文摘
多发性硬化(MS)是一个进步的脱髓鞘的过程视为一种自身免疫性疾病,尽管这个病理的原因还没有完全建立。类似于其他神经退化,女士的特点是一系列的生物化学变化在不同程度上影响神经功能;的重视已氧化/ nitrosative压力和线粒体功能的变化。根据以前的数据,医学患者表现出明显的循环浓度的变化不同的代谢物,尽管还不清楚尿酸减少,增加,或没有改变这种病态条件下。在这项研究中,我们报告的血清代谢轮廓嘌呤、嘧啶、肌酸酐、丙二醛、抗坏血酸,亚硝酸盐,硝酸盐在一群170 MS患者。结果显示循环增加尿酸和其他oxypurines(次黄嘌呤和黄嘌呤),以及尿苷和β假尿苷。随之而来的循环肌酐增加,丙二醛,亚硝酸盐,硝酸盐,并减少在抗坏血酸,表明诱发女士改变能量代谢和氧化剂和抗氧化剂的平衡,可以监控MS患者的血清。
1。介绍
多发性硬化(MS)是一种进步,无效的病理状态,它的确切病因仍不确定(1]。它被认为是一种自身免疫性疾病的原因虽然自身免疫性demyelinization远清楚(2]。在分子水平上,特点是女士的一系列生物化学变化影响神经功能(3),其中一些与阿尔茨海默氏症等神经退化(4)和帕金森疾病(5]。特别是,这些共同的特征之一是神经失衡在氧化剂/抗氧化剂,与活性氧(ROS)和活性氮物种(RNS)多余的氧化剂(6,7和尿酸作为公认的有缺陷的抗氧化剂8- - - - - -11]。最近,线粒体故障表示中发挥核心作用的整体错乱脑代谢中观察到女士(12]。线粒体扰动的后果是至关重要的电子传递链的正确功能耦合的氧化磷酸化,因此,为维护细胞的能量体内平衡。此外,丰富的文学与线粒体功能障碍与ROS溢出(13]。如果能源生产和消费的不平衡是有效的,也就是说,细胞ATP生产的数量不满足能源需求,这是不可避免的嘌呤核苷酸降解通路被激活。这引起增加代核苷(腺苷、鸟苷、肌苷)和oxypurines(次黄嘌呤,黄嘌呤和尿酸),可以自由穿过细胞膜被释放在细胞外空间的一部分。在大脑组织,这一现象导致了这些化合物的显著增加脑脊液(CSF)下观察不同病理状态(14,15(女士),包括16]。
透水代谢物生成超过大脑新陈代谢的瞬态或慢性功能障碍迟早发现进入血液,可能导致各自的循环生理水平显著提高(17,18]。因此,一些低分子量的化合物可以很好的候选人为潜在的神经退化血液生物标志物。根据目前的知识,可以想见,化合物产生活性氧和RNS生产过剩所产生的代谢物改变能量代谢可能检测到超过在MS患者的血液样本,可能被有效预测疾病的演变。这个逻辑因果链接已被证明几个化合物与ROS和RNS生产过剩,这样循环增加一氧化氮(NO)的产品(19,20.)和脂质过氧化增加产品(21)在血浆/血清女士发现了病人。似乎令人惊讶的是,这并不适用于产品派生从能量代谢失衡的几项研究表明显著降低血浆/血清尿酸浓度(嘌呤核苷酸分解代谢的最终产物)的MS患者(22- - - - - -25]。而不可能解释的事实是,大脑尿酸,作为一个强有力的清道夫,氧化的结果增加了没有。最终结果会显著降低尿酸水平传播。与这些结果相反,大量的临床研究显示没有变化(26,27)或增加(28,29日]在MS患者血浆/血清尿酸,从而呈现不清楚这种化合物被修改在这个病理条件。最近,我们报道一个相伴的血浆和脑脊液浓度不仅增加尿酸还其他oxypurines和一群女士患者的核苷(16,30.]。
加强我们之前的结果,我们在这里报告嘌呤的代谢轮廓而言,嘧啶,肌酐,丙二醛(MDA)、抗坏血酸,亚硝酸盐,硝酸盐在一群170 MS患者决定。各种代谢物的浓度与记录在一组163名健康控制。为了有迹象表明潜在的临床效用MS患者,常规代谢分析的代谢物变化与疾病的严重程度的相关性分析和女士亚型。
2。材料和方法
2.1。选择和临床评估的病人
一百七十MS患者纳入本研究。他们评估的临床神经病学研究所的“亲自Gemelli“罗马天主教大学的使用扩展残疾状态量表评分(eds) [31日]。患者分为复发汇款(RR),次要进步(SP),或主进步(PP),根据描述的其他地方(32]。对照组由163名健康受试者,年龄和性别匹配,招募人员中两所大学进行年度健康体检。所有选定科目没有急性或慢性疾病。这项研究是由当地伦理委员会批准。书面知情同意。
2.2。血清代谢分析样品的准备
在病人和控制,外周静脉血样采集从肘前的静脉VACUETTE聚丙烯管含有血清分离器和血栓活化剂(Greiner-Bio一GmbH, Kremsmunster,奥地利)。40分钟后在室温下,样本在1890 g×10分钟离心分离血清。整除与doubly-distilled第一稀释水(1:2 v: v),然后由超滤除蛋白,根据过程详细描述其他地方(33]。脱去蛋白质的超滤液液是用来量化利益使用单一的代谢物,离子对,高效液相色谱(HPLC)分析允许同时权力平等主义的分离肌酸酐,嘌呤(hypoxantine、黄嘌呤、尿酸、肌苷、鸟苷),嘧啶(尿嘧啶,β假尿苷、胸腺嘧啶尿苷,胸苷,乳清酸)、抗坏血酸,MDA,亚硝酸盐,硝酸盐(33]。
脱去蛋白质样本加载(200μL)到一个海波西尔C-18 250×4.6毫米,5μ米颗粒大小列,提供自己的卫队列(意大利ThermoFisher Rodano,意大利米兰)。色谱柱是连接到一个高效液相色谱仪器组成的SpectraSystem P4000泵系统和高度敏感的UV6000LP二极管阵列检测器(意大利ThermoFisher Rodano,意大利米兰),配有5厘米光路流单元和设置在200至300纳米波长。数据采集和分析是由一个电脑使用ChromQuest软件包提供的高效液相色谱制造商。分配和计算感兴趣的化合物在色谱运行的生物流体提取物进行了206(亚硝酸盐和硝酸盐),234(肌酐),或260(嘌呤、嘧啶、抗坏血酸,MDA)纳米波长通过比较保留时间,吸收光谱,和地区峰与峰的色谱运行刚做好的超纯已知浓度的标准混合物。
2.3。统计分析
所有的变量都是倾斜的,因此之前对数转换接近高斯分布参数测试中的应用。之间的差异控制和患者评估学生的女士以及未配对的观察。由于不同数量的对象,不同子组的患者在eds或临床亚型女士(RR, SP,页)评估由克鲁斯卡尔-沃利斯单向方差分析。的值被认为是显著的。
3所示。结果
的特点,医学患者和对照组都总结在表1。临床分类表明,66.5%的患者RR, 25.3%是SP, 8.2%只是页。
3.1。医学患者的血清代谢轮廓:嘌呤、嘧啶、肌酐
数据指的是循环水平的不同代谢物在控制和评价医学患者被发表在表2。对值控制,高效液相色谱法分析血清oxypurines证明2.94±1.14倍增加(平均值±标准偏差),次黄嘌呤的价值(),2.80±1.53倍增加的值(平均值±标准偏差)的黄嘌呤()和1.16±0.27倍增加的值(平均值±标准偏差)尿酸()。当考虑循环的总和oxypurines MS患者(316.20±72.21μmol / L血清;平均值±标准偏差),1.21±0.28倍增加(平均值±标准偏差)对控制(261.16±48.89μmol / L血清;平均值±标准偏差;)被观察到。这些值的散点图,图中所示1(一);在同一图中,控制和MS患者的血清肌酐水平也报道(图1 (b))。类似于观察oxypurines,循环MS患者的肌酐值(71.10±19.27μmol / L血清;均值±标准差)为1.25±0.34倍(均值±标准差)比记录在控制(56.87±17.98μmol / L血清;平均值±标准偏差;)。当患者女士划分的基础上,残疾,没有人上述代谢物与eds增加。不同,分类的病人分为三个子组的基础上女士亚型(图2)表明,RR患者明显不同的肌酐值,尿酸,笔oxypurines SP(相比)和PP患者()。
(一)
(b)
嘧啶化合物中,尿嘧啶,β假尿苷、尿苷总是在所有血清样本检测使用高效液相色谱分析方法。尿嘧啶的血清浓度控制(1.97±0.90μmol / L血清;均值±标准差)没有不同于以MS患者(2.11±1.04μmol / L血清;均值±标准差)。反之亦然,图3说明循环尿苷(a)和β假尿苷(b)在医学患者明显不同(7.20±1.81,4.67±1.71μmol / L血清,分别地;意味着±标准差)和控制(4.83±2.19,3.03±1.23μmol / L血清,分别地;意味着±标准差)。尿苷和β假不与增加eds,也没有他们表现出显著差异在子组的患者分为亚型女士。
(一)
(b)
3.2。医学患者的血清代谢轮廓:氧化剂和抗氧化剂
图4报告的循环MDA浓度(a),作为脂质过氧化的索引,以及亚硝酸盐+硝酸盐(b),一氧化氮生成的分解,在控制和MS患者。在MS患者的血清MDA (0.84±0.53μmol / L血清;均值±标准差)显示一个巨大的210±132倍增加(均值±标准差)相比,血清的浓度测量控制(0.004±0.003μmol / L血清;均值±标准差)。MS患者的血清亚硝酸盐+硝酸(均值±标准差= 107.94±43.87μmol / L血清)是1.56±0.63倍(均值±标准差)高于的流通价值这两个氮阴离子以控制(69.05±29.04μmol / L血清;均值±标准差)。
(一)
(b)
数据在图5表明,医学患者的血清浓度的抗坏血酸(37.36±10.95μmol / L血清;均值±标准差)低1.54±0.45倍(均值±标准差)比记录在控制(57.52±14.81μmol / L血清;平均值±标准偏差),从而表明减少在这个循环增加的氧化/抗氧化结果nitrosative应力发生在女士值得回顾的是,MDA,亚硝酸盐+硝酸和抗坏血酸没有与增加eds,也没有他们表现出显著差异的子组病人分为亚型女士。
4所示。讨论
数据在本研究报告证实我们之前发现了一个更小的组患者[女士16,30.],表示循环的改变化合物与能量代谢有关,氧化/ nitrosative应力和抗氧化状态发生在多发性硬化症。
大多数的研究表明,循环的尿酸浓度,新陈代谢来源于分解代谢的磷酸化嘌呤(ATP和三磷酸鸟苷)和核酸降解,减少病人[女士22- - - - - -25]。然而,一个有意义的文学对比这些证据,表明MS患者血浆/血清尿酸水平相当或高于记录在控制(26- - - - - -29日]。在目前的170 MS患者,确认我们的以前的观测(16,30.),我们再次发现血清中尿酸浓度高于那些记录在163岁——准确性健康对照组(表2)。血清尿酸的增加伴随着几乎三倍提高两次黄嘌呤和黄嘌呤,因此呈现更加突出整体净增长循环oxypurines女士(图1(一))。此外,尽管上述参数与eds、尿酸或oxypurines之和与女士的临床亚型,与RR小组展示低价值比SP和PP子组(图2)。
三个oxypurines认为主要是产生级联的嘌呤核苷酸退化,当能量代谢不满足细胞/组织ATP需求34,35]。因此,可想而知肯定,医学患者可能遭受能源生产和消费之间的不平衡。由于机械,确保足够的线粒体ATP生产本地化,最近的数据显示神经元线粒体故障(女士12)证实的假设循环oxypurines增加病人的直接后果是改变线粒体的功能。当然,我们的研究结果并不支持这一概念持续通过各种研究女士确认病人血浆/血清尿酸低于对照组(22- - - - - -25]。特别是,因为医学患者患有增加氧化/ nitrosative压力(6,7),有人建议,减少循环尿酸的女士是由于尿酸的清除活动转向过氧亚硝基9]。结果一起的全部档案血清嘌呤化合物,我们的数据证明循环抗氧化防御下降的MS患者,用抗坏血酸和尿酸不减少(图5)。亲水低分子量抗氧化剂抗坏血酸,不是由人体合成和适量,因此,假定的饮食让血流的合理分布的不同组织。大脑有一个特定的转运体的抗坏血酸用于允许这种化合物可以穿过血脑屏障,并积累在大脑细胞,对抗一个浓度梯度36,37]。通过促进传输机制,脑抗坏血酸的浓度大约2300 nmoL / g湿重(对应2500左右μmol / L的大脑水),是第二个最丰富的水溶性,大脑抗氧化38,39]。抗坏血酸具有相同的亲和力比尿酸(过氧亚硝基9),但在大脑中大约1000倍集中尿酸(16,40]。即使大脑尿酸作为一种抗氧化剂,似乎明显,对于增加大脑抗坏血酸的氧化/ nitrosative压力降低而不是在尿酸肯定会发生。脑尿酸会氧化只有当浓度比抗坏血酸和尿酸在大脑中是尿酸的赞成。根据目前的结果,我们的女士的病人,由于增加了氧化/ nitrosative压力(图4),显示循环抗坏血酸下降了35%。这样的下降可能会呈现低效率的机制大脑积累减少,反过来,大脑抗氧化能力。如果降低血清中抗坏血酸假设反映了等于减少脑组织,脑抗坏血酸将1400 - 1500 nmoL / g湿重,也就是说,仍然700倍的大脑尿酸(16,40]。因此,看来,即便是在氧化/ nitrosative压力增加,条件没有生化假定维持脑组织尿酸的作用作为一个有效的抗氧化剂,也想象女士可能激起其降低血清。
能量代谢受损的证据在我们的医学患者也支持数据指的是循环尿苷,这是1.5倍的价值控制(图中找到3(一个))。根据以前的观测41),等离子体的增加尿苷可以被看作是一个组织能源危机的间接指标。事实上,在人类代谢能量不平衡的条件下,它显然已被证实心肌ATP疲劳之间的密切联系和增加在循环嘌呤(次黄嘌呤,黄嘌呤,尿酸),或者在循环尿苷(42]。这加强了等离子体的概念,变化尿苷反映细胞/组织能量代谢的变化。总体的结论,在分析嘌呤和嘧啶循环的结果,确实是MS患者会从能源赤字,可能由于改变线粒体功能(12,43,44]。由于医学患者大量并发全身炎症的风险检测不到发炎或迹象条件(45,46),不能排除显著extracerebral贡献这些代谢物的整体增加血清。此外,肌肉参与[女士47,48),可能引起细胞代谢不平衡,就是最近还走在轻度残疾患者的成本增加(49),可能会进一步导致加剧这些患者的血清代谢轮廓的改变。数据表明MS患者的血清肌酐高于控制(图1 (b))大力加强这个概念。
在我们的医学患者,血清的显著增加β假尿苷也观察到。因为这个修改嘧啶是只发现在转移和核糖体rna,它增加体液通常被认为是作为一个指数的rna流动率增加,由于增加蛋白质合成率(50]。因为在实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)蛋白质合成已被证明在基准面(增加4倍51),这可能是假设这种现象负责增加血清βMS患者的假尿苷。
在这项研究中,最具戏剧性的变化与发生女士血清MDA(图4(一))。这种化合物,来自peroxidized多不饱和脂肪酸的分解不可逆膜磷脂,被认为是一个可靠的指标,增加氧化应激(52,53),如果适当的化验。在MS患者中,210倍增长MDA值记录在控制是明确的证据表明,活性氧species-mediated脂质过氧化是手术病理条件下。因为我们还发现显著增加亚硝酸盐+硝酸盐在MS患者的血清(图4 (b)),我们可以得出结论,这些患者暴露于随之而来的氧化/ nitrosative压力,说明这两个氮阴离子的和被认为是一个索引的一代(54,55]。这意味着风险升高的高度氧化激进过氧亚硝基ONOO。对大脑组织完整性造成严重的后果。
本研究的主要局限是血清代谢物的变化未能与eds,可能因为低几个病人的子组。甚至一些代谢物的差异记录当病人被分成三个临床亚型女士未能区分SP的PP,最有可能因为PP患者的数量有限。招聘更多的医学患者正在进行中。
5。结论
总之,我们的结果在女士血清代谢轮廓清晰的表明这些病人遭受深刻的嘌呤和嘧啶dysmetabolism,可能由于改变线粒体的功能。这将导致循环尿酸的增加,次黄嘌呤,黄嘌呤,肌酐,β假尿苷、尿苷与肌酐、尿酸,笔oxypurines被相关的临床亚型女士。伴随氧化/ nitrosative压力的明显证据表明可能的治疗方法旨在提高脑线粒体功能和神经能量状态,以及增加大脑抗氧化防御系统,可以改善医学患者的状态。
承认
这项工作已经被研究资金支持部分大学的卡塔尼亚和罗马天主教大学(D1-2008/2009格兰特)。