文摘

探讨脑脊液(CSF)识别的抗原高亲和力在多发性硬化(MS)患者免疫球蛋白,噬菌体展示的方法应用于脑脊液从15 MS和10控制病人。肽序列被女士和控制脑脊液免疫球蛋白是个体特定,并没有发现共同的主题。肽序列经常显示的各种各样的氨基酸序列同源性无处不在的病毒如eb病毒(EBV)和单纯疱疹病毒(HSV),虽然频率并非特定于MS患者。脑脊液免疫球蛋白g女士可能识别各种类型的无处不在的病毒抗原和反应可能是增加了一个旁观者。

1。介绍

在多发性硬化症(MS),发病的事件,导致免疫细胞浸润,多灶脱髓鞘和轴突的损失仍在辩论中。识别出现了相互相互作用的细胞和体液免疫组件可能导致人类疾病免疫介导的髓鞘脱失(1]。

正常脑脊液(CSF)有一个免疫球蛋白含量,小于总蛋白的13%。女士,有一个无法解释的高程的免疫球蛋白g CSF从15%提高到30%,可视化为寡克隆乐队(OB)电泳(2]。

尽管体液免疫反应与女士,其在发病机理中的作用还没有精确的决定。似乎大多数研究者认为脑脊液免疫球蛋白或寡克隆免疫球蛋白g带女士是特异性的旁观者的反应。另一方面,一些实验室研究抗体的antigen-binding区域在大脑demyelinative女士发现斑块和脑脊液和显示(a)有限的生殖系表达式,结果出乎意料的一个随机的旁观者反应;(b)特性符合特定antigen-targeted过程;(c)的B淋巴细胞的克隆扩张[女士2]。此外,女士CSF的目标抗原免疫球蛋白尚未确定。

我们已经成功地证实,脑脊液免疫球蛋白g从HTLV-I-associated脊髓病/热带痉挛性下肢轻瘫(火腿/ TSP)患者选择主题高度同源的致病微生物“HTLV-I”12-mer使用噬菌体展示随机肽库(RPL)方法(3]。我们试图找到目标抗原的MS患者的脑脊液免疫球蛋白g使用相同的方法在火腿/ TSP的情况下。

2。材料和方法

2.1。病人和控制

15 MS患者的脑脊液样本(13女性和2男性,平均年龄37岁(范围、21-60)年)进行了分析。的患者平均发病年龄为29岁,和疾病的平均持续时间是8年。免疫球蛋白g指数的平均值为1.07。所有女士病人满足麦当劳标准及获得的样本期间急性疾病的复发。通过测试与等电点聚焦和免疫球蛋白immunofixation方法,14例发现OB正面和一个病人(MS7) OB负面的。在一个病人(MS6)脑脊液样本收集在三个不同的时间点进行了研究。

对照组由5 psychosomatoform障碍患者和5患者头痛。脑脊液样本10控制患者(5男5女),平均年龄28.7岁(范围、14-48)进行了分析。

2.2。噬菌体展示的方法

一百毫升水中Dynabeads蛋白质(Dynal生物技术ASA,奥斯陆,挪威)与300年孵化μL (CSF一夜之间在4°C。IgG-bead复合物与10孵化μL(一个包含大约12-mer随机肽库粒子(Ph.D-12,噬菌体展示肽库装备,新英格兰生物学实验室,贝弗利,MA)在室温下为60分钟。与磷酸盐含0.1% Tween-20洗两次后,感染大肠杆菌噬菌体筛选了绑定和放大(ER2738应变)和孵化为4.5 h在37°C。细菌细胞被离心分离去除,放大噬菌体被聚乙二醇(PEG)的沉淀纯化。噬菌体的解决方案是滴定确定浓度。新了IgG-bead复合物喜忧参半的60分钟噬菌体粒子来自第一轮噬菌体的选择。洗后六次,噬菌体筛选了。33从第二轮噬菌体克隆选择为DNA测序确定显示12-mer氨基酸。所有这些过程都是基于制造商的协议。选中的噬菌体克隆在每个病人编号。例如,p7_33表示病人MS7第33克隆。

2.3。为选定的氨基酸序列同源性搜索主题

我们寻找一个共同的肽的主题,一个特定的序列模式,反复发生在一群肽序列,使用多个期望最大的主题引出(MEME) 3.0版(http://meme.sdsc.edu/meme/cgi-bin/meme.cgi)[4]。爆炸(简称搜索几乎精确匹配,国家生物技术信息中心)是寻找蛋白质含有同源序列。

3所示。结果

3.1。噬菌体展示

脑脊液从13 15 MS患者和脑脊液从8的控制患者选择一个或多个常见肽图案,但肽主题基本上是不同的从一个病人到另一个(表1和2)。我们试图检测常见的肽图案共有495个图案源自15 MS患者,但我们不能发现任何MS-specific共同肽图案。

3.2。同源性搜索

在爆炸中搜索,我们不能检测微生物菌剂或人类的分子与MS患者显著相关。然而,我们专注于非人类的序列的意图获取洞察病因微生物检测肽女士的代理人主题经常是同源的组件单纯疱疹病毒1(1型单纯疱疹病毒)、巨细胞病毒(CMV)、EBV,虽然这些主题很少是同源麻疹病毒的组件,风疹病毒、水痘带状疱疹病毒。至于假定的髓磷脂自身抗原在女士,发现髓磷脂碱性蛋白的主题只有一个病人(5级)。在病人MS6,相同肽图案同源EBV的组件从3 CSF反复检测样品(表3)。预期值(E的数量)是一个参数,描述了一个可以“期望”搜索时偶然看到一个特定大小的一个数据库。越低E价值或接近为零,越“重大”匹配。的E值的三肽图案SPxxMH、DPYQxP和PYxxYQxP EBV是0.32,0.008,0.028,分别,当我们用爆炸限制生物病毒。

4所示。讨论

使用分子免疫策略,已经有几个分析鞘内合成寡克隆扩大immunogloblins高亲和力识别特定抗原。库表达蛋白的筛选产品来源于慢性斑块女士信使RNA与抗体纯化从斑块,患者CSF或血清女士到目前为止并没有揭示了抗原抗体反应(女士的目标2]。

噬菌体展示的方法利用随机肽库展示在噬菌体表达大量的肽序列(10⁸或更多),模拟线性或构象折叠蛋白的抗原表位域,甚至碳水化合物结构(5- - - - - -7]。我们分析了绑定图案的免疫球蛋白g CSF火腿/ TSP病人使用噬菌体库方法(3]。结果,序列高度同源HTLV-I gp46是常见的高线性抗原表位affinity-IgG专门在脑脊液和血清中发现的病人。

一些实验室之前报道的选择从RPL几个肽结合抗体出现在高加索MS患者的脑脊液。但是,结果仍然是不一致的。兰特和他的同事报道,脑脊液免疫球蛋白抗体选择随机的肽的氨基酸序列主题RRPFF图书馆在五14美国女士RRPFF主题发现在患者EBV核抗原(8]。Cortese和他的同事们进行了类似的研究从意大利患者CSF女士使用噬菌体展示的方法。三个不同的候选人氨基酸图案选择从两例MS患者CSF测试,而他们公认的以同样的频率由女士和控制患者血清、脑脊液从55 MS患者中只有4对这三个主题之一。与另一个实验中,他们得出的结论是,CSF-enriched没有分享MS患者特异性抗体(9,10]。我们试图找到一个共同的主题12-mer肽库的一个更大的群体比先前的研究。

后确认噬菌体展示方法结合模因和爆炸搜索可以检测CSF的目标抗原免疫球蛋白g从火腿/ TSP的病人,我们调查了潜在目标抗原被高亲和免疫球蛋白g CSF女士使用噬菌体展示的方法。然而,我们不能检测肽序列或抗原所公认的专门从大多数医学患者脑脊液免疫球蛋白。

一个可能的原因,我们不能检测到一个表位是女士脑脊液免疫球蛋白可以识别构象表位或者非蛋白抗原。另一个可能的原因是,脑脊液免疫球蛋白g女士可能识别抗原表位亲和力较低,可能不存在居多而火腿脑脊液免疫球蛋白。在我们的研究中,从两个MS患者脑脊液免疫球蛋白台籍干部不能识别常见的肽图案。当探索脑脊液免疫球蛋白g抗原表位女士使用噬菌体展示的方法,它可能需要更大数量的噬菌体克隆和序列平移的数量增加。女士仍然很难得出结论脑脊液免疫球蛋白抗原不存在。然而,考虑到没有女士抗原决定迄今为止,脑脊液免疫球蛋白g女士可能不承认一个女士抗原,不同于火腿/ TSP承认HTLV-I脑脊液免疫球蛋白。也,常见的肽图案中发现和对照组没有显著不同的女士可能表明,脑脊液免疫球蛋白g女士可能意识到无处不在的抗原,也不同于火腿的情况下/ TSP脑脊液免疫球蛋白。

有趣的是,在病人MS6,相同肽图案同源EBV的组件从3 CSF反复检测样品。的E值的三肽图案从MS-6 EBV 0.008 - -0.32。在以前的研究中,E值的常见肽图案从火腿/ TSP脑脊液免疫球蛋白HTLV-I是0.15 - -0.95。肽图案是EBV特异性的象征。脑脊液免疫球蛋白g女士可能会识别抗原持续和抗原决定基蔓延可能不会发生在一些病人。

最近,麦尔和他的同事报道,炎症在中枢神经系统(CNS)提供了一个独特的,B-cell-friendly环境中,B细胞谱系,尤其是长寿的浆细胞,可存活多年。这些长寿的浆细胞可能产生寡克隆免疫球蛋白。CNS居民细胞(主要是星形胶质细胞和小胶质细胞)产生介质如趋化因子、细胞因子和粘附分子,促进当地的浆细胞的生存11]。是否来自这些长寿的浆细胞目标特定抗原的抗体或非特异性无处不在的抗原还有待确定。

脑脊液免疫球蛋白g女士被认为是寡克隆增加,以及唤起这种反应的因素可能不是一个罕见的女士抗原。其他具体的B细胞生存的因素可能引起这种反应。等因素,而不是一个罕见的抗原,在女士的发病机制可能是常见的进一步分析这些因素可能理解女士的发病机制的关键。

确认

作者感谢Masahiro山本博士和Naoki山本从东京医疗和牙科大学的技术援助。作者感谢布伦特贝尔先生的阅读。这项工作是支持的一般科学研究补助金(13470131和13470131)教育部、科学、文化、科技、神经免疫研究委员会的资助。