制设置为每个反应。GAPDH表达的一致性PBMCs被GeneVestigator测试计划,分析几种不同的微阵列研究。GAPDH表达式是独立于任何PBMC在健康个体治疗,两组RR-MS病人就像之前描述的20.]。ErbB4了使用的寡核苷酸引物序列引物:5′ggc TGC TGA GTT TTC亚美大陆煤层气有限公司得到三大′和ErbB4反向器引物5′gct柠檬酸TAC手枪猫CAC有条件现金援助GA-3′, GAPDH正向引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′和GAPDH反向引物5′TCCACCACCTGTTGCTGTA-3。

RNA表达的数据提出了一个计算相对量化值根据ABI棱镜7900 HT软件和规范化GAPDH±S.E.

所有数据提出了均值±S.E.统计分析比较ErbB4表达水平之间的学习小组是由学生的t以及。

3所示。结果

我们首先比较了ErbB4表达PBMCs RR-MS患者和年龄HC的流式细胞术,发现平均荧光强度(MFI)的ErbB4 PBMCs RR-MS患者(37.8±2.8)显著低于在HC (图1(一))。然而,没有发现显著差异的百分比的比较ErbB4-positive PBMCs (39.7±1.3% RR-MS HC和41.3±1.4, )。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
ErbB4表达如果PBMCs RR-MS患者和年龄匹配的健康对照组被流式细胞仪测量。平均荧光强度(MFI)的ErbB4 PBMCs RR-MS患者明显低于健康对照组(a)的PBMCs ErbB4的MFI。如果T细胞,单核细胞,和B细胞的RR-MS患者与健康对照组相比显著降低(B)。与单克隆免疫沉淀反应后ErbB4抗体,细胞溶解产物处理由多克隆抗体免疫印迹分析和探索。大细胞癌H661细胞系作为积极的控制(PC)。H1299人类肺腺癌细胞系作为负控制(数控)。捐赠者不同于那些被描述在图a和b: H1-2健康对照组,和P1-5 RR-MS病人(c)。

我们之后检查ErbB4的表达在不同的细胞类型中PBMCs = (T细胞 细胞,单核细胞= 细胞和B细胞 细胞在研究组织(图)1 (b))。我们发现的MFI ErbB4在T细胞低表达RR-MS比HC患者(22.2±3.3) 的MFI ErbB4表达RR-MS患者单核细胞较低(88.5±11.5)相比HC (135.7±8.9, ),ErbB4表达RR-MS患者B细胞较低(39.8±4.9)相比HC (56.2±3.9, )。类似的百分比ErbB4,阳性细胞亚型之间被发现病人组和HC组。平均54.2±2.0%的病人的T细胞在HC和57.0±2.1%,16.5±1.5%的单核细胞在HC患者和15.0±1.5%和7.7±0.9 B细胞的患者在HC和8.3±0.9。所有这些比较阳性细胞百分比的无足轻重。

为了证实我们的观察,我们还研究了ErbB4蛋白的表达,免疫沉淀反应和免疫印迹。同样,ErbB4检测在预期的分子量范围(180 kDa) PBMCs 2 HC但不是PBMCs 5 RR-MS病人(图1 (c))。

为了进一步探索ErbB4表达之间的差异我们的学习小组,我们研究了mRNA的表达水平实时PCR和ErbB4发现显著降低亲戚ErbB4 mRNA的表达RR-MS病人(1067.0±239.0)相比HC (1903.1±265.3, )(图2)。


图2
PBMCs ErbB4信使rna表达水平研究了实时相对在10 RR-MS rt - pcr和10岁,sex-matched健康对照组。正常化ErbB4 mRNA表达了关于GAPDH mRNA的表达水平。

我们进一步研究了anti-CD3 / CD28马伯的刺激效果的表达ErbB4 PBMCs在一组不同的参与者(图3)。刺激与抗CD3 / CD28马伯调节ErbB4的表达程度明显低于医学患者组的平均比率之间的ErbB4 MFI anti-CD3 / CD28马伯和同形像控制(平均比率±S。D = 3.5±1.6)相比HC (6.2±1.6, )。在患者组和HC组,有一个upregulation刺激后ErbB4 anti-CD3 / CD28马伯,但这种效果在患者组(60.8±18.4)没有达到的水平MFI HC (106.4±18.8, )。没有发现差异的百分比PBMCs积极ErbB4女士之间的病人和HC与anti-CD3刺激后/ CD28马伯(±S MS患者的平均百分比。D = 13.2±9.7, 在HC = 13.0±6.0, 。没有发现显著的影响在ErbB4 MFI与干扰素- 24小时孵化γ患者组之间(MFI平均比率与没有细胞因子= 1.5±1.1)和HC (1.2。±0.6, 的百分比)或ErbB4-positive PBMCs(百分比平均比率与没有细胞因子±S。D = 20.7±39.8 在HC)和(9.9±16.5, )。同样,没有发现显著的影响在ErbB4 MFI与TNF - 24小时孵化α患者组之间(MFI平均比率与没有细胞因子= 1.1±0.6)和HC (0.7±0.3, 的百分比)或ErbB4-positive PBMCs(百分比平均比率与没有细胞因子ErbB4 + PBMCs患者组(10.9±20.8, 在HC)和(1.69±1.8, )。我们并没有发现未经治疗的病人和病人之间的差异,对待interferon-b至于ErbB4的表达。


图3
ErbB4表达PBMCs 5 RR-MS患者和5岁- sex-matched健康对照组(HC)研究了后24小时孵化anti-CD3 / CD28马伯(白色直方图)或其同形像控制(灰色直方图)。刺激效应通过CD3 / CD28的MFI ErbB4明显高于HC患者相比。

4所示。讨论

neuregulin一直支持几种类型的神经胶质细胞所示通过增强扩散,生存和分化以及增强remyelination在成年人的大脑6]。重要的是要注意,remyelination大多是不一致的女士在病变的过程,和许多病变未能remyelinate成功。此外,在部分患者病变主要表现为少突细胞凋亡[女士2]。这个失败导致不可逆转的轴突丧失和进步的神经恶化[21,22]。

在目前的研究中,我们寻找的天然受体的表达调节,ErbB4,首次发现ErbB4水平降低的PBMCs RR-MS患者。这个减少表达式被发现在所有细胞子集我们研究:T细胞,单核细胞,B细胞也在ErbB4信使rna的转录水平。刺激通过CD3 / CD28调节ErbB4 HC和有一个较弱的表达效果的患者我们假设ErbB4女士可能发挥作用在少突细胞祖细胞的增殖和少突胶质细胞的分化,因此,一个不足ErbB4表达可能与发生在疾病的remyelination不足。我们的结果公布一项新的报道方面,女士的倾斜的免疫力有关,包括促炎细胞因子的增加产量,如干扰素-γ从T细胞和il - 12、地震和IL-23从单核细胞和树突细胞(23- - - - - -27),Treg细胞的损失函数,如 T细胞和CD46-mediated Tr-1细胞(28,29日),以及抑制 T细胞(30.,31日)和减少在免疫介导的神经营养因子,和‘诺金’的生产(20.,32,33]。女士,有一个增加促炎的活动和假定减少免疫介导性监管、神经保护、neuroregenerative活动。我们建议CD3 / CD28的表达减少和响应性的刺激ErbB4表情MS患者的免疫细胞可能与免疫不足中介remyelination和oligodendrogenesis女士。